Name: evaluating the angiogenetic properties of ovarian cancer stem-like cells using the three-dimensional co-culture system, nico-1
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique C (subvention n ° 19K09834 à K.N.) du ministère de l’Éducation, de la Science et de la Culture du Japon.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au protocole approuvé par le Comité d’éthique pour le bien-être humain. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé écrit pour l’utilisation de leurs échantillons à des fins de recherche, et la collecte et l’utilisation de tissus pour cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche sur le génome humain de l’Université Teikyo.
1. Isolement et culture de cellules souches du cance...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Lytle, N. K., Barber, A. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li><li>Zong, X., Nephew, K. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1.">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li><li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation.">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li><li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell/mesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis.">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li><li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration,+proliferation,+and+collagen+gene+expression.">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society &amp; Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li><li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer.">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li><li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+targets+the+tumour+cell.">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A:+a+reassessment.">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li></ol>

Le protocole présenté décrit comment imiter le microenvironnement tumoral des OCSC dans un contexte in vitro. La composante principale de la méthode constitue le modèle de coculture hautement reproductible obtenu à l’aide du système NICO-1, un système de co-culture indirect Transwell. Bon nombre des modèles de coculture actuellement disponibles examinent les effets du contact direct cellule-cellule sur les populations cellulaires en coculture 12,13,14,15,16,17,18.<sup class="...

Le cancer de l’ovaire est la huitième tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes dans le monde, avec environ 300 000 nouveaux diagnostics et environ 180 000 décès par an1. Au diagnostic initial, le cancer de l’ovaire présente souvent des symptômes graves, environ 75% des patientes étant déjà au stade III-IV. En conséquence, le taux de survie à 5 ans est de <30% et le taux de mortalité est le plus élevé parmi les cancers gynécologiques2, l’efficacité du traitement du cancer de l’ovaire étant fortement dépendante de facteurs cliniques tels que la réussite de la chirurgie de réduction tumorale, la résistance à la chimiothérapie et la récidive après le traitement initial.
Les tissus cancéreux de l’ovaire sont organisés hiérarchiquement, tous les composants tumoraux n’étant pas également capables de générer des descendants. Les seules cellules capables de s’auto-renouveler et de produire une population hétérogène de cellules tumorales sont considérées comme représentant des cellules souches cancéreuses (CSC)3. L’auto-renouvellement du SCC et l’initiation de la tumeur s’accompagnent de la promotion de l’angiogenèse pour remodeler leur microenvironnement tumoral dans le but de maintenir un créneau de soutien. Cependant, les modèles précédents ne pouvaient pas être utilisés pour les analyses in vitro en raison de la reproductibilité limitée de la culture de CSC dérivés d’échantillons cliniques en raison de la perturbation des sphéroïdes après plusieurs passages. Plus récemment, des méthodes expérimentales de culture de CSC à partir de patients ont été développées pour plusieurs applications 4,5,6,7. En particulier, en exploitant la caractéristique des CSC de croître en formant des sphéroïdes dans des plaques de fixation ultra-basses avec un milieu sans sérum, les CSC cultivés sont amenés à exprimer un marqueur de surface des cellules souches qui n’est pas exprimé dans les cellules tumorales normales avec un potentiel de différenciation multilignée 8,9.
Des données récentes ont montré que la persistance des (O)CSC ovariens dormants visualisés comme une dissémination au péritoine est associée à leur régénération sous forme de tumeurs récurrentes10. La compréhension des caractéristiques moléculaires et biologiques des OCSC peut donc permettre un ciblage et une éradication efficaces de ces cellules, entraînant une rémission potentielle de la tumeur. En particulier, on sait peu de choses sur les caractéristiques mécanistes cellulaires et moléculaires des rôles des CSC dans l’angiogenèse11. Par conséquent, dans le présent protocole, nous avons utilisé des OCSC dérivés de patients dans un cadre in vitro pour étudier la propriété angiogénique des cellules endothéliales en utilisant le modèle de co-culture, qui peut imiter le microenvironnement tumoral des CSC et des cellules endothéliales au site métastatique en milieu clinique. En fin de compte, comme la néovascularisation constitue un processus critique nécessaire pour soutenir la croissance tumorale et les métastases, une meilleure compréhension de son mécanisme permettra le développement d’une nouvelle thérapie de ciblage pour les OCSC au site métastatique.
Ici, nous présentons un protocole pour visualiser l’étape de néovascularisation entourant les CSC de manière chronologique. L’avantage du protocole est de permettre des investigations entièrement reproductibles à l’aide du système de co-culture 3D, NICO-1, permettant ainsi d’observer les effets sur les patients de la capacité d’initiation tumorale dérivée de l’OCSC au cours de l’angiogenèse des cellules endothéliales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>170356N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Pipet tip</td>
			<td>QSP</td>
			<td>T112XLRS-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Pipet tip</td>
			<td>QSP</td>
			<td>T110RS-NEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>170366N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuMAX</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoatTM Collagen I 60mm Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUEhT-1 cell</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB1458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICCP Filter 0.6 &#181;m</td>
			<td>Ginrei Lab.</td>
			<td>2525-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, human</td>
			<td>SIGMA (Roche)</td>
			<td>11376497001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>ARVO MX-flad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CQ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NICO-1</td>
			<td>Ginrei Lab.</td>
			<td>2501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC SFM</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>A1000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>357575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>253-00513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the angiogenetic properties of ovarian cancer stem-like cells using the three-dimensional co-culture system, nico-1

Les cellules souches cancéreuses (CSC) résident dans une niche de soutien, constituant un microenvironnement composé de cellules stromales adjacentes, de vaisseaux et de matrice extracellulaire. La capacité des CSC à participer au développement de l’endothélium constitue une caractéristique importante qui contribue directement à la compréhension générale des mécanismes de tumorigenèse et de métastases tumorales. Le but de ce travail est d’établir une méthodologie reproductible pour étudier la capacité d’initiation tumorale des cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC). Ici, nous avons examiné le mécanisme de néovascularisation entre les cellules endothéliales et les OCSC ainsi que les changements morphologiques des cellules endothéliales en utilisant le modèle de co-culture in vitro NICO-1. Ce protocole permet de visualiser l’étape de néovascularisation entourant les OCSC de manière chronologique. La technique peut fournir un aperçu des propriétés angiogénétiques des OCSC dans les métastases tumorales.

Nous avons recueilli des liquides d’ascite obtenus auprès de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire avancé lors d’une intervention chirurgicale ou d’une paracentèse dans le but d’effectuer une culture stable à long terme pour les sphéroïdes. Ici, nous présentons des cas d’une culture sphéroïde à long terme de CSC ovariens appelés CSC1 et CSC2. Les deux lignées cellulaires portent le même diagnostic et les mêmes profils histologiques. Les rôles mécanistes...

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Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Les cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC) sont responsables de l’initiation du cancer, de la récidive, de la résistance thérapeutique et des métastases. La niche vasculaire OCSC est considérée comme favorisant l’auto-renouvellement des OCSC, conduisant à la chimiorésistance. Ce protocole fournit la base pour établir un modèle reproductible de niche vasculaire OCSC in vitro.

Évaluation des propriétés angiogénétiques des cellules souches du cancer de l’ovaire à l’aide du système de co-culture tridimensionnel, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

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