Name: horizontal hippocampal slices of the mouse brain
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain at JoVE.com

Vi takker elektrofysiologienheten til VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research under tilsyn av Dr. Keimpe Wierda og prof. Dr. Joris De Wit for bruk av deres forskningsfasiliteter. Videre takker vi alle medlemmene av Laboratoriet for Ion Channel Research og Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine ved KU Leuven for deres nyttige diskusjoner og kommentarer.
Dette prosjektet har mottatt støtte fra Research Foundation-Flanders (G.084515N og G.0B1819N til J.V.) og Forskningsrådet i KU Leuven (C1-finansiering C14/18/106 til J.V.). K.P. er en FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow og fikk støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale (665501) med Research Foundation Flanders (FWO) (12T0317N). K.H. er postdoktor ved Forskningsstiftelsen Flandern i Belgia (12U7918N).

Alle dyreforsøk for denne studien ble godkjent av den etiske gjennomgangskomiteen i KU Leuven (Belgia) (P021/2012).
1. Fremstilling av høysukrose skive løsning og kunstig cerebrospinalvæske (ACSF)
<ol><li>Før eksperimentell dag<ol>
<li>Forbered 1 l 10x skive pre-løsning med laboratoriegrad Type 1 vann som inneholder (i mM): 25 KCl, 20 CaCl2,10 MgSO4,12,5 KH2PO4 (Tabell 1). For å forhindre kalsiumfosfatnedbør, bland sakte kjemikaliene i et beger som er ferdigfylt med 800 ml H2O mens du stadig rører med en magnetisk rører. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C eller romtemperatur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>På den eksperimentelle dagen<ol>
<li>Forbered 1 L 1 l 1x ACSF med laboratoriegrad Type 1 vann som inneholder (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2,1 MgSO4,1,25 NaH2PO4,26 NaHCO3,25 Glukose (tabell 2). Bruk et damptrykk osmometer for å validere osmolariteten mellom 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6). MERK: For å forhindre kalsiumfosfatnedbør, bland langsomt alle faste kjemikalier i et beger som er ferdigfylt med 800 ml H2O mens du stadig rører med en magnetisk rører. Tilsett MgSO4 og CaCl2 helt på slutten, sakte dryppende i den nødvendige mengden fra 1 M lagerløsninger.</li>
		<li>Kontinuerlig boble 1x ACSF løsning ved RT med karbaogen for å sette pH mellom 7.3-7.4. MERK: Hvis pH-en er litt for høy eller for lav, vil små justeringer i karbaogeniseringsstyrken være tilstrekkelig. Hvis pH er høyere enn 7,45 med karbagenering, juster den ved å legge til noen dråper 1 M NaH2PO4-løsning.</li>
		<li>Forbered 250 ml (per hjerne) av 1x høysukrose skive løsning i et beger som inneholder 25 ml 10x skive pre-løsning og (i mM): 252 Sukrose, 26 NaHCO3, og 10 Glukose (tabell 3). Kontroller at osmolariteten er mellom 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).</li>
		<li>Boble den høye sukrose skive oppløsningen i 10-15 min med karbagen for å kontrollere pH mellom 7,3-7,4. MERK: Hvis pH-en er høyere enn 7,45 med karbagenering, justerer du den ved å legge til noen dråper 1 M KH2PO4-løsning.</li>
		<li>Oppbevar oppløsningen med høy sukroseskive i 20–30 min i ultrafryseren (-80 °C) til den er delvis frosset.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Utarbeidelse av arbeidsområdet for hjernens disseksjon
<ol><li>Under nedkjøling av den høye sukrose skiveløsningen, klargjør følgende.<ol>
<li>Varm opp vannbadet til 32 °C.</li>
		<li>Fyll oppkrevingskammeret (figur 2A) med den karbagenerte ACSF-løsningen og plasser kammeret i vannbadet. Bruk kontinuerlig karbagen på hoved ACSF-flasken og ACSF i gjenopprettingskammeret.</li>
		<li>Før dyret til det eksperimentelle rommet. MERK: Dyrets alder, kjønn og belastning må bestemmes av den enkelte eksperimenterer og er avhengig av det spesifikke studiespørsmålet. Imidlertid bør dyrets parametere holde seg konstante i en studie for å garantere sammenlignbarhet mellom de forskjellige eksperimentelle dagene. Denne protokollen ble designet for bruk av C57BL/6J hannmus i en alder av 2–6 uker. Hvis eldre dyr skal brukes, kan det hende at skive- og restitusjonsløsninger må tilpassestilsvarende 4,27 (f.eks. NMDG+-baserteløsninger 23,28) for å bevare hjernens helse til de akutte skivene.</li>
		<li>Forbered anestesikammeret.</li>
		<li>Legg ut silkepapir, plast Pasteur pipette med bred åpning (kuttet åpen), 90 mm kulturrett fylt med is, en firkant av filterpapir på toppen av den kjølte kulturfatet, sterk saks for halshugging, disseksjonsaks, buede tang, slikkepott, 35 mm kulturrett, fin børste, blad, prøveplate (leveres med vibratom), superlim, pipettespiss, fire stropper filterpapir (~ 2 cm x 0,5 cm) (figur 2A).</li>
		<li>Sett opp vibratomen: Programmer først vibratomen for de riktige innstillingene (bladhastighet: 0,08 mm/s, skjære amplitude: 1,4 mm, klippefrekvens: 85 Hz) og fest karbagenlinjen i skivekammeret. Deretter plasserer du skivekammeret i holderen, fyller holderen rundt skivekammeret med is og fester alt til vibratomen. Til slutt plasserer du barberbladet i vibratombladholderen (figur 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter frysing av høysukroseløsningen utfører du følgende trinn.<ol>
<li>Etter 20–30 min tar du høysukneskiven ut av -80 °C ultrafryseren og holder begeret på is.</li>
		<li>Plasser den høysukneløsningen ved siden av vibratomen på benken, knus og bland den delvis frosne løsningen med en slikkepott for å få en fin slaps og begynn å boble med karbagen.</li>
		<li>Ta opp noen høy-sukrose skive løsning med plast Pasteur pipette å suge kvadrert filterpapir på toppen av den avkjølte 90 mm kulturfat.</li>
		<li>Fyll 35 mm kulturfat (eller tilsvarende liten beholder som er egnet til å lagre hele hjernen) opptil 75% med høysukroseskiveløsningen (tilstrekkelig til å dekke hele hjernen) og kjøle kulturfatet på isen som holdes ved siden av begeret med resten av løsningen. Karbagenat løsningen i 35 mm kulturfat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Disseksjon og posisjonering av murine hjernen
<ol><li>Bedøve dyret med 5% isofluran. Bestem riktig dybde av anestesi ved å klemme poten. Ingen poteuttaksrefleks bør forekomme.</li>
	<li>Overfør dyret på silkepapir og halshugge det med sterk saks eller en liten dyrelomjotin.</li>
	<li>Bruk disseksjon saks for å kutte åpne hodebunnen.</li>
	<li>Klipp opp calvaria langs sagittalsuturen og fjern den ved hjelp av buede tang til hele hjernen, inkludert olfaktoriske pærer, er synlig. MERK: Vær forsiktig så du ikke skader hjernen med de skarpe kantene på calvaria eller tang.</li>
	<li>Bruk en slikkepott til å forsiktig øse ut hjernen (olfaktoriske pærer bør holde seg festet).</li>
	<li>Overfør hjernen i den avkjølte 35 mm kulturfatet og fjern alt hår eller blodpartikler fra vevet ved å vaske hjernen forsiktig med en ACSF-fylt Pasteurpipette (blod har cytotoksiske effekter på hjernevev29).</li>
	<li>Overfør hjernen ved hjelp av slikkepotten på det gjennomvåte filterpapiret på toppen av den avkjølte 90 mm kulturfatet (figur 2A).</li>
	<li>Bruk et blad til å kutte hjernen i to, skille de to halvkulene, og plasser begge halvkuler på den nykuttede mediale siden.</li>
	<li>Bruk et blad til å fjerne dorsaldelen (5 %–10 %) hjernen fra hver halvkule med et parallelt kutt til den dorsale toppen (Figur 2C)30 og plasser begge halvkulene på den nykuttede siden med ventraldelen av hjernen vendt oppover.</li>
	<li>Plasser en dråpe superlim på prøveplaten og spred ut riktig med en pipettespiss for å imøtekomme begge halvkulene.</li>
	<li>Bruk en filterpapirstropp til å plukke opp en halvkule med kapillære krefter ved å berøre ventral side med filterpapirstroppen, og dermed ikke skade vevet.</li>
	<li>Bruk en annen filterpapirstropp til å forsiktig halvtørke den dorsale siden av hjernen før du plasserer halvkule med dorsalsiden ned på toppen av limet på prøveplaten. Gjenta samme prosedyre med den andre halvkule. MERK: Halvkulene skal plasseres i horisontal justering på en speilet måte på vibratomplaten, med rostralsidene pekende mot utsiden og de kaudale sidene vendt (men ikke berøre) hverandre i midten. De mediale sidene av begge halvkuler skal peke mot vibratombladet og sidesidene mot eksperimentereren (figur 2D).</li>
	<li>Plasser prøveplaten i skjærekammeret og dekk den forsiktig med iskald høysukneskiveoppløsning slush. Så snart løsningen berører limet, vil det stivne og lime halvkulene til prøveplaten.</li>
	<li>Forsikre deg om at halvkulene er riktig dekket med høy-sukrose skive løsning og bekrefter at løsningen er bobler med karbaogen. MERK: Hele disseksjonsprosedyren skal utføres så fort som mulig. Vennligst sørg for at hjernen ikke forblir uten tilførsel av oksygen i svært lang tid. Det bør ta bare rundt 1-1,5 min fra halshugging til hjernenedsenking i høysukne skiveløsningen slaps. Dette er det mest kritiske kravet til akutte hjerneskiver for å garantere høy kvalitet på skiven.</li>
</ol>4. Horisontal kutting av hjernen
<ol><li>Plasser vibratombladet foran den mediale siden av halvkulene og senk det til samme høyde som ventrale sider av halvkulene som nå vender oppover. Senk bladet ved hjelp av vibratomkontrollen til 600 μm lenger i ryggretningen og begynn å kutte. Bladet skal treffe vevet (hvis ikke, reversere bladet og senke det litt mer). Skjær til de to første skivene er helt atskilt fra de to halvkulene.</li>
	<li>Snu bladet og senk ytterligere 300 μm og skjær igjen.</li>
	<li>Når hippocampus blir synlig (bruk musen31 hjerneatlas for hjelp, om nødvendig) (Figur 2E) samle skiver med utvidet plast Pasteur pipette. Samle skiver til caudate putamen blir synlig ved siden av hippocampus. Vanligvis kan mellom 8–12 skiver på 300 μm (4–6 per halvkule) samles inn for musehjernen.</li>
	<li>Bruk den plast pasteur pipette for å samle skiver og overføre dem til utvinning kammeret i vannbadet (Figur 2F) (samle skiver etter hver runde med kutting for å hindre dem fra å flyte rundt i skivekammeret). MERK: Arbeid så fort som mulig og sørg for at den høysukne skiveoppløsningen er iskald og karbagenert under hele prosedyren. Fyll om nødvendig isen rundt skivekammeret.</li>
</ol>5. Gjenoppretting av hjerneskiver for elektrofysiologiske opptak
<ol><li>La skivene stå i det ACSF-fylte oppgjenvinningskammeret i det 32 °C vannbadet i 1 time. MERK: Restitusjonskamre er også kommersielt tilgjengelige.</li>
	<li>Ta oppkrevingskammeret ut av vannbadet.</li>
	<li>Plasser skivene ved RT i minst 30 minutter til for gjenoppretting før du starter videre påføring.</li>
</ol>6. fEPSP-opptak i den mediale perforante banen (MPP) på hippocampus
<ol><li>Trekk opptakspipetter fra borosilikatglasskapillærer med en horisontal pipettetrekker for å motta pipetter på størrelse med ~ 2 MΩ når de er fylt med ACSF-løsning og nedsenket i det ACSF-fylte opptakskammeret.</li>
	<li>Fyll ACSF bad løsning og ACSF løsning som inneholder de riktige kjemikaliene (f.eks, Bicuculline) i en tyngdekraften-kontrollert multi-fat perfusjon system som er koblet til opptakskammeret. Kontinuerlig karbagenate alle løsningene.</li>
	<li>Slå på en peristaltisk eller vakuumpumpe som er koblet til et sugerør som ender på motsatt side av perfusjonslinjen i opptakskammeret. Åpne den ACSF-fylte fatet og begynn å etablere en kontinuerlig strømning (1–2 dråper per sekund). Kontroller at referanseelektroden er nedsenket i ACSF-oppløsningen.</li>
	<li>Slå på oppsettsdatamaskinen, forsterkeren, mikromanipulatoren, stimulatoren, mikroskoplampen(e), kameraet og skjermen (hvis aktuelt).</li>
	<li>Åpne riktig programvare for elektrofysiologiske opptak (flere forskjellige maskinvare- og programvareleverandører for elektrofysiologisk utstyr finnes).</li>
	<li>Overfør en hjerneskive halvkule fra gjenopprettingskammeret til opptakskammeret i skiveoppsettet og plasser den i riktig retning med dentate gyrusgranulatcellelaget og det molekylære laget i synsfeltet. Kontroller at stimuleringselektroden kan nå MPP i skiven fra retning av entorhinal cortex og at opptakselektroden har tilgang til MPP fra motsatt side fra retningen av CA3.</li>
	<li>Stabiliser skiven i opptakskammeret med en binders (figur 3A) eller et kommersielt tilgjengelig hjerneskiver. MERK: Det kan være nyttig å slå av perfusjonen under skiveoverføring og posisjonering. Dette bør imidlertid ikke ta for lang tid for å garantere kvaliteten på hjerneskiven.</li>
	<li>Senk og plasser opptaks- og stimuleringselektrodene i MPP i den nedre tredjedelen av det molekylære laget nær granulatcellelaget (figur 3B), vendt mot hverandre i en avstand på ca. 100–150 μm. Stimuleringselektroden skal minimalt kontakte overflaten, mens opptakselektroden skal infiltrere det øvre skivelaget litt.</li>
	<li>Påfør en stimulans med lav intensitet (30–50 μA for 0,1 ms) på hjerneskiven for å få fEPSP-signalet. Tilpass plasseringen av elektrodene om nødvendig (f.eks. lavt eller atypisk formet fEPSP-signal).</li>
	<li>Begynn å registrere Input-Output kurver: bruk økende stimulans intensiteter til hjernen skive i intervaller på 30 s.</li>
	<li>Sett stimulansintensiteten til 50 % av den maksimale fEPSP-responsen og start baseline fEPSP-opptak som bruker 50 % stimulansintensitet i 20–40 minutter i 30 s intervaller på hjerneskiven.</li>
	<li>Hvis grunnlinjen ser ut til å være stabil, fortsetter du med flere opptak (f.eks. LTP/LTD-protokoller og/eller legemiddelapplikasjoner). (For LTP induksjon i MPP, her en protokoll bestående av fire ganger 1 s 100 Hz pulser brukt i et intervall på 5 min ble brukt. Bicuculline ble påført 10 min før og under kondisjoneringsfasen.) MERK: Alle opptak skal utføres i gjeldende klemmemodus med passende lavpassfiltrering (<5 kHz) og samplingsfrekvenser (> 10 kHz).</li>
	<li>Pakk ut dataene i et passende filformat og analyser fEPSP-parametere, for eksempel fibervolley, fEPSP amplitude og fEPSP-helling.</li>
</ol>7. Kalsiumavbildningsopptak av hjerneskiver
<ol><li>Overfør en hjerneskive halvkule i et 12-brønnskammer og last den i 30 min til 1 time med et passende kalsiumfargestoff. Kontinuerlig karbagenate lasteløsningen ved å sette inn et karbageneringsrør gjennom et selvstyrt hull (med en varm 18G-nål) i lokket på 12-brønnplaten. MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig i tilfelle hjerneskiver fra genmodifiserte dyr som endogene uttrykker en fluorescerende reporter som GCaMP.</li>
	<li>Klargjør opptaksoppsettet som beskrevet i trinn 6.2–6.5. MERK: Ingen forsterker eller mikromanipulator er nødvendig for mikrofluorimetriske bildeforsøk. Bruken av en stimulator er eksperimentavhengig. Spesifikk programvare for fluorescens imaging eksperimenter er viktig.</li>
	<li>Juster programvaren til de riktige bildeinnstillingene: Dette inkluderer kameraforsterker og binning-innstilling, innstilling av bølgelengde, eksponeringstid og tidsberegningsprotokoll. Innstillingene kan variere avhengig av de nøyaktige eksperimentene. (For eksempelspor, 1 x 1 binning, 2,4x forforsterkerforsterkning, 300 EM kameraforsterkning, eksponering på 50 ms ved 488 nm gjentatt hver 500 ms i løpet av eksperimentet ble brukt.)</li>
	<li>Etter lasting med kalsiumfargestoffet, overfør hjerneskiven fra 12-brønnen til opptakskammeret og plasser den på mikroskopstadiet.</li>
	<li>Stabiliser skiven i opptakskammeret med en binders (figur 3A) eller et kommersielt tilgjengelig hjerneskiver som ligner på det som er beskrevet i trinn 6.7.</li>
	<li>Forsikre deg om at interesseområdet er i riktig mikroskopisk felt og i fokus.</li>
	<li>Bruk fluorescensbildeprogramvaren til å velge flere områder av interesse (ROIer) på stykket. MERK: Det kan være nyttig å velge hele synsfeltet for å følge de generelle svingningene i lysstyrke, på grunn av fotobleaching.</li>
	<li>Start opptaket og bruk eksperimentelle testmedisiner på valgte tidspunkter. MERK: Det anbefales å bruke en høy K+ løsning på slutten av hvert eksperiment for å verifisere cellenes nevronale karakter og skivekvaliteten.</li>
	<li>Pakk ut dataene i et passende filformat og analyser fluorescenssignalendringene som oppstår i ROIene over hele målingen. ROIer kan også tilpasses under off-line analyse. MERK: Andre protokoller som beskriver fEPSP-opptak og kalsiummikrofluorimetri i hjerneskiver er tilgjengeligei litteratur 24,32,33,34,35.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Selv om det ofte brukes blant nevrovitenskapssamfunnet, står hjerneskiver også overfor flere ulemper. For eksempel er inngangs- og utgangsforbindelser til hjerneområdene av interesse ikke lenger koblet i en hjerneskive. Videre, når isolert, begynner vevet å forringe sakte over tid, og denne prosessen kan endre de fysiologiske forholdene i hjerneskiven. Dette emnet er spesielt svært bekymringsfullt fordi de fleste hjernesnittopptak tar flere minutter til timer, noe som resulterer i lange eksperimentelle dager med opptak utført på vev som ble isolert opptil 6-8 timer før starten av eksperimentet. Videre blir cerebrospinalvæsken og blodsirkulasjonen avbrutt under skivepreparater, noe som kan føre til mangel på viktige endogene forbindelser i en hjerneskive. Og mest åpenbart, kutte prosedyren i seg selv kan forårsake mekanisk vev skade som kan kompromittere de oppnådde resultatene. Imidlertid er de faktiske fordelene med hjerneskivepreparater fortsatt oppveier deres ulemper, og derfor presenterer de en høyt verdsatt og ansatt teknikk i nevrovitenskapsforskning.
Akutte hippocampal hjerneskiver presenterer en kraftig og derfor mye brukt teknikk for å undersøke nevronale prosesser fra molekylært nivå opp til komplekse hjernekretsstudier. Dette er basert på den ideelle nevroanatomien til hippocampus som lett kan bevares i et stykke preparat18. Følgelig brukes hippocampal hjerneskiver i et bredt spekter av vitenskapelige forskningsprosjekter, inkludert narkotikascreening17,studier av nevronale og synaptiske egenskaper involvert i kognitivefunksjoner 40,41,og undersøkelser av patologiske hjerneforhold14,42,43. Imidlertid forårsaker et bredt spekter av forskjellige applikasjoner også et bredt spekter av tilgjengelige skiveforberedelsesprotokoller som kan variere i ulike parametere, for eksempel disseksjonsforhold og kutteplanorientering, blant andre. Derfor må det eksakte forskningsspørsmålet for et vitenskapelig prosjekt bestemmes for å velge en passende skiveforberedelsesprotokoll.
Vevshelikopteret presenterer en av de eldste brukte teknikkene for å forberede hippocampal hjerneskiver44,45. De viktigste fordelene med denne tilberedningsmetoden inkluderer den lave kostnaden for helikopteret og rask og enkel bruk46. Vevsheliko hakker forårsaker imidlertid mekanisk stress som resulterer i morfologiske endringer og celledød47. Til sammenligning er vibratomen en ganske dyr maskin, og tiden for skiveforberedelse økes betydelig, noe som kan ha innvirkning på kvaliteten på skiven. Vibratomen tilbyr imidlertid vanligvis en mer skånsom måte å skille skivene fra vevet og gjør det mulig å holde hjernen pent avkjølt og oksygenert over hele isolasjonsprosedyren, og dermed forbedreskiveegenskapene 46. Derfor bruker flere grupper vanligvis denne teknikken og har fremmet protokoller for fremstilling av akutte hippocampal hjerneskiver ved hjelp av vibratome16,30,48. Mens noen protokoller gir bare noen få detaljer for kutting seg selv, men heller fokusere på en bestemt anvendelse av slike stykkeforberedelse 48, andre gir detaljerte stykke protokoller som varierer i kutteplan eller andre protokolldetaljer (f.eks agarose innebygging eller skive / utvinning løsninger) gitt i denne artikkelen27,30.
Protokollen beskrevet her presenterer en enkel metode for å forberede høy kvalitet akutte horisontale hippocampal mus hjerneskiver fra unge dyr. Protokollen er spesielt nyttig for å bevare den perforante banen (medial og lateral) som presenterer hippocampal input pathway, som prosjekter fra entorhinal cortex til hippocampus8,49,50. Sagittal, koronar, samt isolerte hippocampus tverrgående skivepreparater ikke riktig bevare perforant banen, som stammer fra hovedsakelig Lag II og V av entorhinal cortex og prosjekter til flere områder innenfor hippocampus18. På grunn av anatomisk posisjonering av entorhinal cortex i forhold til hippocampus, er horisontale hjerneskiver en nødvendighet for å opprettholde helt intakte perforante banefibre i skivepreparatet31. I tillegg bevarer horisontal kutting ideelt de mosete fibrene som projiserer fra dentate gyrus til CA3-nevronene i hippocampus9,30,50. Derfor er denne forberedelsesmetoden av høy verdi for studier som undersøker hippocampal input pathways og DG-relaterte prosesser. I tillegg tillater denne protokollen etterforskning av Schaffer collateral pathway50. Imidlertid er sagittal og koronar hjerne skive preparater mer vanlig når du undersøker CA3 til CA1 fiber projeksjoner, antagelig på grunn av deres litt raskere forberedelsestid som kan øke sjansen for å oppnå høy kvalitet skiver. Likevel presenterer horisontale hippocampal skivepreparater et kraftig forskningsverktøy siden det tillater bevaring og undersøkelse av alle hippocampal fiberveier innenfor en skive halvkule. Dette kan være spesielt nyttig når kretsresponser studeres, for eksempel i multielektrodeanalyseopptak.
En stor bekymring når du forbereder hjerneskiver er riktig bevaring av hjernevevet. Dette oppnås ved flere kritiske trinn i vår protokoll, inkludert en rask disseksjon, kontinuerlig og tilstrekkelig oksygenering og kjøling av vevet, og beskyttelse av hjernevevet ved bruk av den beskyttende kuttemetoden med en lavnatrium, høysukrosekutteløsning39,51. Til tross for at protokollen beskrevet her gir en suksessrate rundt 90%, potensielt flere beskyttende skritt kan være nødvendig når du arbeider med vev avledet fra eldre eller genetisk forskjellige dyr eller når du prøver å bevare en bestemt cellepopulasjon. Flere metoder ble allerede rapportert for å beskytte følsomme hjernevevpreparater. Disse metodene inkluderer bruk av NMDG-baserte kutteløsninger for å redusere natriumpermeasjon52,bruk av høye magnesiumnivåer i kutteløsningen for å blokkere NMDA-reseptoraktivitet53, og langvarig bruk av beskyttende løsninger også i gjenopprettingsperioden23. Alle disse tiltakene vil resultere i redusert eksitoksisitet. I tillegg er en trans-cardial perfusjon med iskalde beskyttende ACSF-løsninger ofte ansatt og nødvendig når du arbeider med eldre dyr27.
Akutte hippocampal hjerneskiver er ideelt egnet og mye brukt til elektrofysiologiske studier av grunner som de høye amplitudesignalene som kan oppnås fra et relativt tykt (300-500 μm) akutt hjerneskive, noe som garanterer et høyt signal til støyforhold11. Standard brukte elektrofysiologiske applikasjoner inkluderer ekstracellulære feltopptak og intracellulære helcelleopptak i spennings- eller strømklemmemodus. For å skaffe seg elektrofysiologiske data av høy kvalitet, er skivehelsen av primær bekymring og kan garanteres ved å følge den presenterte protokollen nøye. Men siden skivepreparater presenterer en svært sensitiv teknikk, bør en kvalitetskontroll rutinemessig inkluderes før starten av hvert eksperiment. Flere parametere kan brukes som kvalitetskontroll av stykket og vurderes vanligvis via Inndata-utgangskurver og baseline fEPSP- eller EPSC-opptak19. Likevel bør det bemerkes at suboptimale elektrofysiologiske egenskaper kan oppstå fra eksperimentelle feil som elektrodeposisjonering, orientering eller til og med skade og representerer ikke utelukkende helsen til den tilberedte skiven. Derfor er det tilrådelig å utføre ekstra kvalitetskontroll som enkel visualisering og vurdering av cellene under et 40x mål eller en DAPI kjernefarging. Slike kvalitetskontroller kan brukes til å bekrefte konstant skive helse over flere skive forberedelse økter.
Kalsium mikrofluorimetri presenterer en mindre vanlig teknikk for å studere hippocampal hjerneskiver. Denne teknikken er imidlertid av ekstra verdi til standard ekstracellulære og intracellulære elektrodeopptak, da den gjør det mulig å visualisere og kvantifisere intracellulære kalsiumkanaler, som er av høy betydning i nevronal og synaptisk signalisering. Endringer i intracellulære kalsiumkonsentrasjoner er involvert i nevrotransmitter vesikkel frigjøring, postsynaptisk potensiell generasjon, regulering av synaptisk plastisitet og aksonalnerveledning 54,55,56. Som en illustrasjon av denne teknikken (Figur 4) benyttet vi oss av et kommersielt tilgjengelig kalsiumfargestoff. Uten tvil kan behandling av vevskiver med kalsiumfargestoffer gi vanskeligheter som en økt eksperimentell tidsramme samt ineffektiv lasting av lavere lokaliserte nevronale celler. Variasjoner på denne teknikken kan imidlertid brukes til å omgå disse tekniske utfordringene. For eksempel er det mulig å kombinere kalsiummålinger og patch klemmeopptak i hippocampal skiver. På denne måten kan et kalsiumfluoreserende fargestoff lastes inn i en bestemt celle gjennom patchpipetten, slik at målinger av kalsiumdynamikk i en bestemt celle av interesse57. Alternativt kan genmodifiserte dyr som uttrykker kalsiumindikatoren, GCaMP58, enten i hele hjernen, eller drevet av en cellespesifikk promotor, brukes. Interessant, hjernevev fra GCaMP dyr med en direkte linker til et protein av interesse kan gi muligheter til å bestemme neuronal uttrykk mønster eller undersøke involvering i kalsium gnister og bølger.
Til sammen gir vi retningslinjene for vellykket fremstilling av sunne og levedyktige horisontale hippocampal hjerneskiver fra mus for elektrofysiologiske og bildeopptak. Denne metodikken er svært nyttig for å få tilgang til nevrologiske endringer som forekommer i hjernepatologier som er beskrevet i dentate gyrus.

Den omfattende utforskningen av hippocampus startet da Scoville og Milner rapporterte manglende evne til en pasient (H.M.) for å danne nytt, deklarativt minne etter kirurgisk fjerning av hippocampus og nærliggende temporal lobe strukturer som en behandling for alvorlig epilepsi1. Fra det øyeblikket har hippocampus blitt studert mye fra generelle nevronale egenskaper og funksjoner opp til utviklingen av alvorlige hjernesykdommer, som epilepsi og Alzheimers sykdom2,3,4,5. Hippocampus er en del av det limbiske systemet, bestående av en gruppe relaterte hjernestrukturer involvert i følelser ogminnedannelse 6,7. Et tett nettverk av flere fiberveier oppnår en tett hippocampal tilkobling til interne og eksterne hjernestrukturer. Disse banene inkluderer medial og lateral perforant bane (entorhinal cortex å bulke gyrus, CA3 – CA1 og subiculum)8, den mossy fiber banen (bulke gyrus til CA3)9 og Schaffer sikkerhet / assosiasjonskommissural vei (CA3 til CA1)10 (Figur 1). Hippocampus presenterer et av de mest utforskede hjerneområdene så langt på grunn av sin høyt bevarte laminær organisering av den nevronale lagdannelsen, og muligheten til å oppnå vitale nevronale kulturer og hjerneskiver med relativletthet 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg"> Figur 1: Tegneserie som illustrerer de forskjellige hippocampal regionene og hovedfiberbanene. De forskjellige hippocampal regionene er indikert med ensfargede linjer: entorhinal cortex (EC; svart), bulke gips (DG; oransje), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (gul) og 1 (magenta), og subiculum (grønn). Fiberveier vises med en farget stiplet linje: medial (MPP, rød) og lateral perforant bane (LPP, blå) (fra entorhinal cortex til dentate gyrus, CA3, CA1, og subiculum), mossy fiber pathway (MF, fiolett) (fra dentate gyrus til CA3) og Schaffer sikkerhet (SC, brun) (ipsilateral fra CA3 til CA1)/assosiasjonelle kiosker (AC, lys grønn) (contralateral fra CA3 til CA1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Hjerneskiverprotokoller resulterer ofte i tap av forbindelser fra fjernere hjerneområder til interesseområdet5. Videre er kapillærene ikke lenger funksjonelle5 og blodsirkulasjonen er fratatt11. Til tross for disse begrensningene brukes hjerneskiver fortsatt primært til undersøkelse av nevrofysiologiske funksjoner i hippocampus på grunn av en rekke fordeler. For det første er utvinningen av hippocampus rask12 og krever ikke mange materialer. De eneste essensielle instrumentene inkluderer et disseksjonssett, et laboratorievannbad, tilgang til karbagen og en vibrerende mikrotom (vibratom)13. Andre eiendeler av hjernen skive teknikken er omgåelse av blod-hjerne-barrieren (BBB) og utvasking av endogene utgitt molekyler før starten av eksperimentet5, noe som gjør det mulig å studere effekten av legemidler med relativt presis doseringskontroll14. Videre bevarer hjerneskiver cytoarkitekturen og synaptiske kretsene i hippocampus15,16, hvor nevroanatomien og det lokale miljøet med nevronal tilkobling og komplekse nevron-glia interaksjoner bevares4,11,17. I tillegg er hippocampal fiberforbindelser overveiende enveis og hippocampal nevroner har en høy synaptisk plastisitet, noe som enormt forenkler samlingen og tolkningen av elektrofysiologiske opptak av høy kvalitet for å forstå nevrologiskeprosesser 18,19. Viktigere, hjerneskiver presentere en verdifull ressurs som gjelder i et bredt spekter av ulike vitenskapelige teknikker, som spenner fra molekylære biologiske teknikker over imaging opptak opp til elektrofysiologiske målinger12,20,21,22,23,24,25,26.
Som beskrevet ovenfor, hippocampal hjerneskiver presentere et kraftig eksperimentelt verktøy for å studere strukturelle og funksjonelle funksjoner i synaptisk tilkobling. Dette gir mulighet til å vurdere effekten av kjemikalier eller mutasjoner på nevronal spenning og plastisitet16.
Akutte hjerneskiver preparater presenterer en relativt følsom teknikk og optimal skivekvalitet er svært avhengig av ideelle eksperimentelle forhold, inkludert dyrets alder, metoden for eutanasi, hastigheten på disseksjon og kutting, kutteløsninger og parametere (f.eks. kuttehastighet) samt betingelsene forskivegjenoppretting 4. Derfor er en godt utformet protokoll av største betydning og sikrer reproduserbarheten på tvers av ulike forskningsenheter13.
Her gir vi en detaljert protokoll for akutte horisontale hippocampal skive preparater, med sikte på å bevare integriteten til hippocampal lateral og mediale perforant banen og mossy fiber banen, slik at undersøkelse av bulke gyrus relaterteprosesser 9. Vi vil beskrive i detalj de viktigste trinnene for å dissekere, trekke ut og horisontalt skjære murine hjernen, etterfulgt av representative resultater av kalsium-mikrofluorimetriske opptak og felt excitatory postsynaptic potensielle opptak (fEPSPs) under baseline forhold og under LTP induksjonsprotokoller i hjernen skiver av vill type C57BL/6J mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>plexiglas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Dr&#228;ger &#38; MSS International Ltd</td>
			<td>Isoflurane Vapor 19.3 &#38; MSS Isoflurane</td>
			<td>to vaporize isoflurane for rodent anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrels for the perfusion system</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Hypodermic syringes without needle</td>
			<td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline methiodide</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0893</td>
			<td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate glass capillaries</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlorid dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Imaging software</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen tank</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>Alphagaz mix B50</td>
			<td>Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>CE2C55</td>
			<td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (35 mm)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353001</td>
			<td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&#174;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (90 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11270-20</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP5</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0225</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16301</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-spark C11440-36U</td>
			<td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&#174;/14058-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0262</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td>
			<td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895278</td>
			<td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0818</td>
			<td>grade 413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush</td>
			<td>Raphael Kaerell</td>
			<td>8204</td>
			<td>Size #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td>
			<td>18G X 1 1/2&#34; 4710012040</td>
			<td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>250 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Henkel Adhesive technologies</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Super glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-10 with SM-7 remote control system</td>
			<td>https://www.luigs-neumann.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for calcium imaging)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for ephys recordings)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Examiner.A1</td>
			<td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope light source</td>
			<td>CAIRN Research</td>
			<td>dual OptoLed power supply</td>
			<td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green&#174; 488 BAPTA-1</td>
			<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
			<td>#06807</td>
			<td>10x50ug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td>5500 vapor pressure osmometer</td>
			<td>to verify osmolarity of salt solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Masterflex C/L 77120-62</td>
			<td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>inoLab series pH 720</td>
			<td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chlorid</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.1133</td>
			<td>https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade to prepare hemispheres</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10</td>
			<td>GEM Scientific Single Edge Razor Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for vibratome</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td>double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>to collect and store brain slices in (see details in manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver electrode wire</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td>for recording and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106342</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14707</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chlorid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for field recordings</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>PatchMaster</td>
			<td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9147-12EA</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td>ISO-FLEX</td>
			<td>http://www.ampi.co.il/isoflex.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>102745C</td>
			<td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0167</td>
			<td>Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>800/100/200 &#38; 800/100/280</td>
			<td>Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 valve multi-barrel perfusion system</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic valves (to control the perfusion lines)</td>
			<td>NResearch Inc.</td>
			<td>p/n 161P011</td>
			<td>https://nresearch.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14912000001</td>
			<td>Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7</td>
			<td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Synergy millipore</td>
			<td>to obtain highly purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>CELLSTAR, 665180</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal hippocampal slices of the mouse brain

Hippocampus er en svært organisert struktur i hjernen som er en del av det limbiske systemet og er involvert i minnedannelse og konsolidering, samt manifestasjonen av alvorlige hjernesykdommer, inkludert Alzheimers sykdom og epilepsi. Hippocampus mottar en høy grad av intra- og inter-tilkobling, og sikrer en riktig kommunikasjon med interne og eksterne hjernestrukturer. Denne tilkoblingen oppnås via forskjellige informasjonsflyter i form av fiberveier. Hjerneskiver er en ofte brukt metodikk når man utforsker nevrofysiologiske funksjoner i hippocampus. Hippocampal hjerneskiver kan brukes til flere forskjellige applikasjoner, inkludert elektrofysiologiske opptak, lette mikroskopiske målinger samt flere molekylære biologiske og histokjemiske teknikker. Derfor representerer hjerneskiver et ideelt modellsystem for å vurdere proteinfunksjoner, for å undersøke patofysiologiske prosesser involvert i nevrologiske lidelser, så vel som for narkotikaoppdagelsesformål.
Det finnes flere forskjellige måter å skive preparater. Hjerneskiver med vibratom gir bedre bevaring av vevsstrukturen og garanterer tilstrekkelig oksygentilførsel under kutting, noe som gir fordeler ved tradisjonell bruk av et vevshelikopter. Videre kan forskjellige skjæreplan påføres for vibratome hjerneskiver. Her er en detaljert protokoll for et vellykket fremstilling av vibratom-cut horisontale hippocampal skiver av musehjerner gitt. I motsetning til andre skivepreparater, gjør horisontal kutting det mulig å holde fibrene i hippocampal input path (perforant bane) i en helt intakt tilstand i et stykke, noe som letter undersøkelsen av entorhinal-hippocampal interaksjoner. Her gir vi en grundig protokoll for disseksjon, ekstraksjon og akutt horisontal kutting av murine hjernen, og diskutere utfordringer og potensielle fallgruver av denne teknikken. Til slutt vil vi vise noen eksempler for bruk av hjerneskiver i videre applikasjoner.

Generell oversikt over verktøy og kritiske trinn som trengs for protokollen Figur 2 presenterer alle nødvendige verktøy og kritiske skritt for fremstilling av horisontale akutte hippocampal hjerneskiver som beskrevet i denne protokollen. Vanligvis er det nødvendig med et begrenset antall viktige instrumenter, inkludert noen få disseksjonsverktøy og et stykke utvinningskammer (figur 2A), et laboratorievannbad og et vibratom (figur 2B). Figur 2C–E visualiserer viktige trinn og orienteringer i hjernen og halvkulene under skiveforberedelsesprotokollen. Figur 2F er en illustrasjon av et forventet resultat av horisontale hjerneskiver.
fEPSP-opptak i den mediale perforantbanen Etter gjenopprettingsperioden kan hjerneskivene brukes til elektrofysiologiske opptak av fEPSPs. Her brukte vi et oppreist mikroskop utstyrt med et flerkanals gravitasjonskontrollert perfusjonssystem (figur 3A og figur 3B). En glassmikropipette (~ 2 MΩ) ble fylt med ACSF-løsning og festet på toppen av en kloridbelagt sølvelektrode som er montert på en operativ forsterker i krets med en klorert badelektrode. fEPSPs ble registrert og visualisert med en forsterker og passende opptaksprogramvare ved å sette glassmikropipetten inn i MPP av hippocampus i det øvre laget av hjerneskiven. fEPSPs ble indusert ved stimulering med en 2-kontakt klynge mikroelektrorod, bruke ulike gjeldende intensiteter til MPP oppstrøms av opptakelektroden. Vær oppmerksom på at denne protokollen ikke er ment å forklare hvordan du får TAK i MPP-opptak, men bruker bare opptak i MPP som et eksempel for å demonstrere suksessen til skiveforberedelsesprotokollen som er beskrevet her. Hvis noen prøver å utføre MPP-opptak, kan visse kontroller (f.eks. sammenkobling av pulsopptak) være nødvendig for å sikre riktig opptaksområde og skille MPP fra LPP8,36,37.
Figur 3C illustrerer et negativt (venstre panel, lav kvalitet skive) og positiv (høyre panel, høy kvalitet skive) eksempel på en fEPSP opptak. Den negative eksempelsporingen viser en stor fibervolley (FV) amplitude som er enda høyere enn den faktiske fEPSP amplituden (≈0,5 mV). I motsetning viser det høykvalitets skiveeksemplet (høyre panel) et lite FV-til-fEPSP-forhold og en høy fEPSP-amplitude (> 0,5 mV). Fibervolleyen er signalet som oppstår ved depolarisering av de stimulerte nevronale fibrene og går derfor foran den postsynaptiske potenseringen (fEPSP). Forholdet mellom FV til fEPSP-egenskaper gir viktig informasjon om bevaring av aksonære og synaptiske egenskaper. Høy kvalitet skiver med intakte nervefibre bør vise en høy fEPSP amplitude til FV ratio. Tvert imot vil lavkvalitets skiver med nedsatt ledningsegenskaper ha et redusert fEPSP til FV-forhold. På samme måte kan levedyktigheten til en hjerneskive analyseres ved å plotte fEPSP-bakker versus fibervolley amplitudene (figur 3D).
Videre brukes Input-Output kurver (fEPSP-helling og FV amplitude over stimulansintensitet) som standard for å bestemme skivekvaliteten. Slike kurver oppnås ved å bruke økende nåværende stimuli til hjerneskiven og ved å overvåke de påfølgende fEPSP-svarene. Hjerneskiver av lav kvalitet viser en redusert Input-Output-kurve på grunn av suboptimale ledningsegenskaper av dårlig bevart hjernevev (figur 3E, F). Videre er Input-Output kurver nødvendig for å definere det ideelle stimuleringsintensitetsområdet for undersøkelse av synaptiske prosesser. Ideelt sett bør stimulansintensiteten settes rundt 50% av intensiteten for maksimale responser. Ved denne valgte stimulansintensiteten er fEPSP-svarene svært følsomme for eventuelle endringer i synaptisk plastisitet, noe som gir mulighet til å undersøke både langsiktig potensering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD).
For å studere synaptisk plastisitet overvåkes den synaptiske overføringen av hjerneskiven (fEPSP-hellingen) ved den valgte 50% stimulansintensiteten i lengre tid (vanligvis mellom 20–40 min) før kondisjoneringsfasen. Levedyktige hjerneskiver vil ha stabile grunnlinjer, mens hjerneskiver med en ustabil baseline ikke kan brukes til ytterligere kondisjoneringsprotokoller for å studere synaptisk plastisitet i hjernekretsene (figur 3G, øvre panel). fEPSP baseline opptak kan også være nyttig for å overvåke narkotikaeffekter på synaptisk overføring selv (Figur 3G, lavere panel). Gjennomsnittet for de registrerte fEPSP baseline signaler brukes vanligvis til å normalisere en fEPSP tidskurs og er standard satt til 100%.
Synaptisk plastisitet kan studeres ved å bruke spesifikke kondisjoneringsprotokoller på hjerneskiver. Disse protokollene avhenger av den undersøkte hjernekretsen og interessemekanismen (f.eks. LTP eller LTD). For å indusere LTP i MPP av dentate gyrus, er en sterk kondisjoneringsprotokoll nødvendig på grunn av den sterke GABAergiske hemmingen som er tilstede ved MPP-synapsene38. Det er rapportert at GABAergic hemming er enda mer uttalt i hjerneskiver tilberedt med høy-sukrose kutte løsninger39. Her bruker vi en protokoll bestående av fire stimuleringer av 1 s lange 100 Hz pulser brukt i et 5 min intervall mens den behandles med GABAA reseptorantagonisten Bicuculline (figur 3H). Samtidig tilsetning av NMDA og Bicuculline i kondisjoneringsperioden resulterer i økt LTP (figur 3H). Lav kvalitet på skiven og ustabil synaptisk overføring (fEPSP baseline) kan resultere i endret eller mislykket LTP og LTD induksjon. Derfor er det av høy betydning å arbeide med høykvalitets skivepreparater og bruke strenge ekskluderingskriterier (lavt fEPSP amplitude-fibervolleyforhold (<3), liten fEPSP-helling (<0,5 mV/ms) eller amplitude (<0,5 mV) og ustabil fEPSP-grunnlinje (endring på mer enn 5 %) for uvekelige skiver når du undersøker synaptiske prosesser.
Kalsium mikrofluorimetriske målinger i granulatcellelaget av dentate gyrus Etter utvinning ble en hjerneskive inkubert ved romtemperatur med 2 μM av et kalsiumfølsomt fargestoff i 1 time i karbagenert ASCF, skjermet mot lys. Skiven ble overført til et opptakskammer (figur 3A) på et oppreist fluorescensmikroskop utstyrt med et flerkanals gravitasjonskontrollert perfusjonssystem. Fluorescens utslipp bilder ble anskaffet hver 500 millisekunder etter belysning på 488 nm (Figur 4A, B). Excitation ble gjort med en Xenon lampe og en skanner montert diffraksjon riste monokromator og bildeoppkjøp ble utført med et datastyrt CCD-kamera. Under målingene ble skiven behandlet med NMDA-reseptorantagonisten APV, noe som resulterte i en reduksjon i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen. Stimulering av skiven med en ekstracellulær løsning som inneholder en høy kaliumkonsentrasjon (50 mM) resulterte i en massiv tilstrømning av ekstracellulært kalsium på grunn av depolarisering av nevronene og åpningen av spennings-gated ion kanaler (Figur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammensatte</td>
			<td>Konsentrasjon (mM)</td>
			<td>Molekylvekt (g/mol)</td>
			<td>Beløp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (andre</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2T2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: 10 x skive pre-oppløsning (1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammensatte</td>
			<td>Konsentrasjon (mM)</td>
			<td>Molekylvekt (g/mol)</td>
			<td>Beløp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (andre</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2T2O</td>
			<td>2</td>
			<td>fra 1 M CaCl2-løsning</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>fra 1 M MgSO4 oppløsning</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4 * 2T2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaritet mellom 305–315 mOsm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammensatte</td>
			<td>Konsentrasjon (mM)</td>
			<td>Molekylvekt (g/mol)</td>
			<td>Beløp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x skive presolution</td>
			<td>N/a</td>
			<td>N/a</td>
			<td>25 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sukrose</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: 1x høysukroseskiveoppløsning (250 ml) (osmolaritet mellom 320–325 mOsm).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg"> Figur 2: Detaljert informasjon om fremstilling av horisontale hippocampal hjerneskiver. (A) Bilde av verktøy som kreves for disseksjon og kutting av gnagerhjernen: (a) ±2 cm lang og ±0,5 cm brede stropper av filterpapir (f.eks. grad 413); (b) blad; (c) super lim; (d) pipettespiss; (e) prøveplate (leveres med vibratom); (f) 35 mm kulturrett; (g) fin børste; (h) slikkepott; (i) buede tang; (j) disseksjon saks; (k) sterk saks (bladlengde over 10 cm); (l) pasteurpipette i plast med bred åpning (mellom 0,6 og 0,8 cm i diameter); (m) gjenvinningskammer (selvprodert med 250 ml beger, plastring, nylonnett, stykke en 10 ml serologisk pipette); (n) 90 mm kulturrett fylt med is og (o) firkantet filterpapir på toppen av den avkjølte kulturfatet. (B) Bilde av en vibratom med (a) holder av skivekammer fylt med is; (b) skive kammer; (c) karbaogenlinje og (d) skjære barberblad. (C) Tegneserie som illustrerer orienteringen av kuttet av den dorsale siden av en halvkule for å forberede hjernen for horisontal kutting (se trinn 3.9). (D)Isometrisk projeksjon av hjernens orientering på prøveplaten på vibratomen. (E) Tegneserie som illustrerer en toppvisning av posisjonen til de to halvkulene på prøveplaten. (F) Tegneserie som viser posisjonen til hippocampus i en horisontal hjerneskive. Dentate gyrus (DG) og Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) regioner av hippocampus er indikert. (G)Bilde av et gjenopprettingskammer med karbagenert ACSF som inneholder ti nysnittede horisontale hjerneskiver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg"> Figur 3: Elektrofysiologiske opptak av hippocampal hjerneskiver. (A) Bilde av et opptakskammer med perfusjon og suging, brukt under et oppreist mikroskop. En hjerneskive vil bli plassert i kammeret og immobilisert med et stykke bind av en binders før starten av opptakene. (B)Bright felt bilde av en hippocampal hjerne skive under en oppreist mikroskop (10x mål). Dentate gyrus (DG) og CA3-regionen er indikert, samt stimuleringen (nederst til venstre) og opptakselektroder (nederst til høyre), rettet mot den mediale perforantbanen under fEPSP-opptak. (C)Venstre: representasjon av et lavkvalitetsskiveeksempel på et fEPSP-opptak med en robust fibervolley og en liten amplitude. Høyre: høy kvalitet skive eksempel på en fEPSP opptak. Den grå linjen angir det opprinnelige nivået. De stiplede linjene peker på cut-off amplitude på 0,5 mV. (D) Plot av fEPSP skråningen versus FV amplitude for høy kvalitet (svart; n = 10) og lav kvalitet hjerneskiver (grå; n = 4). Data representert som gjennomsnittlig ± SEM. (E) Inndataplott (fEPSP-helling) for ulike stimuleringsintensiteter (μA) for høykvalitets skiver (svart; n = 10) og lavkvalitets skiver (grå; n = 4)). (F)Samme som i (E) men for FV amplitudes versus stimulans intensiteter. (G)Tidsforløpet for tre forskjellige baseline fEPSP-opptak (helling av fEPSP i %; normalisert til gjennomsnittlig fEPSP-helling på de første 5 min). Øvre panel representerer et positivt (svart) og negativt (rødt) eksempel, hvor sistnevnte har en ustabil baseline på grunn av utelatelse av karbagen under opptaket. Nedre panel viser to stabile baseline opptak i behandlet (etter 20 min stabil baseline, AMPA reseptorer ble blokkert ved påføring av AMPA reseptor antagonist DNQX (10 μM)) (blå) og ubehandlet tilstand (svart). (H) Tidsforløp for LTP-opptak for ulike behandlingsforhold (angitt i nedre panel). Svart farge for påføring av bikuculline (20 μM) under kondisjonering og blå for samtidig påføring av bicuculline (20 μM) og NMDA (10 μM) under kondisjonering. Piler i øvre panel indikerer tidspunktene der høyfrekvent stimulering ble påført (4 x 1s av 100Hz). Søylegraf i nedre panel representerer gjennomsnittlig fEPSP-bakker (%) i 50–60 min etter LTP-induksjon av eksperimentene som vises i det øvre panelet (enkeltrepresentantopptak for hver betingelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg"> Figur 4: Kalsium-mikrofluorimetri av hippocampal hjerneskiver. (A og B) Fluorescens bilde (spent på 488 nm) (A) og tilsvarende varmekart (B) av en horisontal hippocampal hjerne skive av musen hjernen. Dentate gyrus (DG), CA3-regionen og et eksempel på en interesseregion (ROI) er angitt i panel A. (C) Tidsforløp av kalsiumresponser (F488 nm) fra en avkastning i dentate gyrus av en akutt hippocampal hjerneskive under behandling med NMDA-reseptorantagonisten APV (50 μM) og oppløsning som inneholder høyt ekstra kalium (K+) (50 mM). Sporet normaliseres til høyeste kalsiumrespons under høy K+ perfusjon og er baseline korrigert for fotografering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain at JoVE.com

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Denne artikkelen tar sikte på å beskrive en systematisk protokoll for å oppnå horisontale hippocampal hjerneskiver i mus. Målet med denne metodikken er å bevare integriteten til hippocampal fiber veier, for eksempel perforant banen og den mosete fiberkanalen for å vurdere bulke gyrus relaterte nevrologiske prosesser.

Horisontale Hippocampal skiver av musen hjernen

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersøkelser på Endringer i Hippocampus Circuit Funksjon Etter mild traumatisk hjerneskade

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Utarbeidelse av akutt hjernen skiver med en optimalisert N-Methyl-D-glucamine beskyttende gjenopprettingsmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Utarbeidelse av Horisontale Skiver av Adult Mouse Retina for Elektro Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering av Synapse tetthet i hippocampus gnager hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging av intracellulære ATP i Organotypic tissue skiver av Mouse Brain ved hjelp av bånd-basert sensor ATeam 1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...