Name: capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

A.J.C وJ.A.T و I.L تعترف بتمويل المفوضية الأوروبية من خلال مشروع أفق 2020 ACEnano (المنحة رقم H2020-NMBP-2016-720952). و.ز تعترف بتمويل الدكتوراه من مجلس المنح الدراسية في الصين (CSC، رقم 201507060011). 22- تعترف منظمة البحوث العلمية الهولندية بالدعم المالي المقدم من خطة منحة فيدي (NWO Vidi 723.0160330).

تمت الموافقة على استخدام السائل الحيوي البشري وفقا للمبادئ التوجيهية بروتوكول IRB من جامعة لايدن وجامعة إنسبروك الطبية. عندما يتم التحقيق في السوائل الحيوية البشرية أو الحيوانية ، مطلوب موافقة أخلاقية من مؤسسة البحث ، وقد تم الحصول عليها في حالة النتائج الموضحة في هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك ينبغي أيضا أن يتم إعداد تقارير كافية لضمان الشفافية وإعادة استخدام البيانات في العمل المستقبلي9و29و30.
1. إعداد الشوارد الخلفية (BGE)
ملاحظة: يجب إعداد جميع المذيبات في غطاء الدخان المناسب ويجب استخدام معدات الحماية الشخصية الكافية لجميع الخطوات (معطف وقفازات ونظارات واقية). في كل خطوة، مطلوب قنينات بلاستيكية منخفضة الربط لتقليل فقدان التحليل وتلوث العينة بالأملاح المذابة من الأواني الزجاجية.
<ol><li>إعداد 10٪ حمض الخليك BGE (v/v)، درجة الحموضة 2.2 على أساس يومي لنواتج الأيض.<ol>
<li>في قارورة حجمية 10 مل إضافة 1 مل من حمض الخليك، تليها إضافة المياه deionized (DI) إلى خط ملحوظ وخلط شامل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد حمض الخليك 100 mM، درجة الحموضة 2.9 على أساس يومي لبروتيوميوم.<ol>
<li>في قارورة حجمية 10 مل إضافة 57 ميكرولتر من حمض الخليك، تليها إضافة المياه DI إلى خط ملحوظ وخلط شامل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد NM
<ol><li>تفريق NMs بقوة في الماء باستخدام المبادئ التوجيهية المنشورة31،32،33. ملاحظة: في تطوير هذا البروتوكول، استخدمت 7 NMs على النحو التالي: 100 و 1000 نانومتر البوليسترين carboxylated استخدمت للبروتين والهالة المستقلب، على التوالي. 100 نانومتر غير معدلة البوليسترين NMs, 13 نانومتر anatase TiO2 NMs التي كانت غير معدلة أو المغلفة إما البولي أكريلات أو البوليمرات PVP و 22 نانومتر غير معدلة SiO2 NMs استخدمت لكل من البروتين والهالة المستقلب. في حين تم تطوير هذه الطريقة وأثبتت باستخدام هذه NMs، تجدر الإشارة إلى أن هذا النهج سيكون قابلا للتطبيق على مجموعة واسعة من التراكيب NM، والأحجام والأشكال، والمورفولوجيا.</li>
	<li>تميز حجم الجسيمات باستخدام إما ضوء ديناميكي تشتت34،35، جسيم واحد يقترن استحثاليا البلازما الطيف الكتل36، تحليل تتبع الجسيمات النانوية37، أو المجهر الإلكتروني انتقال وشحن السطح كما زيتا المحتملة باستخدام زيتا sizer34.</li>
</ol>3. تشكيل الهالة الجزيئية الحيوية
<ol><li>تقسيم 2 مل من البلازما البشرية (أو بيوفلويد من اختيار) إلى 1 مل aliquots, واحد لاليكوت المستقلب والبروتين كورونا والثانية لتوصيف الأيض البلازما.</li>
	<li>احتضان 1 ملغم / مل من NMs في البلازما البشرية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بينما الاختلاط بلطف في 500 دورة في الدقيقة في thermomixer. بعد حضانة الطرد المركزي العينة في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه NMs.</li>
	<li>جمع البلازما supernatant لتحليل الهالة المستقلب. الاحتفاظ مجمع كورونا NM-البروتين لتوصيف هالة البروتين.</li>
</ol>4. عزلة هالة البروتين
<ol><li>Resuspend NM-البروتين المعقدة (بيليه) في 1 مل من 10x برنامج تلفزيوني العازلة ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة. الطرد المركزي حل برنامج تلفزيوني في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه NMs، وإزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه.</li>
	<li>Resuspend بيليه في 1 مل من العازلة بيكربونات الأمونيوم (ABC) (100 mM، pH 8.0) ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة والأملاح غير المرغوب فيها. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لكريات NMs؛ إزالة وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة.</li>
	<li>تقليل الروابط البروتين كبريتيد عن طريق حل بيليه البروتين NM في 20 ميكرولتر من العازلة ABC (100 mM درجة الحموضة 8) التي تحتوي على 10 mM dithiotheritol. احتضان حل التخفيض لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.</li>
	<li>لهضم البروتينات، إضافة 2 ميكروغرام من الدرجة تسلسل تريبسين إلى 20 ميكرولتر من ABC تحتوي على 0.1٪ السطحي. احتضان محلول الهضم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ألكيلات العينة بإضافة 20 ميكرولتر من iodoacetamide في 55 mM في 100 mM ABC واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>إضافة 20 ميكرولتر من 0.1 م HCl إلى شق السطحي وترك لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إثراء وإزالة الببتيدات باستخدام C18 معبأة تلميح ماصة تحلية.<ol>
<li>الرطب تلميح مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 50٪ أسيتونيتريل 5 مرات، نظيفة مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 5 مرات، ورسم وعينة elute 10 مرات، عينة desalt عن طريق مسح 80 ميكرولتر 0.1 ٪ حمض الفورميك 5 مرات وealute العينة 2 مرات مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 70٪ acetonitrile في أنبوب PCR منخفضة الربط نظيفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophilize العينات وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.</li>
</ol>5. عزل هالة ميتابوليت
<ol><li>تأخذ البلازما التحكم وsupernatant من حضانة البلازما NM من الخطوة 3.3 والحفاظ على الجليد أثناء إعداد العينة.</li>
	<li>خذ 50 ميكرولتر من كل منها إلى قنينات منفصلة وتمييع 1 من كل 10 مع ماء DI. خذ 50 ميكرولتر من كل عينة مخففة وانتقل إلى قوارير جديدة للخطوة 5.3.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر كلوروفورم، 250 ميكرولتر الميثانول و 350 ميكرولتر DI المياه وخليط دوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 20,800 × ز عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>خذ 500 ميكرولتر من الناسخ الفائق والفلتر من خلال فلتر طرد مركزي 3 kDa لمدة 2 ساعة عند 10000 × غرام عند 4 درجات مئوية. خذ 430 ميكرولتر من الترافلترات وجاف في سرعة فاك. ويمكن الآن تجميد العينات قبل تحليلها.</li>
</ol>6. إعداد نظام CESI-MS38
ملاحظة: قبل تثبيت الشعيرات الدموية، تحقق من أن مدخل ومنفذ نهاية الشعيرات الدموية سليمة وأنه لا توجد أية الكسر مرئية في الشعيرات الدموية.
<ol><li>تركيب الشعرية المغلفة محايدة لتحليل هالة البروتين39.<ol>
<li>ضع شعرية مغلفة محايدة جديدة (طول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الشعيرات الدموية CESI للتحليل بروتيوميك.<ol>
<li>قم بمسح الشعرية الفاصلة في الاتجاه الأمامي باستخدام 100 mM من HCl لمدة 5 دقائق عند 100 psi وتحقق من تكوين القطيرات في منفذ الشعرية. تدفق فصل الشعرية مع BGE في 100 psi لمدة 10 دقيقة ثم DI المياه في 100 psi لمدة 30 دقيقة (وهذا مطلوب فقط للشعيرات الدموية الجديدة).</li>
		<li>تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان شكل قطرات في نهاية منفذ كل من الشعيرات الدموية.</li>
		<li>تدفق الشعيرات الدموية فصل مع الماء DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M HCl، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. زوجين CESI إلى MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تركيب الشعرية السيليكا تنصهر عارية لتوصيف هالة المستقلب38.<ol>
<li>ضع شعرية السيليكا العارية الجديدة (بطول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI باتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الشعيرات الدموية CESI لتحليل الأيض.<ol>
<li>تدفق الشعرية فصل في الاتجاه الأمامي باستخدام 100٪ MeOH في 50 psi لمدة 15 دقيقة والتحقق من تشكيل قطرة في منفذ الشعرية. تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان قطرات تشكل في منفذ كل من الشعيرات الدموية.</li>
		<li>تدفق الشعرية الفصل مع المياه DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M NaOH، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. الزوجين CESI إلى ESI-MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS لتحليل هالة البروتين
<ol><li>عينات ريسوسبند من الخطوة 4.8 في 20 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 50 mM درجة الحموضة 4.0.</li>
	<li>إجراء 5 psi 10 s حقن الهيدروديناميكية من العينة. فصل باستخدام الجهد فصل 30 كيلو فولت مع الانحدار الضغط التالي: 0-10 دقيقة في 1 psi، 10-35 دقيقة في 1.5 psi و 35-45 دقيقة في 5 psi باستخدام 100 mM، درجة الحموضة 2.9 حمض الخليك كما BGE.</li>
	<li>جمع الأطياف الشامل بين 250-2000 م / ض مع أعلى 10 بيانات تعتمد على اقتناء التجزئة.</li>
	<li>بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl لمدة 3 دقائق في 100 psi و 10 دقيقة 100 psi من BGE لفصل الشعرية و 3 دقائق في 100 psi للشعيرات الدموية السائلة موصل.</li>
</ol>8. CESI-MS لتحليل هالة المستقلب
ملاحظة: يجب تحليل كافة العينات مرتين، مرة في الوضع الإيجابي للكشف عن الكاتيونات ومرة واحدة في الوضع السلبي للكشف عن أنيونات. عينات البلازما التحكم تحتاج إلى تحليلها على الأقل 5 مرات.
<ol><li>Resuspend NM المكشوفة وغير المكشوفة عينات البلازما من الخطوة 5.4 في 430 ميكرولتر من المياه DI ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.1 ميكرومتر.</li>
	<li>خذ 95 ميكرولتر من الفيلترات وأضف 5 ميكرولتر من المعايير الداخلية عند 200 ميكرومتر للكاتيونات (كبرفون L-methionine) و400 ميكرومتر للأيونات (2,2,4,4-D4-حمض الستريك) ودوامة بقوة. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل تحليل CESI-MS.</li>
	<li>حقن عينة هيدروديناميكالي لمدة 30 ق (كاتيون) و 40 ق (أنيونات) في 2 psi.</li>
	<li>المستقلبات منفصلة في 10٪ حمض الخليك مع الجهد فصل 30 كيلو فولت في الأمام (كاتيون) وعكس (أنيونات) واسطة. ويساعد وضع فصل عكسي مع 0.5 PSI الضغط إلى الأمام على الشعرية الفصل.</li>
	<li>تعيين مطياف الكتلة لجمع البيانات في إيجابية (كاتيون) أو سلبية (أنيونات) وضع على مدى كتلة 65-1000 م / ض. بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl، 0.1 M NaOH، DI المياه وBGE في 50 psi لمدة 2 دقيقة.</li>
</ol>

J.A.T هو موظف في شركة AB Sciex UK Ltd الذين يشاركون كشريك صناعي في مشروع ACEnano ، J.A.T وجميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم تضارب في المصالح في هذا العمل.

هذه هي الطريقة الأولى المقترحة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي تتضمن البروتينات والأيض ، من نفس العينة ، باستخدام CESI-MS. القدرة على توصيف كل من البروتينات والأيض من نفس العينة سوف تزيد بشكل كبير من كمية البيانات التي تم جمعها من التعرض التجريبي واحد تمكين رؤى جديدة في عملية تشكيل الهالة وآثارها على سمية NMs وفعالية مثل الأدوية النانوية. وعلاوة على ذلك، CESI-MS هو منصة مثالية لتوصيف كل من فئتي الجزيئات الحيوية مع مجرد تغيير الشعيرات الدموية المطلوبة. للمضي قدما، فإن الأساليب الجديدة التي تم تطويرها ل CE غير المائية ستمكن من إجراء الدهون باستخدام CE-MS40 وبالتالي فمن الممكن الآن تحليل البروتينات والأيض والدهون باستخدام منصة واحدة. وسيتطلب النهج التقليدية الحالية منصتين مخصصتين للتصلب المتعدد LC، إحداهما للهالة البروتينية و واحدة للهالة المستقلب. وبالتالي، يمكن لهذا النهج جمع ضعف البيانات باستخدام منصة تحليلية واحدة.
هناك بعض المحاذير لهذا النهج لا سيما مع هالة المستقلب كما يقترح هذا البروتوكول قياس غير مباشر للهالة. على هذا النحو, قد تنشأ مشكلة عندما تكون مستويات المستقلب موجودة بتركيزات عالية بالنسبة إلى NMs والانخفاض اللاحق في تركيز المستقلب في المصفوفة صغير. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، فمن غير المرجح أن يتم تطوير نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" لعزل هالة المستقلب بسبب وجود كيمياء سطحية فريدة من نوعها لكل NM. للمضي قدما فمن المرجح أن يتم تطوير نهج محددة NM لعزل هالة المستقلب والتحقق من صحتها ومع ذلك; وهذا ينطبق فقط على أن NM محددة. على الرغم من هذا، فإن CESI-MS لا تزال منصة مناسبة للغاية لتوصيف الأيض القطبي المشحون بغض النظر عن كيفية عزلها. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه إذا لم تتشكل الكريات أثناء خطوات الطرد المركزي المصممة لكريات ال NMs، فقد تكون هناك حاجة إلى قوة طرد مركزي أعلى؛ هذا هو الأكثر احتمالا أن يحدث مع NMs أقل كثافة. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يتم الالتزام بجميع خطوات التصفية في إطار البروتوكول بسبب التجويف الضيق للشعيرات الدموية التي يمكن أن تصبح محظورة بسهولة إذا لم يتم التخلص من أي جسيمات بشكل كاف من العينة.
في حين أن هالة البروتين كانت منطقة مكثفة من البحوث لعدد من السنوات القدرة على الجمع بين ذلك مع هالة المستقلب هو مجال جديد من الاهتمام للعلماء التحقيق في واجهة النانو الحيوي6،14. حتى الآن، ركزت غالبية هذه الدراسات على غير القطبية، جزء الدهون من الهالة المستقلب9،28. هذه الطريقة الحالية تمكن من توصيف الأيض القطبية للغاية والمحملة في الهالة التي تشمل الأيض الهامة المشاركة في استقلاب الطاقة, تحلل, وتوليف الحمض النووي. ونتيجة لذلك ، عندما يقترن سير العمل البروتيوميات ، وصف أكثر شمولية من الهالة الجزيئية الحيوية ممكن. وهذا يتيح تحليلا أكثر تعمقا للتفاعلات الحيوية النانوية للمضي قدما. تمكن هذه الطريقة من تعزيز الرؤى الميكانيكية في الغدد الصماء بوساطة المستقبلات عن طريق التفاعلات البروتينية والمستقلب مع مستقبلات الأغشية. وعلاوة على ذلك، يمكن استكشاف التفاعلات بين وداخل الهالة بين البروتينات والجزيئات الصغيرة؛ على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن البروتينات في الهالة تلعب دورا رئيسيا في تجنيد الأيض15. تجدر الإشارة إلى أن النتائج التمثيلية في الشكل 3 والشكل 4 هي القياس الكمي المطلق للمثيلات ، ومع ذلك ، فإن اتباع نهج غير مستهدف باستخدام تحليل البيانات متعدد المتغيرات لمقارنة جميع ميزات CE-MS في الضوابط مقارنة بالبلازما المكشوفة من شأنه أيضا توضيح ربط المستقلب. وهكذا، هناك مجال كبير للتحقيق في كيفية، والتي، الأيض والبروتينات تؤثر على تجنيد كل منهما في الهالات NM. قد تساعد هذه الدراسات الإضافية في تصميم الهالات لتحسين تسليم الأدوية النانوية أو الكشف عن المزيد من العقبات أمام تطورها مثل قمع العمل الصيدلاني بسبب انسداد الهالة الجزيئية الحيوية أو إخفاء وظائف الاستهداف.
CESI-MS مع معدلات تدفق مقياس النانو من حوالي 20 نانولتر / دقيقة والحد الأدنى من استخدام المذيبات العضوية يقدم تحسنا في أوراق الاعتماد الخضراء والاقتصادية على معيار LC-MS و nanoLC-MS من حيث استخدام المذيبات، والتحديات الرئيسية لدراسات الأيض والبروتيوميات، على التوالي. CESI-MS يقدم نتائج قابلة للاستنساخ للغاية لكل من وقت الهجرة ومنطقة الذروة التي تقارن بشكل إيجابي مع أساليب LC-MS المستندةإلى 11،15. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع نانولك-MS، ترحيل ليست قضية في CESI-MS. لذلك ، لا يلزم تنظيف النظام على نطاق واسع بين تحليلات العينات ، مما يحسن بشكل كبير من إنتاجية العينة11.
وباختصار، فإن سير العمل المقترح هو الأول الذي يفصل نهجا لتوصيف كل من البروتين ومكونات المستقلب للهالة الجزيئية الحيوية الكاملة للNMs. وهذا يفتح جانبا جديدا من التفاعلات الحيوية نانو، هالة المستقلب، وبالتالي تمكين جمع ضعف البيانات من نفس العينة، مما يتيح فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات في واجهة النانو الحيوي.

التفاعلات الحيوية نانو، في واجهة بين الأسطح نانوماتي (NM) والمصفوفات البيولوجية التي من الجزيئات الحيوية الممتز إلى NM، هو مجال مكثف للبحوث التي تقوم عليها السلامة النانوية والطب النانوي1. هذه الطبقة من الجزيئات الحيوية الممتزة تمنح هوية بيولوجية ل NMs ، وبالتالي تحددها الخلايا بأنها "ذاتية" ، مما يؤثر لاحقا على امتصاص الخلايا وتوزيعها ونقاط النهاية البيولوجية2و3و4. وقد ركزت الغالبية العظمى من الدراسات الحيوية نانو على البروتينات داخل الهالة، وأظهرت أن البروتينات تختلف كميا ونوعيا بين NMs من مختلف التراكيب5. يعتمد هذا الاختلاف على خصائص NM مثل الحجم والوظيفية والمواد بالإضافة إلى خصائص المصفوفة البيولوجية بما في ذلك التركيب ومحتوى الملح5. وهناك مجال متزايد من الاهتمام في واجهة بيو نانو هي الأيض التي الممهرة إلى NMs6. وقد أظهرت العديد من الدراسات أنه، كما هو الحال مع البروتينات، خصائص NM هي عامل رئيسي في تحديد تكوين الأيض في الهالة وأنها يمكن أن تؤثر على النتائج البيولوجية للتعرض NM6،7،8.
في دراسات الهالة الجزيئية الحيوية هناك أربع مراحل متميزة لتوصيفها ، وتشكيل الهالة ، وعزل الجزيئات الحيوية داخل الهالة ، واكتشافها عن طريق قياس الطيف الكتلي النوعي أو الكمي وتحديد9. حتى الآن، وقد اعتمدت مجموعة من التقنيات لعزل هالة البروتين بما في ذلك الغليان في SDS-PAGE تشغيل العازلة، واستخراج المذيبات والملح أو الهضم المباشر للبروتينات في الموقع على سطح NMs. من حيث الأيض في الهالة ، والعزلة أكثر تعقيدا مع أساليب مختلفة باستخدام المذيبات أو حتى حل NMs المقترحة كحلول8،10،11. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، من غير المرجح أن ينطبق نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" على عزل المستقلبات من NMs ، بسبب المساحة الكيميائية الواسعة التي يشغلها المستقلب وتنوع NMs المحتملة. وهناك نهج بديل هو توصيف المصفوفة البيولوجية قبل وبعد التعرض NM مع الفرق في تركيزات المستقلب يعزى إلى امتصاص الأيض إلى NMs.
هذا النهج البديل سيكون قابلا للتطبيق على جميع المركبات الحيوية وNMs وعلى الرغم من أنه لا يتطلب ضعف التحليل، فإنه يوفر بالتالي مقياسا أكثر دقة بكثير من هالة المستقلب وليس لديه خطر من انخفاض المستقلب يتعافى من سطح NM يجري مخطئا لربط منخفضة من المستقلب محددة.
الخطوة الثانية لتحليل الهالة الجزيئية الحيوية هي الكشف عن الجزيئات الحيوية. تقليديا للبروتينات في الهالة، وكان هذا اختصاص نانو LC-MS، العمود الفقري للبروتيوميات. كما تم تطبيق أساليب أخرى مثل NMR13و 1D و 2D SDS-PAGE. من حيث الهالة المستقلب LC-MS7, GC-MS8 وقد استخدمت قياس الطيف كتلة التسريب المباشر14. ومع ذلك ، بدأ نهج جديد في الآونة الأخيرة لكسب الجر ، وهي الكهروفلوريس الشعرية - قياس الطيف الكتلي (CE-MS)11،15 وكان موجودا في مختبرات NM كتقنية مستقلة لتوصيف مختلف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للNMs16. CE-MS هو تقنية فصل متعامدة لnanoLC-MS وGC-MS وقادر على تمكين الكشف عن الأيض القطبية للغايةوالمشحنة 17،18. وعلاوة على ذلك، CE-MS هو مناسبة تماما لتحليل البروتينات وتعديلاتها بعد النقل مثل الفوسفور والجليكوزيليشن19،20،21،22. ويمكن تنفيذ الخطوة النهائية وتحديد الهوية وتحليل البيانات بعدة طرق اعتمادا على ما إذا كان يتم استخدام نهج كمي / نوعي أو مستهدف / غير مستهدف ، ومع ذلك ، يقع هذا خارج نطاق هذا البروتوكول.
CESI-MS، وهو مزيج من CE وواجهة nanoESI، هو تقدم حديث في تكنولوجيا CE باستخدام واجهة غمد. وهذا يمكن الاتصال المباشر للتدفق المنخفض للغاية CE (<20 nL/min) بمطياف كتلة عالي الدقة بدون تخفيف ، مما يؤدي إلى تحسن كبير في حساسية الكشف23و24و25. CESI-MS تمكن حجم العينات محدودة (< 10 ميكرولتر) ليتم تحليلها مع الحفاظ على تحليل حساس للغاية26. CESI-MS يقارن أيضا بشكل إيجابي إلى معدل التدفق المنخفض التقليدية نانولك-MS النهج المستخدمة في البروتيوميات وeabolomics من حيث استنساخ27،28، والإنتاجية، وتحمل أكثر مما يجعلها احتمال مثيرة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية كاملة.
لتسليط الضوء على إمكانات CESI-MS لتحليل التفاعلات الحيوية نانو هذا العمل يصف إعداد العينة المطلوبة لعزل الهالة الجزيئية الحيوية NM من عينة البلازما البشرية واحدة بطريقة لتحقيق أقصى قدر من البيانات من كل من البروتين وجوانب المستقلب من هالة NM الجزيئية الحيوية الكاملة. بينما نحن تقرير عن استخدام البلازما البشرية، وهذا البروتوكول يكون مناسبا على قدم المساواة لالسوائل الحيوية الأخرى مثل مصل الدم، كامل الخلايا المتوسطة ثقافة، lysate الخلية، السائل النخاعي أو البول. ثم سيتم وصف تحليلات هذين المكونين (البروتينات والأيض) باستخدام الشعيرات الدموية المحايدة المغلفة CESI للهالة البروتين والشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة العارية لكل من الأيض القيصري والأيوني.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

كان امتصاص الجزيئات الحيوية من المصفوفات البيولوجية المحيطة إلى سطح المواد النانوية (NMs) لتشكيل الهالة موضع اهتمام على مدى العقد الماضي. ينشأ الاهتمام بالواجهة الحيوية النانوية من حقيقة أن الهالة الجزيئية الحيوية تمنح هوية بيولوجية ل NMs وبالتالي تجعل الجسم يحددها على أنها "ذاتية". على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الموجودة في الهالة قادرة على التفاعل مع مستقبلات الأغشية للتأثير على امتصاص الخلايا وأثبتت أن الهالة مسؤولة عن الاتجار الخلوي بالأجهزة NMs وسمية ها في نهاية المطاف. حتى الآن، ركزت معظم الأبحاث على هالة البروتين وتجاهلت الآثار المحتملة للمييضات المدرجة في الهالة أو الآثار التآزرية بين المكونات في الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة. على هذا النحو، يوضح هذا العمل منهجيات لتوصيف كل من مكونات البروتين وال المستقلب من الهالة الجزيئية الحيوية باستخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى ونواتج الأيض بالتوازي. وهذا يشمل هضم على الجسيمات من هالة البروتين مع السطحي المستخدمة لزيادة استعادة البروتين, وتوصيف سلبي للهالة المستقلب من خلال تحليل المصفوفات المستقلب قبل وبعد التعرض NM. يقدم هذا العمل الكهروفورسيس الشعري – قياس الطيف الكتلي (CESI-MS) كتقنية جديدة لتوصيف هالة NM. وتبين البروتوكولات المبينة هنا كيف يمكن استخدام CESI-MS لتوصيف موثوق به لكل من البروتين والهالة المستقلب التي حصلت عليها NMs. الانتقال إلى CESI-MS يقلل بشكل كبير من حجم العينة المطلوبة (مقارنة بالكروماتوغرافيا السائلة التقليدية - نهج قياس الطيف الكتلي (LC-MS) مع حقن متعددة ممكنة من أقل من 5 ميكرولتر من العينة ، مما يجعلها مثالية للعينات المحدودة الحجم. وعلاوة على ذلك، فإن العواقب البيئية للتحليل تنخفض فيما يتعلق بالتصلب المتعدد LC بسبب انخفاض معدلات التدفق (<20 nL/min) في CESI-MS، واستخدام الشوارد المائية التي تلغي الحاجة إلى المذيبات العضوية.

الطريقة الموصوفة هي الأولى التي تميز كل من البروتينات والأيض في هالة الجزيئية الحيوية NM باستخدام نفس عينة البلازما البشرية. هذه الطريقة قادرة على الكشف عن >200 البروتينات ونواتج الأيض >150، وبالتالي تمكين نظرة عامة أشمل من الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي يتعين تحديدها، مما يتيح تعزيز فهم المرفق الخلوي NMs، وامتصاص والآثار.
استخدام CESI-MS لكلا البروتيوميات(الشكل 1)و metabolomics (الشكل 2) الفصل والكشف يظهر نوافذ فصل جيدة على كل من الشعيرات الدموية لكل نهج.
هذه الطريقة قادرة على التمييز بين البروتينات في الهالة عبر مجموعة واسعة من التراكيب NMs، مما يدل على قابلية الأساليب للتطبيق على NMs عبر مجموعة واسعة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية(الجدول 1).
ويمكن أيضا تمييز بصمات الأصابع الفريدة من هالة المستقلب باستخدام الفرع الأيضي لهذه المنهجية(الشكل 3). على الرغم من أن هذا النهج يستخدم نهجا سلبيا لتوصيف هالة الأيض NM أنها لا تزال قادرة على الكشف عن رؤى مثيرة للاهتمام في دور الأيض في الهالة الجزيئية الحيوية مثل الامتزاز التفاضلي للأيزومرات (الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> الشكل 1: تصوير كهربي مثالي لفصل كورونا البروتيني SiO2 باستخدام CESI-MS بعد هضم على الجسيمات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> الشكل 2: مثال على الكتروفيروغرامات الأيونية المستخرجة التي تم الحصول عليها من المركبات الذاتية في البلازما بواسطة CE-MS. المركبات المرقم هي على النحو التالي: 1. Ornithine; 2. ليسين؛ 3. أرجينين; 4. هيستيدين؛ 5. الكرياتين; 6. غليسين; 7. ألانين؛ 8. فالين؛ 9. إيسولوسين; 10. ليوستين; 11. سيرين; 12. ثريونين; 13. الهليون; 14. ميثيونين; 15. الجلوتامين; 16. حمض الغلوتاميك. 17. فينيل-D5-ألانين; 18- فينيل ألانين؛ 19. تيروزين; 20. برولين; 21- ميثيونين سلفون (معيار داخلي). نشرت تحت وصول مفتوح الإبداعية المشاع CC BY الترخيص واستنسخت من تشانغ وآخرون17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تحليل هالة البروتين عبر مجموعة من 6 NMs. خريطة الحرارة لفئات البروتين المحددة على السيليكا (SiO2)،تيتانيا (TiO2)،PVP توج تيتانيا (TiO2-PVP)، dispex توج تيتانيا (TiO2-Dispex)، البوليسترين وكاربوكسيلات البوليسترين NMs. النسب المئوية تشير إلى وفرة البروتينات نسبة إلى إجمالي محتوى البروتين على أساس أعلى 3 الببتيدات وفرة لكل بروتين. وبالنظر إلى الاختلافات التي لوحظت في وفرة النسبية من البروتينات في الهالات NM مختلفة، فمن الواضح أن هذا البروتوكول المقترح حساسة بما فيه الكفاية للتمييز بين هالة البروتين من مختلف NMs. الشكل المستنسخة من تحليل CESI-MS من هالة البروتين، نشرت تحت وصول مفتوح المشاع الإبداعي CC BY ترخيص11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل مستهدف للمييضات cationic في هالة NM. الامتزاز من الكاتيونات إلى SiO2 و TiO2 NMs. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NMs في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض للبوليسترين NMs. تمثل مخططات المربع القيم الدنيا والقصه، والنطاقات الوسيطة والبينية. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة بموجب ترخيص Creative Commons CC BY15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل مستهدف من الأيض الانيوني في هالة NM مع التركيز على الامتزاز الإيزومر. يظهر الامتزاز من أنيونات لمجموعة من الأجهزة التيتانيومية اختلافات واضحة بين ايزوميرات مختلفة مثل فوسفات السكر. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NM في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض لSIO2 والمؤامرات NMs. البوليسترين مربع تمثل القيم الدنيا والقصى، ومتوسط ونطاقات بين الكوارتيل. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة تحت وصول مفتوح الإبداعية المشتركة CC BY ترخيص15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>أنوليت</td>
			<td>متوسط منطقة ذروة RSD</td>
			<td>متوسط وقت ترحيل RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 الببتيدات خلال اليوم (ن = 3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 كاتيون خلال اليوم (ن = 16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cation بين اليوم (ن = 36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: استنساخ النسخ المتماثلة التقنية CESI-MS للببتيدات والأيض cationic. RSD: الانحراف المعياري النسبي، كمقياس للتكرار. إن إمكانية إعادة إنتاج CESI-MS من حيث مناطق الذروة وأوقات الهجرة جيدة جدا ، حيث يكون لدى جميع التحليلات متوسط RSD <15٪ وأوقات الهجرة <2.2٪. وتبين هذه النتائج درجة الثقة العالية التي يمكن أن تعزى إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام هذه التقنية وتؤكد أن الاختلافات المكتشفة ترجع إلى اختلافات حقيقية في تكوين العينة (الإثراء على ال NMs) بدلا من الاختلاف التحليلي. يتم إنشاء الجدول 2 من النتائج المعروضة سابقا11،15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

هنا نقدم بروتوكولا لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة والبروتينات والأيضات ، التي تم الحصول عليها بواسطة المواد النانوية من السوائل الحيوية باستخدام الكهروفلوريس الشعري - نهج قياس الطيف الكتلي.

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

باستخدام شعري الكهربائي لقياس الأحماض العضوية من الأنسجة النباتية: حالة اختبار فحص<em&gt; كافيا ارابيكا</em&gt; بذور

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

مراقبة المخدرات الفائق وشاملة باستخدام مولتيسيجمينت الشعرية حقن التفريد الكتلي

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...