Name: horizontal hippocampal slices of the mouse brain
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain at JoVE.com

Vi tackar elektrofysiologienheten vid VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research under överinseende av Dr. Keimpe Wierda och Prof. Dr. Joris De Wit för användningen av deras forskningsanläggningar. Dessutom tackar vi alla medlemmar i Laboratoriet för jonkanalforskning och Laboratoriet för endometrium, endometrios och reproduktiv medicin vid KU Leuven för deras hjälpsamma diskussioner och kommentarer.
Projektet har fått medel från Forskningsstiftelsen-Flandern (G.084515N och G.0B1819N till J.V.) och KU Leuvens forskningsråd (C1-finansiering C14/18/106 till J.V.). K.P. är en FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow och fick finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet (665501) med Forskningsstiftelsen Flandern (FWO) (12T0317N). K.H. är postdoktor vid Forskningsstiftelsen Flandern, Belgien (12U7918N).

Alla djurförsök för denna studie godkändes av KU Leuvens (Belgien) etiska granskningskommitté (P021/2012).
1. Beredning av lösning med hög sackarosskiva och konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF)
<ol><li>Före experimentell dag<ol>
<li>Bered 1 L 10x skiva förlösning med laboratoriekvalitet typ 1 vatten som innehåller (i mM): 25 KCl, 20 CaCl2,10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabell 1). För att förhindra kalciumfosfatutfällning, blanda långsamt kemikalierna i en bägare förfylld med 800 ml H2O medan du ständigt rör om med en magnetisk omrörare. Förvara lösningen vid 4 °C eller rumstemperatur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>På den experimentella dagen<ol>
<li>Förbered 1 L av 1x ACSF med laboratoriekvalitet typ 1 vatten som innehåller (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2,1 MgSO4,1,25 NaH2PO4,26 NaHCO3,25 Glukos (Tabell 2). Använd en ångtrycksosmometer för att validera osmolariteten mellan 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6). OBS: För att förhindra kalciumfosfatutfällning, blanda långsamt alla fasta kemikalier i en bägare förfylld med 800 ml H2O medan du ständigt rör om med en magnetisk omrörare. Tillsätt MgSO4 och CaCl2 i slutet och droppa långsamt i den nödvändiga mängden från 1 M lagerlösningar.</li>
		<li>Bubbla kontinuerligt 1x ACSF-lösning vid RT med karbagen för att ställa in pH mellan 7,3–7,4. OBS: Om pH-talet är något för högt eller för lågt skulle små justeringar i karbageneringsstyrkan vara tillräckliga. Om pH-värde är högre än 7,45 med karkotagenering, justera det genom att tillsätta några droppar 1 M NaH2PO4-lösning.</li>
		<li>Bered 250 ml (per hjärna) 1x lösning med hög sackarosskiva i en bägare som innehåller 25 ml 10x skiva före lösning och (i mM): 252 Sackaros, 26 NaHCO3och 10 Glukos (Tabell 3). Kontrollera att osmolariteten är mellan 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).</li>
		<li>Bubbla lösningen med hög sackarosskiva i 10–15 min med karbagen för att styra pH mellan 7,3–7,4. OBS: Om pH är högre än 7,45 med karkotagenering, justera det genom att tillsätta några droppar 1 M KH2PO4-lösning.</li>
		<li>Förvara lösningen med hög sackarosskiva i 20–30 min i ultrafrysen (-80 °C) tills den är delvis frusen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Förberedelse av arbetsytan för hjärnsekering
<ol><li>Förbered följande under nedkylning av den höga sackarosskivan.<ol>
<li>Värm upp vattenbadet till 32 °C.</li>
		<li>Fyll återvinningskammaren (figur 2A) med den karbagenerade ACSF-lösningen och placera kammaren i vattenbadet. Applicera kontinuerligt karbagen på acsf-flaskan och ACSF i återvinningskammaren.</li>
		<li>För djuret till experimentrummet. OBS: Djurets ålder, kön och stam måste bestämmas av den enskilda experimenteraren och är beroende av den specifika studiefrågan. Djurets parametrar bör dock förbli konstanta inom en studie för att garantera jämförbarhet mellan de olika försöksdagarna. Detta protokoll utformades för användning av C57BL/6J hanmöss i åldern 2-6 veckor. Om äldre djur kommer att användas kan skiva och återhämtningslösningar behöva anpassas i enlighetdärmed 4,27 (t.ex. NMDG+-baseradelösningar 23,28) för att bevara hjärnans hälsa hos de akuta skivorna.</li>
		<li>Förbered anestesikammaren.</li>
		<li>Lägg ut mjukpapper, plast Pastörpipett med bred öppning (skär öppen), 90 mm odlingsfat fylld med is, en kvadrat av filterpapper ovanpå den kylda odlingsformen, stark sax för halshuggning, dissekeringssax, böjda tångar, spatel, 35 mm odlingsform, fin borste, blad, provplatta (levereras med vibratome), superlim, pipettspets, fyra remmar filterpapper (~ 2 cm x 0,5 cm) (Figur 2A).</li>
		<li>Ställ in vibratome: Programmera först vibratomen för rätt inställningar (bladens körhastighet: 0,08 mm/s, skäramlitud: 1,4 mm, skärfrekvens: 85 Hz) och fäst karbagenlinjen i skärkammaren. Placera sedan skärkammaren i hållaren, fyll hållaren som omger skivan med is och fäst allt på vibratomen. Placera slutligen rakbladet i vibratomebladshållaren(bild 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter frysning av lösningen med hög sackaros utför du följande steg.<ol>
<li>Efter 20–30 min, ta ut lösningen med hög sackarosskiva ur ultrafrysen -80 °C och håll bägaren på is.</li>
		<li>Placera lösningen med hög sackaros bredvid vibratomen på din bänk, krossa och blanda den delvis frusna lösningen med en spatel för att få en fin slask och börja bubbla med karbagen.</li>
		<li>Ta upp en lösning med hög sackarosskiva med pastapipetten av plast för att suga det kvadratiska filterpapperet ovanpå den kylda 90 mm kulturrätten.</li>
		<li>Fyll 35 mm odlingsskålen (eller någon motsvarande liten behållare som är lämplig för att lagra hela hjärnan) upp till 75% med lösningen med hög sackarosskiva (tillräcklig för att täcka hela hjärnan) och kyl kulturskålen på is som hålls bredvid bägaren med resten av lösningen. Karbaogenera lösningen i 35 mm kulturformen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissekering och positionering av murinhjärnan
<ol><li>Bedöva djuret med 5% isofluran. Bestäm det korrekta djupet av anestesi genom att nypa tassen. Ingen tass tillbakadragande reflex bör uppstå.</li>
	<li>Överför djuret på vävnadspapper och halshugg det med stark sax eller en liten djur giljotin.</li>
	<li>Använd dissekeringssax för att skära upp hårbotten.</li>
	<li>Skär upp calvaria längs sagittal suturen och ta bort den med hjälp av böjda tångar tills hela hjärnan, inklusive luktlökarna, är synlig. OBS: Var noga med att inte skada hjärnan med de skarpa kanterna på calvaria eller tång.</li>
	<li>Använd en spatel för att försiktigt skopa ut hjärnan (luktlampor bör förbli fästa).</li>
	<li>Överför hjärnan i den kylda 35 mm kulturrätten och ta bort alla hår- eller blodpartiklar från vävnaden genom att försiktigt tvätta hjärnan med en ACSF-fylld Pasteur-pipett (blodet har cytotoxiska effekter påhjärnvävnad 29).</li>
	<li>Överför hjärnan med hjälp av spatel på det blöta filterpapperet ovanpå den kylda 90 mm kulturrätten (Figur 2A).</li>
	<li>Använd ett blad för att skära hjärnan i hälften, separera de två halvkloten och placera båda halvkloten på den nyklippta mediala sidan.</li>
	<li>Använd ett blad för att ta bort den dorsala delen (5–10 %) av hjärnan från varje halvklot med ett parallellt snitt till dorsaltoppen (Figur 2C)30 och placera båda halvkloten på den nyklippta sidan med den ventrala delen av hjärnan vänd uppåt.</li>
	<li>Placera en droppe superlim på provplattan och sprid ut ordentligt med en pipettspets för att rymma båda halvkloten.</li>
	<li>Använd ett filterpappersband för att plocka upp en halvklot med kapillärkrafter genom att vidröra den ventrala sidan med filterpappersremmen och därmed inte skada vävnaden.</li>
	<li>Använd ett annat filterpappersband för att försiktigt halvtorka hjärnans dorsala sida innan du placerar halvklotet med den dorsala sidan ner ovanpå limet på provplattan. Upprepa samma procedur med andra halvklotet. OBS: Halvkloten ska placeras i horisontell riktning på ett speglat sätt på vibratomeplattan, med rostrala sidor riktade mot utsidan och de kaudala sidorna vända (men inte röra) varandra i mitten. De mediala sidorna på båda halvkloten bör peka mot vibratomebladet och sidosidorna mot experimenteraren (Figur 2D).</li>
	<li>Placera provplattan i skivkammaren och täck den snabbt, men försiktigt, med iskallt hög sackarosskiva. Så snart lösningen berör limet kommer det att stelna och ordentligt limma halvkloten på provplattan.</li>
	<li>Försäkra dig om att halvkloten är ordentligt täckt med lösning med hög sackarosskiva och bekräfta att lösningen bubblar med karbagen. OBS: Hela dissekeringsproceduren bör utföras så fort som möjligt. Se till att hjärnan inte stannar utan syretillförsel under mycket lång tid. Det bör bara ta cirka 1-1,5 min från halshuggning till hjärnsänkning i lösningen med hög sackarosskiva. Detta är det mest kritiska kravet på akuta hjärnsegmentpreparat för att motivera hög kvalitet på skivan.</li>
</ol>4. Horisontell skivning av hjärnan
<ol><li>Placera vibratomebladet framför den mediala sidan av halvkloten och sänk det till samma höjd som de ventrala sidorna av halvkloten som nu är vända uppåt. Sänk bladet med hjälp av vibratomekontrollen till 600 μm längre i dorsalriktningen och börja skära. Bladet ska träffa vävnaden (om inte, vänd bladet och sänk det lite mer). Skiva tills de två första skivorna är helt separerade från de två halvkloten.</li>
	<li>Vänd bladet och sänk ytterligare 300 μm och skiva igen.</li>
	<li>När hippocampus blir synlig (användmusen 31 hjärnatlas för hjälp, om det behövs) (Figur 2E) samla skivorna med den breddade plast pastörpipetten. Samla skivorna tills caudat putamen blir synlig bredvid hippocampus. Vanligtvis kan mellan 8-12 skivor på 300 μm (4-6 per halvklot) samlas in för mushjärnan.</li>
	<li>Använd pastörpipetten av plast för att samla skivorna och överför dem till återvinningskammaren i vattenbadet(figur 2F)(samla skivor efter varje skiva för att förhindra att de flyter runt i skärkammaren). OBS: Arbeta så snabbt som möjligt och se till att lösningen med hög sackarosskiva är iskall och karbaogenerad under hela proceduren. Fyll vid behov på isen som omger skivan.</li>
</ol>5. Återvinning av hjärnskivor för elektrofysiologiska inspelningar
<ol><li>Lämna skivorna i den ACSF-fyllda återvinningskammaren i vattenbadet på 32 °C i 1 timme. OBS: Återvinningskammare är också kommersiellt tillgängliga.</li>
	<li>Ta ut återvinningskammaren ur vattenbadet.</li>
	<li>Placera skivorna på RT i minst ytterligare 30 minuter för återställning innan du startar ytterligare program.</li>
</ol>6. fEPSP-inspelningar i hippocampus (Media Perforant Path)
<ol><li>Dra inspelningspipetter från borosilikatglas kapillärer med en horisontell pipettdragare för att ta emot pipetter av storleken ~2 MΩ när de fylls med ACSF-lösning och nedsänkt i den ACSF-fyllda inspelningskammaren.</li>
	<li>Fyll ACSF-badlösning och ACSF-lösning som innehåller lämpliga kemikalier (t.ex. bikukulin) i ett gravitationskontrollerat multifatperfusionssystem som är anslutet till inspelningskammaren. Kontinuerligt karbonogenera alla lösningar.</li>
	<li>Slå på en peristaltisk pump eller vakuumpump som är ansluten till ett sugslang som slutar mittemot perfusionslinjen i inspelningskammaren. Öppna den ACSF-fyllda pipan och börja etablera ett kontinuerligt flöde (1–2 droppar per sekund). Kontrollera att referenselektroden är nedsänkt i ACSF-lösningen.</li>
	<li>Slå på inställningsdatorn, förstärkaren, mikromanipulatorn, stimulatorn, mikroskopljusen, kameran och bildskärmen (om tillämpligt).</li>
	<li>Öppna lämplig programvara för elektrofysiologiska inspelningar (det finns flera olika leverantörer av hårdvara och programvara för elektrofysiologisk utrustning).</li>
	<li>Överför en hjärnskiva halvklotet från återhämtningskammaren till skivinställningens inspelningskammare och placera den i rätt orientering med det dentate gyrusgranulatcellskiktet och det molekylära skiktet i synfältet. Se till att stimuleringselektroden kan nå MPP i skivan från entorhinal cortex och att inspelningselektroden har tillgång till MPP från exakt motsatt sida från CA3: s riktning.</li>
	<li>Stabilisera skivan i inspelningskammaren med ett gem (figur 3A) eller ett kommersiellt tillgängligt hjärnsegmentnät. OBS: Det kan vara bra att stänga av perfusionen under segmentöverföring och positionering. Detta bör dock inte ta för lång tid för att garantera kvaliteten på hjärnskivan.</li>
	<li>Sänk och placera inspelnings- och stimuleringselektroderna i MPP i den nedre tredjedelen av det molekylära skiktet nära granulatcellskiktet (figur 3B), vänd mot varandra på ett avstånd av cirka 100–150 μm. Stimuleringselektroden bör minimalt komma i kontakt med ytan, medan inspelningselektroden bör infiltrera det övre segmentskiktet något.</li>
	<li>Applicera en lågintensiv stimulans (30-50 μA för 0,1 ms) på hjärnskivan för att få fEPSP-signalen. Anpassa elektrodernas position vid behov (t.ex. låg eller atypisk formad fEPSP-signal).</li>
	<li>Börja registrera indata-utgångskurvor: applicera ökande stimulansintensiteter på hjärnsegmentet i intervaller på 30 s.</li>
	<li>Ställ in stimulansintensiteten på 50% av det maximala fEPSP-svaret och starta fEPSP-inspelningar vid baslinjen med 50% stimulansintensitet i 20–40 min i 30 s intervall på hjärnskivan.</li>
	<li>Om baslinjen verkar vara stabil, fortsätt med ytterligare inspelningar (t.ex. LTP/LTD-protokoll och/eller läkemedelsapplikationer). (För LTP-induktion i MPP användes här ett protokoll bestående av fyra gånger 1 s 100 Hz pulser som applicerades i ett intervall på 5 min. Bicuculline applicerades 10 min före och under konditioneringsfasen.) OBS: Alla inspelningar ska utföras i aktuellt klämläge med lämplig lågpassfiltrering (<5 kHz) och samplingshastigheter (>10 kHz).</li>
	<li>Extrahera data i ett lämpligt filformat och analysera fEPSP-parametrar, till exempel fibervolley, fEPSP-amplitud och fEPSP-lutning.</li>
</ol>7. Inspelningar av kalciumavbildning av hjärnskivor
<ol><li>Överför en hjärnskiva halvklotet i en 12-brunnskammare och ladda den i 30 min till 1 h med ett lämpligt kalciumfärgämne. Carbogenate kontinuerligt lastlösningen genom att föra in ett karbonogenationsrör genom ett självtillverkade hål (med en varm 18G-nål) i locket på 12-brunnsplattan. OBS: Detta steg är inte nödvändigt vid hjärnsegmentpreparat från genetiskt modifierade djur som endogent uttrycker en fluorescerande reporter som GCaMP.</li>
	<li>Förbered inspelningsinställningarna enligt beskrivningen i steg 6.2–6.5. OBS: Ingen förstärkare eller mikromanipulator behövs för mikrofluorimetriska bildframställningsexperiment. Användningen av en stimulator är experimentberoende. Specifik programvara för fluorescensavbildningsexperiment är viktig.</li>
	<li>Justera programvaran till rätt bildinställningar: detta inkluderar kameraförstärkare och binningsinställning, inställning av våglängd, exponeringstid och tidsprotokoll. Inställningarna kan variera beroende på de exakta experimenten. (Till exempel spårningar, 1 x 1 binning, 2,4x förförstärkare, 300 EM-kameraförstärkning, exponering på 50 ms vid 488 nm upprepad var 500 ms under experimentets varaktighet användes.)</li>
	<li>Efter lastning med kalciumfärgämnet, överför hjärnskivan halvklotet från 12-brunnen till inspelningskammaren och placera den på mikroskopstadiet.</li>
	<li>Stabilisera skivan i inspelningskammaren med ett gem (figur 3A) eller ett kommersiellt tillgängligt hjärnsegmentnät som liknar det som beskrivs i steg 6.7.</li>
	<li>Försäkra dig om att intresseområdet ligger inom rätt mikroskopiskt område och i fokus.</li>
	<li>Använd programvaran fluorescensavbildning för att välja flera regioner av intresse (ROIs) på din sektor. OBS: Det kan vara användbart att välja hela synfältet för att följa de allmänna fluktuationerna i ljusstyrkan, på grund av fotoblekning.</li>
	<li>Starta inspelningen och applicera de experimentella testläkemedlen vid valda tidpunkter. OBS: Det är lämpligt att applicera en hög K+ lösning i slutet av varje experiment för att verifiera cellernas neuronala karaktär och segmentkvaliteten.</li>
	<li>Extrahera data i lämpligt filformat och analysera de fluorescenssignaländringar som sker i ROI:erna under hela mätningen. RoIs kan också anpassas under off-line analysen. OBS: Andra protokoll som beskriver fEPSP-inspelningar och kalciummikrofluormetri i hjärnskivor finns ilitteraturen 24,32,33,34,35.</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Även om det ofta används bland neurovetenskapsgemenskapen, står hjärnans skärpreparat också inför flera nackdelar. Till exempel är ingångs- och utgångsanslutningar till hjärnans intresseområden inte längre anslutna i en hjärnskiva. Dessutom, när den är isolerad, börjar vävnaden försämras långsamt med tiden och denna process kan förändra de fysiologiska förhållandena i hjärnskivan. Detta ämne i synnerhet är mycket oroande eftersom de flesta hjärnskiva inspelningar tar flera minuter till timmar, vilket resulterar i långa experimentella dagar med inspelningar som utförs på vävnad som isolerades upp till 6-8 h före början av experimentet. Dessutom avbryts ryggmärgsvätskan och blodcirkulationen under skiva preparat, vilket kan leda till bristen på viktiga endogena föreningar i en hjärnskiva. Och mest uppenbart kan skivningsproceduren i sig orsaka mekaniska vävnadsskador som kan äventyra de erhållna resultaten. De faktiska fördelarna med hjärnsnittspreparat uppväger dock fortfarande deras nackdelar, varför de presenterar en högt värderad och anställd teknik inom neurovetenskaplig forskning.
Akuta hippocampal hjärnskivor presenterar en kraftfull och därför allmänt använd teknik för att undersöka neuronala processer från en molekylär nivå upp till komplexa hjärnkretsstudier. Detta är baserat på hippocampus idealiska neuroanatomi som lätt kan bevaras i en skiva förberedelse18. Följaktligen används hippocampal hjärnskivor i en mängd olika vetenskapliga forskningsprojekt, inklusive läkemedelsscreeningar17,studier av neuronala och synaptiska egenskaper involverade i kognitivafunktioner 40,41, och undersökningar av patologiska hjärnförhållanden14,42,43. Men ett brett spektrum av olika applikationer orsakar också ett brett spektrum av tillgängliga segmentberedningsprotokoll som kan skilja sig åt i olika parametrar, till exempel dissekeringsförhållanden och skärplansorientering, bland andra. Därför måste den exakta forskningsfrågan för ett vetenskapligt projekt fastställas för att välja ett lämpligt segmentberedningsprotokoll.
Vävnadshackern presenterar en av de äldsta använda teknikerna för att förbereda hippocampal hjärnskivor44,45. De stora fördelarna med denna beredningsmetod inkluderar den låga kostnaden för helikoptern och den snabba och enkla användningen46. Vävnadshelikoptrar orsakar dock mekanisk stress som resulterar i morfologiska förändringar och celldöd47. I jämförelse är vibratome en ganska dyr maskin och tiden för skärberedning ökar avsevärt vilket kan påverka skivaens kvalitet. Vibratome erbjuder dock vanligtvis ett mer skonsamt sätt att separera skivorna från vävnaden och gör det möjligt att hålla hjärnan snyggt kyld och syresatt under hela isoleringsproceduren, vilket förbättrarskäregenskaperna 46. Därför använder flera grupper standard denna teknik och har tidigaremat protokoll för beredning av akuta hippocampala hjärnskivor med vibratome16,30,48. Medan vissa protokoll bara ger några detaljer för själva skivningen men snarare fokuserar på en specifik tillämpning av sådanasegmentberedning 48, ger andra detaljerade segmentprotokoll som skiljer sig åt i skärplan eller andra protokolldetaljer (t.ex. agarose inbäddning eller segment / återställningslösningar) som ges iden här artikeln 27,30.
Protokollet som beskrivs här presenterar en enkel metod för att förbereda högkvalitativa akuta horisontella hippocampal mus hjärnskivor från unga djur. Protokollet är särskilt användbart för att bevara den perforantväg (mediala och laterala) som presenterar hippocampal ingångsvägen, som projicerar från entorhinal cortex till hippocampus8,49,50. Sagittal, koronal, liksom isolerade hippocampus tvärgående skiva preparat bevarar inte ordentligt perforantvägen, som härstammar från främst lager II och V av entorhinal cortex och projekterar till flera områden inom hippocampus18. På grund av den anatomiska positionering av entorhinal cortex i förhållande till hippocampus, horisontella hjärnskivor är en nödvändighet för att upprätthålla helt intakt perforant väg fibrer inom skiva förberedelse31. Dessutom bevarar horisontell skivning idealiskt de mossiga fibrerna som projicerar från dentate gyrus till CA3-neuronerna i hippocampus9,30,50. Därför är denna beredningsmetod av högt värde för studier som undersöker hippocampal input pathways och GD-relaterade processer. Dessutom tillåter detta protokoll en undersökning av Schaffers säkerhetsväg50. Sagittal och koronal hjärnskiva preparat används dock oftare när man undersöker CA3 till CA1 fiberprojektioner, förmodligen på grund av deras något snabbare förberedelsetid som kan öka chansen att få högkvalitativa skivor. Ändå presenterar horisontella hippocampal slice preparat ett kraftfullt forskningsverktyg eftersom det gör det möjligt att bevara och undersöka alla hippocampal fibervägar inom en skiva halvklotet. Detta kan vara särskilt användbart när kretssvar studeras, till exempel i multielektrodanalysinspelningar.
Ett stort problem vid beredning av hjärnskivor är korrekt bevarande av hjärnvävnaden. Detta uppnås genom flera kritiska steg i vårt protokoll, inklusive en snabb dissekering, kontinuerlig och tillräcklig syresättning och kylning av vävnaden och skyddet av hjärnvävnaden med hjälp av den skyddande skärmetoden med en lågnatrium, hög sackaros skivningslösning39,51. Trots det faktum att det protokoll som beskrivs här ger en framgångsgrad på cirka 90%, kan potentiellt ytterligare skyddsåtgärder krävas när man arbetar med vävnad som härrör från äldre eller genetiskt olika djur eller när man försöker bevara en specifik cellpopulation. Flera metoder rapporterades redan för att skydda känsliga hjärnvävnad preparat. Dessa metoder inkluderar användning av NMDG-baserade skivningslösningar för att minska natriumpermeationen52,användningen av höga magnesiumnivåer i skivningslösningen för att blockera NMDA-receptoraktivitet53, och långvarig användning av skyddslösningar även under återhämtningsperioden23. Alla dessa åtgärder kommer att leda till minskad excitotoxicitet. Dessutom används ofta en transkardiell perfusion med iskallt skyddande ACSF-lösningar och är nödvändig när man arbetar med äldre djur27.
Akuta hippocampala hjärnskivor är idealiska och används i stor utsträckning för elektrofysiologiska studier av skäl som de höga amplitudsignalerna som kan erhållas från en relativt tjock (300-500 μm) akut hjärnskiva, vilket garanterar en hög signal tillbrusförhållande 11. Standardiserade elektrofysiologiska tillämpningar inkluderar extracellulära fältinspelningar och intracellulära helcellsinspelningar i spännings- eller strömklämmaläge. För att förvärva elektrofysiologiska data av hög kvalitet är skivans hälsa av största vikt och kan garanteras genom att strikt följa det presenterade protokollet. Men eftersom segmentberedningar presenterar en mycket känslig teknik bör en kvalitetskontroll rutinmässigt inkluderas före början av varje experiment. Flera parametrar kan användas som kvalitetskontroll av segmentet och utvärderas standard via indatautgångskurvor och baslinje fEPSP- eller EPSC-inspelningar19. Det bör dock noteras att suboptimala elektrofysiologiska egenskaper kan uppstå från experimentella fel som elektrodpositionering, orientering eller till och med skada och inte bara representerar den beredda skivans hälsa. Därför är det lämpligt att utföra ytterligare kvalitetskontroller som enkel visualisering och bedömning av cellerna under ett 40x-mål eller en DAPI-kärna färgning. Sådana kvalitetskontroller kan användas för att bekräfta konstant segmenthälsa över flera segmentberedningssessioner.
Kalciummikrofluormetri presenterar en mindre vanlig teknik för att studera hippocampal hjärnskivor. Denna teknik är dock av ytterligare värde till de vanliga extracellulära och intracellulära elektrodinspelningarna, eftersom det gör det möjligt att visualisera och kvantifiera intracellulära kalciumflöden, som är av stor betydelse vid neuronal och synaptisk signalering. Förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationer är involverade i neurotransmittor vesikelfrisättning, postsynaptisk potentiell generering, reglering av synaptisk plasticitet och axonal nervledning54,55,56. Som en illustration av denna teknik( Figur 4) använde vi oss av ett kommersiellt tillgängligt kalciumfärgämne. Obestridligt kan behandling av vävnadsskivor med kalciumfärgämnen ge svårigheter som en ökad experimentell tidsram samt ineffektiv belastning av lägre belägna neuronala celler. Variationer i denna teknik skulle dock kunna användas för att kringgå dessa tekniska utmaningar. Till exempel är det möjligt att kombinera kalciummätningar och patchklämmainspelningar i hippocampala skivor. På detta sätt kan ett kalciumfluorescerande färgämne laddas i en specifik cell genom patchpipetten, vilket möjliggör mätningar av kalciumdynamik i en specifik cell av intresse57. Alternativt kan genetiskt modifierade djur som uttrycker kalciumindikatorn GCaMP58, antingen i hela hjärnan eller drivs av en cellspecifik promotor, användas. Intressant nog kan hjärnvävnad från GCaMP-djur med en direkt länkare till ett protein av intresse ge möjligheter att bestämma det neuronala uttrycksmönstret eller undersöka inblandningen i kalciumgnistor och vågor.
Sammantaget ger vi riktlinjerna för framgångsrik förberedelse av friska och livskraftiga horisontella hippocampal hjärnskivor från möss för elektrofysiologiska och bildinspelningar. Denna metodik är mycket användbar för att komma åt neurologiska förändringar som uppstår i hjärnpatologier som beskrivs i dentate gyrus.

Den omfattande utforskningen av hippocampus började när Scoville och Milner rapporterade oförmågan hos en patient (H.M.) att bilda nytt, deklarativt minne efter kirurgiskt avlägsnande av hippocampus och närliggande temporala lob strukturer som en behandling för svår epilepsi1. Från det ögonblicket har hippocampus studerats omfattande från allmänna neuronala egenskaper och funktioner fram till utvecklingen av allvarliga hjärnsjukdomar, såsom epilepsi och Alzheimers sjukdom2,3,4,5. Hippocampus är en del av det limbiska systemet, bestående av en grupp relaterade hjärnstrukturer involverade i känslor och minnesbildning6,7. Ett tätt nätverk av flera fibervägar utför en snäv hippocampal anslutning till inre och externa hjärnstrukturer. Dessa vägar inkluderar den mediala och laterala perforantvägen (entorhinal cortex för att dentate gyrus, CA3 - CA1 och subiculum)8, den mossiga fibervägen (dentate gyrus till CA3)9 och Schaffer säkerhet / associationskommissural väg (CA3 till CA1)10 (Figur 1). Hippocampus presenterar ett av de mest utforskade hjärnområdena hittills på grund av dess mycket bevarade laminära organisation av den neuronala lagerbildningen och möjligheten att få vitala neuronala kulturer och hjärnskivor med relativlätthet 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg"> Figur 1: Tecknad film som illustrerar de olika hippocampalregionerna och de viktigaste fibervägarna. De olika hippocampal regionerna indikeras av fasta färgade linjer: entorhinal cortex (EG; svart), dentate gyrus (DG; orange), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (gul) och 1 (magenta) och subiculum (grön). Fiberbanor visas med en färgad prickad linje: den mediala (MPP, röd) och laterala perforantbanan (LPP, blå) (från entorhinal cortex till dentate gyrus, CA3, CA1 och subiculum), den mossiga fibervägen (MF, violett) (från dentate gyrus till CA3) och Schaffer säkerheter (SC, brun) (ipsilateral från CA3 till CA1)/associationella commissural vägar (AC, ljusgrön) (kontralateral från CA3 till CA1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Brain slice protokoll resulterar ofta i förlust av anslutningar från mer avlägsna hjärnområden till området av intresse5. Dessutom är kapillärerna inte längre funktionella5 och blodcirkulationen berövas11. Trots dessa begränsningar används hjärnskivor fortfarande främst för undersökning av neurofysiologiska funktioner i hippocampus på grund av ett antal fördelar. För det första är extraktionen av hippocampussnabb 12 och kräver inte många material. De enda väsentliga instrumenten inkluderar en dissekeringssats, ett laboratorievattenbad, tillgång till karbin och en vibrerande mikrotom (vibratome)13. Andra tillgångar i hjärnsegmenttekniken är kringgåendet av blod- hjärnbarriären (BBB) och utsvöningen av endogent frisläppta molekyler före början avexperimentet 5, vilket gör det möjligt att studera effekten av läkemedel med relativt exakt doseringskontroll14. Dessutom bevarar hjärnskivor cytoarkitekturen och synaptiska kretsarna inom hippocampus15,16, där neuroanatomin och den lokala miljön med neuronal anslutning och komplexa neuron-glia interaktioner bevaras4,11,17. Dessutom är hippocampal fiberanslutningar främst enkelriktade och hippocampala nervceller har en hög synaptisk plasticitet, vilket oerhört förenklar insamlingen och tolkningen av högkvalitativa elektrofysiologiska inspelningar för att förstå neurologiska processer18,19. Viktigt är att hjärnskivor utgör en värdefull tillgång som är tillämplig i ett brett spektrum av olika vetenskapliga tekniker, som sträcker sig från molekylärbiologiska tekniker över bildinspelningar upp till elektrofysiologiskamätningar 12,20,21,22,23,24,25,26.
Som beskrivits ovan presenterar hippocampal hjärnskivor ett kraftfullt experimentellt verktyg för att studera strukturella och funktionella funktioner i den synaptiska anslutningen. Detta ger möjlighet att bedöma effekterna av kemikalier eller mutationer på neuronal excitabilitet och plasticitet16.
Akuta hjärnsnittspreparat presenterar en relativt känslig teknik och optimal skiva kvalitet är mycket beroende av idealiska experimentella tillstånd, inklusive djurets ålder, dödshjälpsmetoden, dissekeringshastigheten och skivningen, skivningslösningarna och parametrarna (t.ex. skivningshastighet) samt villkoren för skivaåterhämtning 4. Därför är ett väl utformat protokoll av yttersta vikt och säkerställer reproducerbarheten mellan olika forskningsenheter13.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för akuta horisontella hippocampal slice preparat, med målet att bevara integriteten hos hippocampal laterala och mediala perforant väg och mossiga fibervägen, vilket möjliggör undersökning av dentate gyrus relaterade processer9. Vi kommer att beskriva i detalj de viktigaste stegen för att dissekera, extrahera och horisontellt skära murin hjärnan, följt av representativa resultat av kalcium-mikrofluorimetric inspelningar och fält excitatoriska postsynaptic potentiella inspelningar (fEPSPs) under baslinje förhållanden och under LTP induktion protokoll i hjärnan skivor av vilda typ C57BL/6J möss.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>plexiglas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Dr&#228;ger &#38; MSS International Ltd</td>
			<td>Isoflurane Vapor 19.3 &#38; MSS Isoflurane</td>
			<td>to vaporize isoflurane for rodent anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrels for the perfusion system</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Hypodermic syringes without needle</td>
			<td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline methiodide</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0893</td>
			<td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate glass capillaries</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlorid dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Imaging software</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen tank</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>Alphagaz mix B50</td>
			<td>Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>CE2C55</td>
			<td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (35 mm)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353001</td>
			<td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&#174;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (90 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11270-20</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP5</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0225</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16301</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-spark C11440-36U</td>
			<td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&#174;/14058-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0262</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td>
			<td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895278</td>
			<td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0818</td>
			<td>grade 413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush</td>
			<td>Raphael Kaerell</td>
			<td>8204</td>
			<td>Size #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td>
			<td>18G X 1 1/2&#34; 4710012040</td>
			<td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>250 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Henkel Adhesive technologies</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Super glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-10 with SM-7 remote control system</td>
			<td>https://www.luigs-neumann.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for calcium imaging)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for ephys recordings)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Examiner.A1</td>
			<td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope light source</td>
			<td>CAIRN Research</td>
			<td>dual OptoLed power supply</td>
			<td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green&#174; 488 BAPTA-1</td>
			<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
			<td>#06807</td>
			<td>10x50ug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td>5500 vapor pressure osmometer</td>
			<td>to verify osmolarity of salt solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Masterflex C/L 77120-62</td>
			<td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>inoLab series pH 720</td>
			<td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chlorid</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.1133</td>
			<td>https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade to prepare hemispheres</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10</td>
			<td>GEM Scientific Single Edge Razor Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for vibratome</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td>double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>to collect and store brain slices in (see details in manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver electrode wire</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td>for recording and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106342</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14707</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chlorid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for field recordings</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>PatchMaster</td>
			<td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9147-12EA</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td>ISO-FLEX</td>
			<td>http://www.ampi.co.il/isoflex.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>102745C</td>
			<td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0167</td>
			<td>Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>800/100/200 &#38; 800/100/280</td>
			<td>Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 valve multi-barrel perfusion system</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic valves (to control the perfusion lines)</td>
			<td>NResearch Inc.</td>
			<td>p/n 161P011</td>
			<td>https://nresearch.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14912000001</td>
			<td>Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7</td>
			<td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Synergy millipore</td>
			<td>to obtain highly purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>CELLSTAR, 665180</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal hippocampal slices of the mouse brain

Hippocampus är en mycket organiserad struktur i hjärnan som är en del av det limbiska systemet och är involverad i minnesbildning och konsolidering samt manifestationen av allvarliga hjärnsjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom och epilepsi. Hippocampus får en hög grad av intra- och inter-connectivity, vilket säkerställer en korrekt kommunikation med interna och externa hjärnstrukturer. Denna anslutning uppnås via olika informationsflöden i form av fibervägar. Hjärnskivor är en ofta använd metodik när man utforskar neurofysiologiska funktioner i hippocampus. Hippocampal hjärnskivor kan användas för flera olika tillämpningar, inklusive elektrofysiologiska inspelningar, lätta mikroskopiska mätningar samt flera molekylärbiologiska och histokemiska tekniker. Därför representerar hjärnskivor ett idealiskt modellsystem för att bedöma proteinfunktioner, för att undersöka patofysiologiska processer som är involverade i neurologiska sjukdomar såväl som för läkemedelsupptäcktsändamål.
Det finns flera olika sätt att skära preparat. Hjärnskiva preparat med en vibratome möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och garanterar en tillräcklig syretillförsel under skivning, vilket ger fördelar jämfört med traditionell användning av en vävnadshacker. Dessutom kan olika skärplan appliceras för vibratome hjärnsegmentpreparat. Här finns ett detaljerat protokoll för en lyckad beredning av vibratome-skuren horisontell hippocampal skivor av mushjärnor. I motsats till andra skiva preparat, horisontell skivning gör det möjligt att hålla fibrerna i hippocampal input path (perforant väg) i ett helt intakt tillstånd inom en skiva, vilket underlättar undersökningen av entorhinal-hippocampal interaktioner. Här ger vi ett grundligt protokoll för dissekering, extraktion och akut horisontell skivning av murinhjärnan och diskuterar utmaningar och potentiella fallgropar av denna teknik. Slutligen kommer vi att visa några exempel för användning av hjärnskivor i ytterligare applikationer.

Allmän översikt över verktyg och kritiska steg som behövs för protokollet Figur 2 presenterar alla nödvändiga verktyg och kritiska steg för beredning av horisontella akuta hippocampal hjärnskivor som beskrivs i detta protokoll. I allmänhet krävs ett begränsat antal nyckelinstrument, inklusive några dissektionsverktyg och en skäråtervinningskammare (figur 2A), ett laboratorievattenbad och en vibratome(figur 2B). Figur 2C–E visualiserar viktiga steg och orienteringar i hjärnan och halvkloten under skivan preparation protocol. Figur 2F är en illustration av ett förväntat resultat av horisontella hjärnskivor.
fEPSP-inspelningar i den mediala perforantbanan Efter återhämtningsperioden kan hjärnskivorna användas för elektrofysiologiska inspelningar av fEPSPs. Här använde vi ett upprätt mikroskop utrustat med ett flerkanaligt gravitationsstyrt perfusionssystem(figur 3A och figur 3B). En mikropipett i glas (~ 2 MΩ) fylldes med ACSF-lösning och fästes ovanpå en kloridbelagd silverelektrod som är monterad på en fungerande förstärkare i krets med en klorerad badelektrod. fEPSPs spelades in och visualiserades med en förstärkare och lämplig inspelning programvara genom att infoga glas micropipette i MPP av hippocampus i det övre lagret av hjärnan skiva. fEPSPs framkallades av stimulering med en 2-kontakt kluster mikroelektrode, tillämpa olika aktuella intensiteter på MPP uppströms av inspelning elektrod. Observera att detta protokoll inte är avsett att förklara hur man får MPP-inspelningar, utan använder helt enkelt inspelningar i MPP som ett exempel för att visa framgången för segmentberedningsprotokollet som beskrivs här. Om någon försöker utföra MPP-inspelningar kan vissa kontroller (t.ex. parade pulsinspelningar) vara nödvändiga för att säkerställa rätt inspelningsplats och skilja MPP från LPP8,36,37.
Figur 3C illustrerar ett negativt exempel (vänster panel, segment av låg kvalitet) och positivt (höger panel, högkvalitativt segment) på en fEPSP-inspelning. Den negativa exempel spårning visar en stor fiber volley (FV) amplitud som är ännu högre än den faktiska fEPSP amplitud (≈0,5 mV). Däremot visar exemplet med högkvalitativa segment (höger panel) ett litet FV till fEPSP-förhållande och en hög fEPSP-amplitud (>0,5 mV). Fibervolley är signalen som uppstår vid depolarisering av de stimulerade neuronala fibrerna och föregår därför den postsynaptiska potentiationen (fEPSP). Förhållandet mellan FV och fEPSP-egenskaper ger viktig information om bevarandet av axonal och synaptiska egenskaper. Högkvalitativa skivor med intakta nervfibrer bör visa en hög fEPSP amplitud till FV-förhållande. Tvärtom kommer skivor av låg kvalitet med nedsatt ledningsförmåga att ha ett minskat fEPSP till FV-förhållande. På samma sätt kan livskraften hos en hjärnskiva analyseras genom att plotta fEPSP-sluttningar jämfört med fibervolleyamlituderna (Figur 3D).
Dessutom används ingångsutgångskurvor (fEPSP-lutning och FV-amplitud över stimulansintensitet) standard för att bestämma segmentkvaliteten. Sådana kurvor erhålls genom att applicera ökande strömstimuli på hjärnskivan och genom att övervaka efterföljande fEPSP-svar. Hjärnskivor av låg kvalitet visar en minskad ingångs-outputkurva på grund av suboptimala ledningsegenskaper hos dåligt bevarad hjärnvävnad (Figur 3E,F). Dessutom är input-output kurvor nödvändiga för att definiera det idealiska stimuleringsintensitetsområdet för undersökning av synaptiska processer. Helst bör stimulansintensiteten ställas in runt 50% av intensiteten för maximala svar. Vid denna valda stimulansintensitet är fEPSP-svaren mycket känsliga för eventuella förändringar i synaptisk plasticitet, vilket ger möjlighet att undersöka både långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD).
För att studera synaptisk plasticitet övervakas den synaptiska överföringen av hjärnskivan (fEPSP-lutning) vid den valda 50% stimulansintensiteten under en längre tidsperiod (vanligtvis mellan 20-40 min) före konditioneringsfasen. Livskraftiga hjärnskivor kommer att ha stabila baslinjer, medan hjärnskivor med en instabil baslinje inte kan användas för ytterligare konditioneringsprotokoll för att studera synaptisk plasticitet hos hjärnkretsarna (Figur 3G, övre panelen). fEPSP baslinjeinspelningar kan också vara användbara för att övervaka läkemedelseffekter på själva synaptisk överföring(figur 3G,nedre panelen). Medelvärdet av de registrerade fEPSP-baslinjesignalerna används vanligtvis för att normalisera en fEPSP-tidskurs och är standard inställd på 100%.
Synaptisk plasticitet kan studeras genom att tillämpa specifika konditioneringsprotokoll på hjärnskivorna. Dessa protokoll beror på den undersökta hjärnkretsen och mekanismen av intresse (t.ex. LTP eller LTD). För att inducera LTP i MPP av dentate gyrus, är ett starkt konditionering protokoll nödvändigt på grund av den starka GABAergic hämning som finns vid MPP synapserna38. Det rapporteras att GABAergic hämning är ännu mer uttalad i hjärnskivor beredda med hög sackaros skivning lösningar39. Här använder vi ett protokoll som består av fyra stimuleringar av 1 s långa 100 Hz pulser appliceras i ett 5 minuters intervall medan vi behandlas med GABAA receptorantagonist Bicuculline (Figur 3H). Samtillskottet av NMDA och Bicuculline under konditioneringsperioden resulterar i en ökad LTP (Figur 3H). Låg kvalitet på skivan och instabil synaptisk överföring (fEPSP baslinje) kan resultera i förändrad eller misslyckad LTP och LTD induktion. Därför är det av stor vikt att arbeta med högkvalitativa segmentberedningar och använda rigorösa uteslutningskriterier (låg fEPSP-amplitud till fibervolleyförhållande (<3), liten fEPSP-lutning (<0,5 mV/ms) eller amplitud (<0,5 mV) och instabil fEPSP-baslinje (förändring på mer än 5%) för ogenomförbara segment vid undersökning av synaptiska processer.
Kalciummikrofluorimetriska mätningar i granulatcellskiktet i dentate gyrus Efter återhämtning inkuberades en hjärnskiva vid rumstemperatur med 2 μM av ett kalciumkänsligt färgämne i 1 h i karbonogenerad ASCF, avskärmad från ljus. Skivan överfördes till en inspelningskammare (figur 3A) på ett upprätt fluorescensmikroskop utrustat med ett flerkanalsgravitationsstyrt perfusionssystem. Fluorescensemissionsbilder förvärvades var 500:e millisekekonferens efter belysning vid 488 nm (figur 4A,B). Excitation gjordes med en Xenon lampa och en skanner monterad diffraktion galler galler monokromator och bildförvärv utfördes med en datorstyrd CCD-kamera. Under mätningarna behandlades skivan med NMDA-receptorantagonisten APV, vilket resulterade i en minskning av den intracellulära kalciumkoncentrationen. Stimulering av skivan med en extracellulär lösning som innehåller en hög kaliumkoncentration (50 mM) resulterade i en massiv tillströmning av extracellulärt kalcium på grund av depolariseringen av nervcellerna och öppnandet av spänningsportade jonkanaler (Figur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammansatta</td>
			<td>Koncentration (mM)</td>
			<td>Molekylvikt (g/mol)</td>
			<td>Belopp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (kcl)</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: 10 x skiva förlösning (1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammansatta</td>
			<td>Koncentration (mM)</td>
			<td>Molekylvikt (g/mol)</td>
			<td>Belopp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (kcl)</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>från 1 M CaCl2-lösning</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>från 1 M MgSO4-lösning</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4 * 2H2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (på NaHCO)
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukos * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaritet mellan 305–315 mOsm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sammansatta</td>
			<td>Koncentration (mM)</td>
			<td>Molekylvikt (g/mol)</td>
			<td>Belopp (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x skiva presolution</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>Ej tillämpligt</td>
			<td>25 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sackaros</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (på NaHCO)
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukos * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: 1x lösning med hög sackarosskiva (250 ml) (osmolaritet mellan 320–325 mOsm).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg"> Figur 2: Detaljerad information om beredning av horisontella hippocampala hjärnskivor. a)Bild av verktyg som krävs för dissekering och skivning av gnagarhjärnan: a) ±2 cm långa och ±0,5 cm breda band av filterpapper (t.ex. grad 413); b) Blad. c) Superlim. d) Pipettspets. e) Provplatta (levereras med vibratome). f) 35 mm odlingsfat, g) Fin borste. h) Spatel. i) Böjda tångar. j) Dissekeringssax. k) Stark sax (bladlängd över 10 cm). l) Pastörpipett av plast med bred öppning (mellan 0,6 och 0,8 cm i diameter). m) Återvinningskammare (självtillverkad med 250 ml bägare, plastring, nylonnät, bit av en 10 ml serologisk pipett). n) 90 mm odlingsfat fylld med is och o) ruta med filterpapper ovanpå den kylda kulturrätten. b)Bild av en vibratome med a) hållare av skiva kammare fylld med is; b) Skärkammare. c) Karbagenlinje och d) skära rakblad. (C) Tecknad film som illustrerar orienteringen av snittet på den dorsala sidan av en halvklot för att förbereda hjärnan för horisontell skivning (se steg 3.9). D)Isometrisk projektion av hjärnorienteringen på provplattan på vibratomen. E)Tecknad film som illustrerar en överst av de två halvklotens läge på provplattan. (F) Tecknad film som visar hippocampus position i en horisontell hjärnskiva. Regionerna dentate gyrus (DG) och Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) i hippocampus anges. (G) Bild av en återhämtningskammare med karbagenerad ACSF som innehåller tio nyskurna horisontella hjärnskivor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg"> Figur 3: Elektrofysiologiska inspelningar av hippocampala hjärnskivor. A)Bild av en inspelningskammare med perfusion och sug, som används under ett upprätt mikroskop. En hjärnskiva kommer att placeras i kammaren och immobiliseras med en bit av ett gem innan inspelningarna börjar. (B) Ljus fältbild av en hippocampal hjärnskiva under ett upprätt mikroskop (10x mål). Dentate gyrus (DG) och CA3 regionen anges samt stimulering (nedre vänstra) och inspelning (nedre högra) elektroder, riktar in sig på den mediala perforantbanan under fEPSP inspelningar. (C) Vänster: representation av ett segment av låg kvalitet av en fEPSP-inspelning med en robust fibervolley och en liten amplitud. Höger: exempel på en fEPSP-inspelning av hög kvalitet. Den grå linjen anger baslinjenivån. De prickade linjerna pekar ut den avskurna amplituden på 0,5 mV. (D) Tomten på fEPSP-lutningen jämfört med FV-amplituden för hög kvalitet (svart; n=10) och hjärnskivor av låg kvalitet (grå; n=4). Data representerade som medelvärde ± SEM. (E) Input-Output plot (fEPSP-lutning) för olika stimuleringsintensiteter (μA) för högkvalitativa skivor (svarta; n = 10) och lågkvalitativa skivor (grå; n = 4)). (F) Samma som i( E) men för FV-amplituderna jämfört med stimulansintensiteterna. G)Tidsföring av tre olika fEPSP-baslinjeinspelningar (fEPSP-lutning i %; normaliserad till den genomsnittliga fEPSP-lutningen under de första 5 minen). Övre panelen representerar ett positivt (svart) och negativt (rött) exempel, där den senare har en instabil baslinje på grund av utelämnande av karbagen under inspelningen. Nedre panelen visar två stabila baslinjeinspelningar i behandlade (efter 20 min stabil baslinje blockerades AMPA-receptorer genom applicering av AMPA-receptorantagonisten DNQX (10 μM)) (blått) och obehandlat tillstånd (svart). (H) Tidskurs för LTP-inspelningar för olika behandlingsförhållanden (anges i nedre panelen). Svart färg för applicering av bicuculline (20 μM) under konditionering och blå för sam applicering av bicuculline (20 μM) och NMDA (10 μM) under konditionering. Pilar i övre panelen anger de tidpunkter där högfrekvent stimulering tillämpades (4 x 1s av 100Hz). Stapeldiagram i nedre panelen representerar medelvärdet fEPSP-sluttningar (%) i 50–60 min efter LTP-induktion av de experiment som visas i den övre panelen (en enda representativ inspelning för varje villkor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg"> Figur 4: Kalciummikrofluormetri hos hippocampala hjärnskivor. (A och B) Fluorescensbild (upphetsad vid 488 nm) (A) och motsvarande värmekarta (B) av en horisontell hippocampal hjärnskiva av mushjärnan. Dentate gyrus (DG), CA3-regionen och ett exempel på en region av intresse (ROI) anges i panel A. (C) Tidsförloppet för kalciumsvar (F488 nm) från en ROI i dentate gyrus av en akut hippocampal hjärnskiva under behandling med NMDA receptorantagonisten APV (50 μM) och lösning som innehåller hög extracellulär kalium (K+) (50 mM). Spåret normaliseras till det högsta kalciumsvaret under hög K+ perfusion och är baslinjen korrigerad för fotoblekning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain at JoVE.com

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Denna artikel syftar till att beskriva ett systematiskt protokoll för att erhålla horisontella hippocampal hjärnskivor hos möss. Syftet med denna metodik är att bevara integriteten hos hippocampal fibervägar, såsom perforantvägen och det mossiga fiberområdet för att bedöma dentate gyrus relaterade neurologiska processer.

Horisontella Hippocampal skivor av mushjärnan

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Beredning av Oligomer β-amyloid 1-42 Och induktion av synaptisk plasticitet Nedskrivning av hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersökningar om ändringar av hippocampus Kretsens funktion Efter Mild traumatisk hjärnskada

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad N-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Framställning av horisontella skivor Adult mus Retina för elektrofysiologiska studier

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Utvärdering av synaps densitet i hippocampus gnagare hjärnan skivor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Avbildning av intracellulära ATP i Organotypic vävnad skivor av musen hjärnan med hjälp av bandet-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...