Name: evaluating the angiogenetic properties of ovarian cancer stem-like cells using the three-dimensional co-culture system, nico-1
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research C (Grant no. 19K09834 to K.N.) des japanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Kultur unterstützt.

Alle Verfahren wurden gemäß dem Protokoll durchgeführt, das von der Ethikkommission für das Wohlergehen der Menschen genehmigt wurde. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihrer Proben in der Forschung, und die Entnahme und Verwendung von Geweben für diese Studie wurde vom Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee der Teikyo University genehmigt.
1. Isolierung und Kultur von Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSCs) von Patientinnen mit Ei...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Lytle, N. K., Barber, A. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li><li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+stem+cells:+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting.">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).</li><li>Liz&#225;rraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers.">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li><li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1.">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li><li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation.">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li><li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell/mesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis.">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li><li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration,+proliferation,+and+collagen+gene+expression.">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+and+technologies:+taking+synthetic+biology+to+the+next+level.">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society &amp; Interface. 11 (96), 20140065 (2014).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li><li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer.">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li><li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+targets+the+tumour+cell.">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A:+a+reassessment.">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die Tumormikroumgebung von OCSCs in einer In-vitro-Umgebung nachgeahmt werden kann. Die Hauptkomponente der Methode bildet das hochreproduzierbare Kokulturmodell, das mit dem NICO-1-System, einem indirekten Transwell-Kokultursystem, erhalten wurde. Viele der derzeit verfügbaren Kokulturmodelle untersuchen die Auswirkungen eines direkten Zell-Zell-Kontakts auf kokultivierte Zellpopulationen 12,13,14,15,16,17,18.</su...

Eierstockkrebs ist die achthäufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit, mit etwa 300.000 neuen Diagnosen und geschätzten 180.000 Todesfällen proJahr1. Bei der Erstdiagnose zeigt sich Eierstockkrebs oft mit schweren Symptomen, wobei sich etwa 75% der Patientinnen bereits im Stadium III-IV befinden. Dementsprechend beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate <30% und die Sterblichkeitsrate ist die höchste bei gynäkologischen Krebserkrankungen2, wobei die Effizienz der Behandlung von Eierstockkrebs stark von klinischen Faktoren wie der erfolgreichen Durchführung einer Debulking-Operation, der Resistenz gegen Chemotherapie und dem Wiederauftreten nach der Ersttherapie abhängt.
Eierstockkrebsgewebe sind hierarchisch organisiert, wobei nicht alle Tumorkomponenten gleichermaßen in der Lage sind, Nachkommen zu erzeugen. Die einzigen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und eine heterogene Tumorzellpopulation zu produzieren, gelten als Krebsstammzellen (CSCs)3. Die Selbsterneuerung des CSC und die Tumorinitiierung werden von der Förderung der Angiogenese begleitet, um ihre Tumormikroumgebung umzugestalten, um eine unterstützende Nische zu erhalten. Bisherige Modelle konnten jedoch nicht für In-vitro-Analysen verwendet werden, da die Kultivierung von CSCs aus klinischen Proben aufgrund der Störung von Sphäroiden nach mehrfachem Durchgang nur begrenzt reproduzierbar ist. In jüngerer Zeit wurden experimentelle Methoden zur Kultivierung von CSCs von Patienten für mehrere Anwendungen entwickelt 4,5,6,7. Insbesondere durch die Ausnutzung der Eigenschaft von CSCs, durch Bildung von Sphäroiden in ultraniedrigen Bindungsplatten mit serumfreiem Medium zu wachsen, werden die kultivierten CSCs dazu gebracht, einen Stammzelloberflächenmarker zu exprimieren, der in normalen Tumorzellen mit Multilineage-Differenzierungspotential nicht exprimiert wird 8,9.
Neuere Daten haben gezeigt, dass die Persistenz ruhender ovarieller (O)CSCs, visualisiert als Verbreitung am Peritoneum, mit ihrer Regeneration als rezidivierende Tumoren assoziiert ist10. Das Verständnis der molekularen und biologischen Merkmale von OCSCs kann daher eine effektive Ausrichtung und Eradikation dieser Zellen ermöglichen, was zu einer möglichen Tumorremission führt. Insbesondere ist wenig über die zellulären und molekular-mechanistischen Merkmale der CSC-Rollen in der Angiogenesebekannt 11. Daher haben wir im vorliegenden Protokoll patientenabgeleitete OCSCs in einer In-vitro-Umgebung verwendet, um die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen unter Verwendung des Kokulturmodells zu untersuchen, das die Tumormikroumgebung von CSCs und Endothelzellen an der metastatischen Stelle im klinischen Umfeld nachahmen kann. Da die Neovaskularisation einen kritischen Prozess darstellt, der zur Unterstützung des Tumorwachstums und der Metastasierung notwendig ist, wird ein besseres Verständnis ihres Mechanismus die Entwicklung einer neuartigen zielgerichteten Therapie für OCSCs an der metastatischen Stelle ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Neovaskularisationsschritt um die CSCs zeitlich zu visualisieren. Der Vorteil des Protokolls besteht darin, vollständig reproduzierbare Untersuchungen mit dem 3D-Kokultursystem NICO-1 zu ermöglichen, wodurch die Auswirkungen der OCSC-abgeleiteten Tumorinitiierungsfähigkeit während der Endothelzellangiogenese auf Patienten beobachtet werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>170356N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Pipet tip</td>
			<td>QSP</td>
			<td>T112XLRS-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Pipet tip</td>
			<td>QSP</td>
			<td>T110RS-NEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>170366N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuMAX</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioCoatTM Collagen I 60mm Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUEhT-1 cell</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB1458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICCP Filter 0.6 &#181;m</td>
			<td>Ginrei Lab.</td>
			<td>2525-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, human</td>
			<td>SIGMA (Roche)</td>
			<td>11376497001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>ARVO MX-flad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CQ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NICO-1</td>
			<td>Ginrei Lab.</td>
			<td>2501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC SFM</td>
			<td>Thermo (Gibco)</td>
			<td>A1000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>357575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>253-00513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the angiogenetic properties of ovarian cancer stem-like cells using the three-dimensional co-culture system, nico-1

Krebsstammzellen (CSCs) befinden sich in einer unterstützenden Nische und bilden eine Mikroumgebung, die aus benachbarten Stromazellen, Gefäßen und extrazellulärer Matrix besteht. Die Fähigkeit von CSCs, an der Entwicklung von Endothel teilzunehmen, stellt ein wichtiges Merkmal dar, das direkt zum allgemeinen Verständnis der Mechanismen der Tumorgenese und Tumormetastasierung beiträgt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methodik zu etablieren, um die Tumorinitiationsfähigkeit von Eierstockkrebsstammzellen (OCSCs) zu untersuchen. Hier untersuchten wir den Neovaskularisationsmechanismus zwischen Endothelzellen und OCSCs sowie die morphologischen Veränderungen von Endothelzellen mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung des Neovaskularisationsschritts, der die OCSCs umgibt. Die Technik kann Aufschluss über die angiogenetischen Eigenschaften von OCSCs bei Tumormetastasen geben.

Wir sammelten Aszitesflüssigkeiten, die von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs während einer Operation oder Parazentese gewonnen wurden, um eine langzeitstabile Kultur für Sphäroide durchzuführen. Hier stellen wir Fälle einer langfristigen Sphäroidkultur von ovariellen CSCs vor, die als CSC1 und CSC2 bezeichnet werden. Beide Zelllinien tragen die gleichen diagnostischen und histologischen Profile. Die mechanistische Rolle von OCSCs, die der Interaktion mit Endothelzelle...

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Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Forschung

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...