Name: capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

A.J.C, J.A.T og I.L anerkender finansiering fra Europa-Kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z anerkender ph.d.-finansiering fra China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R anerkender den finansielle støtte til Vidi-tilskudsordningen under Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO Vidi 723.0160330).

Brug af human biofluid blev godkendt i henhold til IRB-protokollen retningslinjer fra University of Leiden og Innsbruck Medical University. Når biofluider af mennesker eller dyr undersøges, kræves der etisk godkendelse fra forskningsinstitutionen, og den er opnået i forbindelse med de resultater, der er vist i denne protokol. Desuden bør der også foretages passende rapportering for at sikre gennemsigtighed og genanvendelighed af data i det fremtidige arbejde9,29,30.
1. Forberedelse af baggrundselektrolytter (BGE)
BEMÆRK: Alle opløsningsmidler skal fremstilles i en passende røghætte, og der skal anvendes passende personlige værnemidler til alle trin (labcoat, handsker og beskyttelsesbriller). I hvert trin kræves der lave bindende plastflasker for at minimere analysandtab og kontaminering af prøven med salte udvasket fra glasvarer.
<ol><li>Forbered 10% eddikesyre BGE (v/v), pH 2.2 på daglig basis for metabolomics.<ol>
<li>I en 10 ml målekolbe tilsættes 1 ml eddikesyre efterfulgt af tilsætning af deioniseret (DI) vand til den markerede linje og grundig blanding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered 100 mM eddikesyre, pH 2,9 på daglig basis for proteomics.<ol>
<li>I en 10 ml målekolbe tilsættes 57 μL eddikesyre efterfulgt af tilsætning af DI-vand til den markerede linje og grundig blanding.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM forberedelse
<ol><li>Spred kraftigt NMs i vand ved hjælp af offentliggjorte retningslinjer31,32,33. BEMÆRK: Ved udviklingen af denne protokol blev der anvendt 7 NMs som følger: Henholdsvis 100 og 1.000 nm carboxyleret polystyren blev anvendt til henholdsvis protein og metabolit corona. 100 nm uændret polystyren NMs, 13 nm anatase TiO2 NMs, som var uændret eller belagt med enten polyacrylat eller PVP polymerer og 22 nm uændret SiO2 NMs blev brugt til både protein og metabolit koronaer. Mens metoden blev udviklet og demonstreret ved hjælp af disse NMs, skal det bemærkes, at denne tilgang ville være gældende for en bred vifte af NM kompositioner, størrelser, former og morfologier.</li>
	<li>Karakterisere partikelstørrelse ved hjælp af enten dynamisk lysspredning34,35, enkelt partikelinduktivt koblet plasmamassespektrometri36, nanopartikelsporingsanalyse37eller transmissionselektronmikroskopi og overfladeladning som zetapotentiale ved hjælp af en zeta sizer34.</li>
</ol>3. Biomolekylær koronadannelse
<ol><li>2 mL humant plasma (eller biofluid af valg) opdeles i 1 mL aliquots, en for metabolit og protein korona og den anden for plasmametabolomkarakterisering.</li>
	<li>1 mg/mL NMs i det menneskelige plasma inkuberes i 1 time ved 37 °C, mens der forsigtigt blandes ved 500 omdrejninger i en termomixer. Efter inkubationscentrifuge prøven ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs.</li>
	<li>Indsaml plasma-supernatanten til metabolit-koronaanalyse. Bevar NM-protein corona-komplekset til protein corona karakterisering.</li>
</ol>4. Protein corona isolation
<ol><li>Resuspend NM-protein kompleks (pellet) i 1 mL af 10x PBS Buffer og vortex kraftigt i 2 min for at fjerne ubundne proteiner. PBS-opløsningen centrifuges ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet.</li>
	<li>Resuspend pellet i 1 mL ammonium bicarbonat buffer (ABC) (100 mM, pH 8,0) og vortex kraftigt i 2 min for at fjerne ubundne proteiner og uønskede salte. Centrifuge ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at pellete NMs; fjerne og kassere supernatanten. Gentag dette trin.</li>
	<li>Reducer protein disulfidbindinger ved at opløse NM-proteinpillen i 20 μL ABC-buffer (100 mM pH 8), der indeholder 10 mM dithiotheritol. Reduktionsopløsningen inkuberes i 30 min. ved 56 °C.</li>
	<li>For at fordøje proteiner tilsættes 2 μg sekventeringskvalitet Trypsin til 20 μL ABC indeholdende 0,1% overfladeaktivt middel. Fordøjelsesopløsningen inkuberes i 16 timer ved 37 °C.</li>
	<li>Alkylatprøven ved tilsætning af 20 μL iodoacetamid ved 55 mM i 100 mM ABC og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min.</li>
	<li>Der tilsættes 20 μL på 0,1 M HCl for at kløve overfladeaktivtmidlet og efterlade det i 10 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Berige og afsalt peptider ved hjælp af en C18 pakket afsaltning pipette spids.<ol>
<li>Våd spidsen med 80 μL 0,1% myresyre 50% acetonistril 5 gange, 10 gange udtages og udtages en afsaltprøve ved at skylle 80 μL 0,1 % myresyre 5 gange og udvisker prøven 2 gange med 80 μL 0,1 % myresyre på et rent lavt bindende PCR-rør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prøverne skal lyofiliseres og opbevares ved -20 °C indtil analyse.</li>
</ol>5. Metabolit corona isolation
<ol><li>Kontrolplasmaet og supernatanten fra NM-plasmainkubationen fra trin 3.3 tages på is under prøveforberedelsen.</li>
	<li>Der hældes 50 μL fra hver i separate hætteglas, og 1 ud af 10 fortyndes med DI-vand. Der udtages 50 μL af hver fortyndet prøve, og der flyttes til nye hætteglas til trin 5.3.</li>
	<li>Der tilsættes 200 μL chloroform, 250 μL methanol og 350 μL DI vand og kraftigt vortexblanding i 2 min. Centrifuge i 10 minutter ved 20.800 x g ved 4 °C.</li>
	<li>Der tages 500 μL supernatant, og der filtreres gennem et 3 kDa centrifugalfilter i 2 timer ved 10.000 x g ved 4 °C. Tag 430 μL ultrafiltrer og tør i en hastighed vac. Prøver kan nu fryses inden analyse.</li>
</ol>6. Forberedelse af CESI-MS-system38
BEMÆRK: Før kapillærerne installeres, skal det kontrolleres, at kapillærernes indløbs- og udløbsende er intakte, og at der ikke er synlige brud i kapillæren.
<ol><li>Installation af en neutral belagt kapillær til protein koronaanalyse39.<ol>
<li>Sæt en ny neutral kapillær (90 cm længde med en indvendig diameter på 30 μm) i CESI-instrumentet i henhold til fabrikantens retningslinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af CESI-kapillærer til proteomic analyse.<ol>
<li>Udskyl separationskapillæren i fremadgående retning ved hjælp af 100 mM HCl i 5 min ved 100 psi, og kontroller, om der er dråbedannelse ved kapillærens udløb. Skyl separation kapillær med BGE ved 100 psi i 10 min og derefter DI vand ved 100 psi i 30 min (dette er kun påkrævet for nye kapillærer).</li>
		<li>Skyl både separationskapillæren og den ledende kapillær med BGE ved 90 psi i 5 minutter, og sørg for, at der dannes dråber i udløbsenden af begge kapillærer.</li>
		<li>Skyl separationskapillæren med DI-vand ved 90 psi i 10 minutter, derefter 50 psi i 10 minutter med 0,1 M HCl, efterfulgt igen af 90 psi i 10 minutter med DI-vand og til sidst BGE ved 90 psi i 10 minutter. Par CESI til MS ved hjælp af en nanospray kilde og adapter som tidligere beskrevet38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation af bare smeltet silica kapillær til metabolit koronakarakterisering38.<ol>
<li>En ny bare smeltet silicakapillar (90 cm lang med en indvendig diameter på 30 μm) anbringes i CESI-instrumentet i nedenstående retningslinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af CESI-kapillærer til metabolomics-analyse.<ol>
<li>Væs separationskapillæren i fremadgående retning ved hjælp af 100% MeOH ved 50 psi i 15 minutter, og kontroller, om der er dråbedannelse ved kapillærens udløb. Skyl både separationskapillæren og den ledende kapillær med BGE ved 90 psi i 5 minutter, og sørg for, at der dannes dråber ved udgangen af begge kapillærer.</li>
		<li>Skyl separationskapillæren med DI-vand ved 90 psi i 10 minutter, derefter 50 psi i 10 minutter med 0,1 M NaOH, efterfulgt igen af 90 psi i 10 minutter med DI-vand og til sidst BGE ved 90 psi i 10 minutter. Par CESI til ESI-MS ved hjælp af en nanospraykilde og -adapter som tidligere beskrevet. 38 år
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS til protein corona analyse
<ol><li>Resuspendprøver fra trin 4.8 i 20 μL på 50 mM ammoniumacetat pH 4.0.</li>
	<li>Udfør 5 psi 10 s hydrodynamisk injektion af prøven. Separat ved hjælp af en 30 kV adskillelse spænding med følgende trykgradient: 0-10 min ved 1 psi, 10-35 min ved 1,5 psi og 35-45 min ved 5 psi ved hjælp af 100 mM, pH 2,9 eddikesyre som BGE.</li>
	<li>Opsaml massespektre mellem 250-2000 m/z med top-10 dataafhængig fragmenteringserhvervelse.</li>
	<li>Mellem prøverne skylles kapillær med 0,1 M HCl i 3 min ved 100 psi og 10 min 100 psi BGE for separation kapillær og i 3 min ved 100 psi for den ledende flydende kapillær.</li>
</ol>8. CESI-MS til analyse af metabolit-koronaer
BEMÆRK: Alle prøver skal analyseres to gange, en gang i positiv tilstand til påvisning af kationer og en gang i negativ tilstand til påvisning af anioner. Kontrolplasmaprøverne skal analyseres mindst 5 gange.
<ol><li>Genudnyttede NM-eksponerede og ueksponerede plasmaprøver fra trin 5.4 i 430 μL DI-vand og kraftigt hvirvelstrøm i 2 min. Filter gennem et 0,1 μm membranfilter.</li>
	<li>Der tages 95 μL filtrat, og der tilsættes 5 μL interne standarder ved 200 μM for kationer (L-methioninsulfon) og 400 μM for anioner (2,2,4,4-D4-citronsyre) og hvirvelstrøm. Centrifuge ved 4.000 x g ved 4 °C i 10 minutter før CESI-MS-analyse.</li>
	<li>Prøven indsprøjtes hydrodynamisk i 30 s (kationer) og 40 s (anioner) ved 2 psi.</li>
	<li>Separate metabolitter i 10% eddikesyre med en adskillelsesspænding på 30 kV i fremadgående (kationer) og omvendt (anions) tilstand. Omvendt adskillelsestilstand bistås med 0,5 psi fremadgående tryk på separationskapillæren.</li>
	<li>Indstil massespektrometeret til at indsamle data i positiv (kation) eller negativ (anions) tilstand over masseområdet 65-1000 m/z. Mellem prøverne skylles kapillær med 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI vand og BGE ved 50 psi i 2 min.</li>
</ol>

J.A.T er ansat hos AB Sciex UK Ltd, der deltager som branchepartner på ACEnano-projektet, J.A.T. og alle andre forfattere har ingen interessekonflikt i dette arbejde.

Dette er den første metode, der foreslås for at karakterisere den komplette biomolekylære korona, der indeholder proteiner og metabolitter, fra samme prøve ved hjælp af CESI-MS. Evnen til at karakterisere både proteiner og metabolitter fra samme prøve vil øge mængden af data indsamlet fra en enkelt eksperimentel eksponering betydeligt, hvilket muliggør ny indsigt i koronadannelsesprocessen og dens virkninger for NMs toksicitet og effektivitet som nanomedicin. Desuden er CESI-MS en ideel platform til at karakterisere begge klasser af biomolekyler med blot en ændring af kapillær påkrævet. Fremadrettet vil nye metoder udviklet til ikke-vandig CE gøre det muligt at udføre lipidomics ved hjælp af CE-MS40, så det nu er muligt at analysere proteiner, metabolitter og lipider ved hjælp af en enkelt platform. De nuværende konventionelle tilgange ville kræve to dedikerede LC-MS-platforme, en til protein-corona og en til metabolit-koronaen. Således kan denne tilgang indsamle dobbelt så mange data ved hjælp af en enkelt analytisk platform.
Der er nogle forbehold over for denne tilgang, især med metabolit corona, da denne protokol foreslår en indirekte måling af koronaen. Som sådan kan der opstå problemer, når metabolitniveauerne er til stede ved høje koncentrationer i forhold til NMs, og det efterfølgende fald i metabolitkoncentrationen i matrixen er lille. Men i modsætning til protein corona er det usandsynligt, at en "one size fits all" tilgang til isolering af metabolit corona vil blive udviklet på grund af, at hver NM har unikke overfladekemier. Fremadrettet er det mere sandsynligt, at NM specifikke tilgange til at isolere metabolit corona vil blive udviklet og valideret dog; dette vil kun gælde for den specifikke NM. På trods af dette vil CESI-MS stadig være en yderst velegnet platform til karakterisering af de polære ladede metabolitter, uanset hvordan de isoleres. Det er også bemærkelsesværdigt, at hvis der ikke dannes en pellet under centrifugeringstrinnene, der er designet til at pellete NMs, kan der være behov for en højere centrifugalkraft; Dette vil sandsynligvis ske med mindre tætte NMs. Det er også afgørende, at alle filtreringstrin overholdes i protokollen på grund af kapillærernes smalle boring, som disse let kan blokeres, hvis partikler ikke er blevet tilstrækkeligt fjernet fra prøven.
Mens protein corona har været et intenst forskningsområde i en årrække evnen til at kombinere det med metabolit corona er et nyt interesseområde for forskere, der undersøger bio-nano interface6,14. Til dato har de fleste af disse undersøgelser fokuseret på den ikke-polære, lipidfraktion af metabolitten corona9,28. Denne nuværende metode muliggør karakterisering af de meget polære og ladede metabolitter i koronaen, som omfatter vigtige metabolitter involveret i energimetabolisme, glykolyse og DNA-syntese. Som et resultat, når det kombineres med proteomics-arbejdsgangen, er en mere holistisk karakterisering af den biomolekylære korona mulig. Dette muliggør en mere dybdegående analyse af bio-nano-interaktioner fremadrettet. Denne metode muliggør forbedret mekanistisk indsigt i receptormedieret endokytose via protein- og metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Desuden kan interaktioner mellem proteiner og små molekyler mellem og inden for koronaer undersøges; for eksempel er det for nylig blevet vist, at proteinerne i koronaen spiller en central rolle i rekrutteringen af metabolitter15. Det er værd at bemærke, at de repræsentative resultater i figur 3 og figur 4 er absolut kvantificering af metabolitter, men en ikke-målrettet tilgang ved hjælp af multivariat dataanalyse til sammenligning af alle CE-MS-funktioner i kontroller sammenlignet med eksponeret plasma ville også belyse metabolitbinding. Der er således et betydeligt spillerum til at undersøge, hvordan og hvilke metabolitter og proteiner der påvirker deres respektive rekruttering til NM-coronas. Disse yderligere undersøgelser kan hjælpe med at designe coronas for at optimere leveringen af nanomedicin eller afdække yderligere forhindringer for deres udvikling, såsom undertrykkelse af farmaceutisk handling på grund af den biomolekylære koronablokering eller maskering af målretningsfunktioner.
CESI-MS med sine nanoskalastrømhastigheder på ca. 20 nL/min. og minimal brug af organiske opløsningsmidler giver en forbedring af de grønne og økonomiske akkreditiver i forhold til henholdsvis standard LC-MS og nanoLC-MS med hensyn til anvendelse af opløsningsmidler, de største udfordringer for metabolomics og proteomics-undersøgelser. CESI-MS tilbyder meget reproducerbare resultater for både overflytningstid og spidsbelastningsområde , som sammenligner positivt med LC-MS-baserede metoder11,15. Sammenlignet med nanoLC-MS er fremførsel desuden ikke et problem i CESI-MS. Derfor er der ikke behov for omfattende systemoprydning mellem stikprøveanalyser, hvilket i høj grad forbedrer prøvegennedringshastigheden11.
Sammenfattende er den foreslåede arbejdsgang den første til at specificere en tilgang til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den komplette biomolekylære korona af NMs. Dette låser op for et nyt aspekt af bio-nano-interaktioner, metabolittens korona, hvilket gør det muligt at indsamle dobbelt så mange data fra den samme prøve, hvilket muliggør en mere komplet forståelse af interaktioner på bio-nano-grænsefladen.

Bio-nano-interaktioner på grænsefladen mellem nanomaterialer (NM) overflader og biologiske matricer, hvorfra biomolekyler adsorberes til NM, er et intenst forskningsområde, der understøtter nanosikkerhed og nanomedicin1. Dette lag af adsorberet biomolekyler giver NMs en biologisk identitet, således at celler identificerer dem som "selv", der efterfølgende påvirker cellulær optagelse, distribution og biologiske slutpunkter2,3,4. Langt de fleste bio-nano undersøgelser har fokuseret på proteinerne i koronaen, og har vist, at proteiner varierer kvantitativt og kvalitativt mellem NMs af forskellige sammensætninger5. Denne variation afhænger både af NM's egenskaber, såsom størrelse, funktionalisering og materiale ud over egenskaberne af den biologiske matrix, herunder sammensætning og saltindhold5. Et stigende interesseområde i bio-nano-grænsefladen er de metabolitter, der adsorberer til NMs6. Flere undersøgelser har vist, at NM-egenskaber som med proteinerne er en nøglefaktor til bestemmelse af sammensætningen af metabolitterne i koronaen, og at de kan påvirke biologiske resultater af NM-eksponering6,7,8.
I undersøgelser af den biomolekylære korona er der fire forskellige faser til dens karakterisering, koronadannelse, isolering af biomolekylerne i koronaen, deres detektion via kvalitativ eller kvantitativ massespektrometri og identifikation9. Til dato er der vedtaget en række teknikker til at isolere proteinet korona, herunder kogning i SDS-PAGE kører buffer, opløsningsmiddel og salt ekstraktioner eller direkte fordøjelse af proteiner in situ på overfladen af NMs. Med hensyn til metabolitterne i koronaen er isolationen mere kompleks med forskellige metoder ved hjælp af opløsningsmidler eller endda opløsningen af NMs foreslået somopløsninger 8,10,11. Men i modsætning til proteinet korona en "one size fits all" tilgang er usandsynligt, at gælde for isolering af metabolitter fra NMs, på grund af det brede kemiske rum besat af metabolom og mangfoldigheden af mulige NMs. En alternativ metode er at karakterisere den biologiske matrix før og efter NM-eksponering med forskellen i metabolitkoncentrationer, der tilskrives adsorptionen af metabolitter til NMs.12
Denne alternative tilgang vil finde anvendelse på alle biofluider og NMs, og selv om den kræver dobbelt så meget analyse, giver den derfor et langt mere præcist mål for metabolit-koronaen og har ingen risiko for, at lav metabolitindvinding fra NM-overfladen forveksles med lav binding af den specifikke metabolit.
Det andet trin til den biomolekylære koronaanalyse er påvisning af biomolekylerne. Traditionelt for proteinerne i koronaen har dette været mandatet for nano-LC-MS, proteomics arbejdshest; andre tilgange såsom NMR13, 1D og 2D SDS-PAGE er også blevet anvendt. Med hensyn til metabolit corona LC-MS7, GC-MS8 og direkte infusionsmassespektrometri er blevet udnyttet14. Men en ny tilgang er for nylig begyndt at få trækkraft, nemlig kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS)11,15 og har været til stede i NM labs som en standalone teknik til at karakterisere forskellige fysiske og kemiske egenskaber NMs16. CE-MS er en ortogonal separationsteknik til nanoLC-MS og GC-MS og er i stand til at gøre det muligt at detektere stærkt polære og ladede metabolitter17,18. Ce-MS er desuden velegnet til analyse af proteiner og deres efteroversættende modifikationer såsom fosforylering og glykosylering19,20,21,22. Det sidste trin, identifikation og dataanalyse kan udføres på flere måder afhængigt af, om der anvendes en kvantitativ / kvalitativ eller målrettet / ikke-målrettet tilgang, dette falder dog uden for denne protokols kompetenceområde.
CESI-MS, en kombination af CE og en nanoESI-grænseflade, er et nyligt fremskridt inden for CE-teknologi, der bruger en sheathless-grænseflade. Dette muliggør direkte tilslutning af ULTRA-low flow CE (<20 nL/min) til et massespektrometer med høj opløsning uden fortynding, hvilket resulterer i betydeligt forbedret detektionsfølsomhed23,24,25. CESI-MS gør det muligt at analysere volumenbegrænsede prøver (< 10 μL), samtidig med at der opretholdes en meget følsom analyse26. CESI-MS sammenligner også positivt med traditionelle nanoLC-MS-tilgange med lav strømningshastighed, der anvendes i proteomics og metabolomics med hensyn til reproducerbarhed27,28, gennemløb og overførsel, hvilket gør det til en spændende udsigt til den komplette biomolekylære koronakarakterisering.
For at fremhæve potentialet i CESI-MS til analyser af bio-nano-interaktioner beskriver dette arbejde det prøvepræparat, der kræves for at isolere NM biomolekylær korona fra en enkelt human plasmaprøve på en sådan måde, at data maksimeres fra både protein- og metabolitaspekterne af den komplette biomolekylære NM-korona. Mens vi rapporterer om brugen af humant plasma, vil denne protokol være lige så velegnet til andre biofluider såsom blodserum, komplet cellekultur medium, celle lysat, cerebrospinalvæske eller urin. Analyserne af disse to komponenter (proteiner og metabolitter) vil derefter blive beskrevet ved hjælp af neutrale belagte CESI kapillærer for protein korona og nøgne smeltet silica kapillærer for både kationiske og anioniske metabolitter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Adsorptionen af biomolekyler fra omgivende biologiske matricer til overfladen af nanomaterialer (NMs) for at danne koronaen har været af interesse i det sidste årti. Interessen for bio-nano-grænsefladen skyldes, at den biomolekylære korona giver NMs en biologisk identitet og dermed får kroppen til at identificere dem som "selv". For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at proteinerne i koronaen er i stand til at interagere med membranreceptorer for at påvirke cellulær optagelse og fastslået, at koronaen er ansvarlig for cellulær handel med NMs og deres eventuelle toksicitet. Til dato har de fleste undersøgelser fokuseret på protein-corona og overset de mulige virkninger af metabolitterne, der indgår i koronaen eller synergieffekterne mellem komponenter i den komplette biomolekylære korona. Som sådan demonstrerer dette arbejde metoder til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den biomolekylære korona ved hjælp af bottom-up proteomics og metabolomics tilgange parallelt. Dette omfatter en on-partikel fordøje af proteinet korona med et overfladeaktivt middel, der anvendes til at øge protein opsving, og en passiv karakterisering af metabolit korona ved at analysere metabolit matricer før og efter NM engagementer. Dette arbejde introducerer kapillær elektroforese – massespektrometri (CESI-MS) som en ny teknik til NM koronakarakterisering. De protokoller, der er skitseret her, viser, hvordan CESI-MS kan bruges til pålidelig karakterisering af både protein og metabolit corona erhvervet af NMs. Overgangen til CESI-MS reducerer i høj grad den krævede prøvemængde (sammenlignet med traditionel væskekromatografi – massespektrometri (LC-MS) tilgange) med flere injektioner muligt fra så lidt som 5 μL prøve, hvilket gør det ideelt til volumenbegrænsede prøver. Desuden reduceres de miljømæssige konsekvenser af analysen med hensyn til LC-MS på grund af de lave strømningshastigheder (<20 nL/min) i CESI-MS og brugen af vandige elektrolytter, som eliminerer behovet for organiske opløsningsmidler.

Den beskrevne metode er den første til at karakterisere både proteiner og metabolitter i NM biomolekylær korona ved hjælp af den samme humane plasmaprøve. Denne metode er i stand til at detektere >200 proteiner og >150 metabolitter, hvilket gør det muligt at bestemme det mest omfattende overblik over den komplette biomolekylære korona, hvilket gør det muligt at forbedre forståelsen af NMs cellulære vedhæftede fil, optagelse og virkninger.
Brugen af CESI-MS til både proteomics (Figur 1) og metabolomics (Figur 2) adskillelse og detektion viser gode adskillelsesvinduer på begge kapillærer for hver metode.
Denne metode er i stand til at skelne mellem proteinerne i koronaen på tværs af en lang række NM-sammensætninger, hvilket viser metodernes anvendelighed for NMs på tværs af en bred vifte af fysiske og kemiske egenskaber (Tabel 1).
De unikke fingeraftryk af metabolit-koronaen kan også skelnes ved hjælp af den metabolomiske gren af denne metode (Figur 3). Selv om denne tilgang bruger en passiv tilgang til at karakterisere NM metabolit corona, er den stadig i stand til at afdække interessant indsigt i metabolitternes rolle i den biomolekylære korona, såsom differential adsorption af isomerer (Figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figur 1: Eksemplarisk elektropherogram af en SiO2 protein corona separation ved hjælp af CESI-MS efter en on-partikel fordøje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figur 2: Eksempel på ekstraherede ionelektrografogrammer fremstillet af endogene forbindelser i plasma af CE-MS. De nummererede forbindelser er som følger: 1. Ornitin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6) Glycin; 7. Alanin; 8. Valine; 9. Isoleucin 10. Leucine; 11. Serin; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Methionin; 15. Glutamin 16. Glutamsyre 17. Phenyl-D5-alanin; 18. Phenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Proline; 21. Methionin sulfon (intern standard). Udgivet under en open access Creative Commons CC BY licens og gengivet fra Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: Analyse af protein corona på tværs af en række 6 NMs. Varmekort over proteinklasser identificeret på silica (SiO2), titania (TiO2), PVP udjævnet titania (TiO2-PVP), dispex udjævnet titania (TiO2-Dispex), polystyren og carboxyleret polystyren NMs. Procenter henviser til proteinernes overflod i forhold til det samlede proteinindhold baseret på top 3 peptider overflod for hvert protein. I betragtning af de forskelle, der er observeret i den relative overflod af proteiner i de forskellige NM-koronaer, er det klart, at denne foreslåede protokol er tilstrækkelig følsom til at skelne mellem protein koronaen af forskellige NMs. Figur gengivet fra en CESI-MS-analyse af proteinet korona, offentliggjort under en åben adgang Creative Commons CC BY licens11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figur 3: Målrettet analyse af de kationiske metabolitter i NM-koronaen. Adsorption af kationer til SiO2 og TiO2 NMs. Rød refererer til den oprindelige koncentration af metabolitter, mens blå refererer til koncentrationen af metabolitter efter en 1 h inkubation med NMs ved 37 °C. Reduktionen i metabolitkoncentrationen i opløsningen er et resultat af metabolit adsorption på NM-overfladen. Der blev ikke observeret nogen signifikant adsorption af metabolitter for polystyren-NMs. Kasseplotterne repræsenterer minimums- og maksimumsværdierne, median- og interkvartilområderne. Figur gengivet fra en CESI-MS målrettet analyse af metabolit corona offentliggjort under en open access Creative Commons CC BY licens15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figur 4: Målrettet analyse af anioniske metabolitter i NM-koronaen med fokus på isomer adsorption. Adsorption af anioner til en række titania NMs viser klare forskelle mellem forskellige isomerer såsom sukkerfosfater. Rød refererer til den oprindelige koncentration af metabolitter, mens blå refererer til koncentrationen af metabolitter efter en 1 h inkubation med NM ved 37 °C. Reduktionen i metabolitkoncentrationen i opløsning er et resultat af metabolit adsorption på NM-overfladen. Der blev ikke observeret nogen signifikant adsorption af metabolitter for SiO2 og polystyrenN NMs. Box-plots repræsenterer minimums- og maksimumsværdierne, median- og interkvartilområderne. Figur gengivet fra en CESI-MS målrettet analyse af metabolit corona offentliggjort under en åben adgang Creative Common CC BY licens15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyte</td>
			<td>Gennemsnitligt topareal for RSD</td>
			<td>Gennemsnitlig RSD-overførselstid</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptider intradag (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 kationer intradag (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 kation mellem dagen (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Reproducerbarhed af tekniske replikater fra CESI-MS til peptider og kationiske metabolitter. RSD: relativ standardafvigelse som et mål for reproducerbarhed. Reproducerbarheden af CESI-MS med hensyn til spidsbelastningsområder og migrationstider er meget god, idet alle analysetter har en gennemsnitlig RSD-<15 % og migrationstider <2,2 %. Disse resultater viser den høje grad af tillid, der kan tilskrives de data, der er indsamlet ved hjælp af denne teknik, og bekræfter, at de påviste variationer skyldes reelle forskelle i stikprøvesammensætningen (berigelse af NMs) snarere end analytisk variation. Tabel 2 er udstreret af tidligere11-15resultater .

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Her præsenterer vi en protokol til at karakterisere den komplette biomolekylære korona, proteiner og metabolitter, erhvervet af nanomaterialer fra biofluider ved hjælp af en kapillær elektroforese – massespektrometri tilgang.

Kapillær elektroforese massespektrometri tilgange til karakterisering af protein og metabolit Corona erhvervet af nanomaterialer

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Massespektrometrisk Approaches at studere proteiners struktur og interaktioner i lyofiliserede pulvere

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Brug kapillarelektroforese at kvantificere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøgelse<em&gt; Ægte kaffe</em&gt; Frø

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analyse til kvantificering af værts-celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals af væskekromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time ånde analyse ved hjælp af sekundære Nanoelectrospray ionisering koblet til høj opløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillær elektroforese massespektrometri for encellede Metabolomics i Live Frog (Xenopus laevis) embryoner

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analysere Protein arkitekturer og Protein-Ligand komplekser af Integrativ strukturelle massespektrometri

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Storstilet Top-down Proteomics brug af kapillar Zone elektroforese Tandem massespektrometri

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Høj overførselshastighed og omfattende stof overvågning ved hjælp af Multisegment injektion-kapillær elektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...