Name: capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

A.J.C, J.A.T en I.L erkennen financiering van de Europese Commissie via Horizon 2020-project ACEnano (subsidienr. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkent promotiefinanciering van de China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R erkent de financiële ondersteuning van de Vidi-subsidieregeling van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO Vidi 723.0160330).

Het gebruik van menselijk biofluïdum is goedgekeurd volgens de IRB-protocolrichtlijnen van de Universiteit Leiden en de Innsbruck Medical University. Wanneer menselijke of dierlijke biofluïden worden onderzocht, is ethische goedkeuring van de onderzoeksinstelling vereist en is verkregen in het geval van de resultaten in dit protocol. Voorts dient ook adequate rapportage te worden uitgevoerd om transparantie en herbruikbaarheid van gegevens in toekomstige werkzaamheden9,29,30te waarborgen .
1. Bereiding van achtergrondelektrolyten (BGE)
OPMERKING: Alle oplosmiddelen moeten worden bereid in een geschikte zuurkast en er moeten voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt voor alle stappen (labcoat, handschoenen en veiligheidsbril). In elke stap zijn laagbindende plastic flacons nodig om analytverlies en verontreiniging van het monster met zouten uit glaswerk te minimaliseren.
<ol><li>Bereid dagelijks 10% azijnzuur BGE (v/v), pH 2,2 voor metabolomics.<ol>
<li>Voeg in een maatkolf van 10 ml 1 ml azijnzuur toe, gevolgd door de toevoeging van gedeioneerd (DI) water aan de gemarkeerde lijn en een grondige menging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid dagelijks 100 mM azijnzuur, pH 2,9 voor proteomica.<ol>
<li>Voeg in een maatkolf van 10 ml 57 μL azijnzuur toe, gevolgd door de toevoeging van DI-water aan de gemarkeerde lijn en een grondige menging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM-voorbereiding
<ol><li>Verspreid NMs krachtig in water met behulp van gepubliceerde richtsnoeren31,32,33. OPMERKING: Bij de ontwikkeling van dit protocol werden 7 NMs als volgt gebruikt: 100 en 1.000 nm carboxylated polystyreen werden respectievelijk gebruikt voor eiwit en metaboliet corona. 100 nm ongewijzigde polystyreen NMs, 13 nm anatase TiO2 NMs die ongewijzigd waren of bedekt waren met polyacrylaat of PVP polymeren en 22 nm ongewijzigde SiO2 NMs werden gebruikt voor zowel eiwit- als metaboliet coronas. Hoewel de methode werd ontwikkeld en gedemonstreerd met behulp van deze NMs, moet worden opgemerkt dat deze aanpak van toepassing zou zijn op een breed scala aan NM-composities, -maten, -vormen en -morfologieën.</li>
	<li>Karakteriseer deeltjesgrootte met behulp van dynamische lichtverstrooiing34,35, enkel deeltje inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie36, nanodeeltjesvolganalyse37, of transmissie-elektronenmicroscopie en oppervlaktelading als zetapotentiaal met behulp van een zetagrootter34.</li>
</ol>3. Biomoleculaire coronavorming
<ol><li>Splits 2 ml menselijk plasma (of biofluïdum naar keuze) in 1 ml aliquots, één voor de metaboliet en eiwit corona en de tweede voor plasmametaboloomkarakterisering.</li>
	<li>Incubeer 1 mg/ml NMs in het menselijk plasma gedurende 1 uur bij 37 °C terwijl u voorzichtig mengt bij 500 tpm in een thermomixer. Na incubatie centrifugeert u het monster bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de NMs te pelleteren.</li>
	<li>Verzamel het plasmasupernatant voor metaboliet corona-analyse. Behoud het NM-eiwit corona complex voor eiwit corona karakterisering.</li>
</ol>4. Eiwit corona isolatie
<ol><li>Resuspendeer het NM-eiwitcomplex (de pellet) in 1 ml 10x PBS Buffer en vortex krachtig gedurende 2 minuten om ongebonden eiwitten te verwijderen. Centrifugeer de PBS-oplossing gedurende 15 minuten bij 4 °C op 4.000 x g om de NMs te pelleteren en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumbicarbonaatbuffer (ABC) (100 mM, pH 8.0) en vortex krachtig gedurende 2 minuten om ongebonden eiwitten en ongewenste zouten te verwijderen. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C om de NMs te pelleteren; verwijder en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap.</li>
	<li>Verminder eiwitdisulfidebindingen door de NM-eiwitkorrel op te lossen in 20 μL ABC-buffer (100 mM pH 8) met 10 mM dithiotheritol. Incubeer de reductieoplossing gedurende 30 min bij 56 °C.</li>
	<li>Om eiwitten te verteren, voegt u 2 μg sequencing grade Trypsin toe aan 20 μL ABC met 0,1% oppervlakteactieve stof. Incubeer de digestoplossing gedurende 16 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Alkylaat het monster door toevoeging van 20 μL iodoacetamide bij 55 mM in 100 mM ABC en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Voeg 20 μL 0,1 M HCl toe om de oppervlakteactieve stof te splijten en laat 10 minuten bij kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Verrijk en ontsalt peptiden met behulp van een C18 verpakte ontsalting pipet tip.<ol>
<li>Bevochtig de punt met 80 μL 0,1% mierenzuur 50% acetonitril 5 keer, reinig met 80 μL 0,1% mierenzuur 5 keer, trek en elute monster 10 keer, ontsalt monster door 80 μL 0,1 % mierenzuur 5 keer door te spoelen en elute het monster 2 keer met 80 μL 0,1%</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophiliseer de monsters en bewaar bij -20 °C tot analyse.</li>
</ol>5. Metaboliet corona isolatie
<ol><li>Neem het controleplasma en het supernatant uit de NM-plasma-incubatie uit stap 3.3 en blijf op ijs tijdens de monstervoorbereiding.</li>
	<li>Neem 50 μL van elk in afzonderlijke flacons en verdun 1 op 10 met DI-water. Neem 50 μL van elk verdund monster en ga naar nieuwe flacons voor stap 5.3.</li>
	<li>Voeg 200 μL chloroform, 250 μL methanol en 350 μL DI water en krachtig vortexmengsel toe gedurende 2 min. Centrifugeer gedurende 10 min bij 20.800 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Neem 500 μL supernatant en filtreer gedurende 2 uur bij 10.000 x g bij 4 °C door een 3 kDa centrifugaalfilter. Neem 430 μL ultrafiltratie en droog in een speedvac. Monsters kunnen nu worden ingevroren voordat ze worden geanalyseerd.</li>
</ol>6. Voorbereiding van CESI-MS-systeem38
OPMERKING: Controleer vóór de installatie van de haarvaten of het in- en uitlaatuiteinde van de haarvaten intact zijn en of er geen zichtbare breuken in het haarvat zijn.
<ol><li>Installatie van een neutraal gecoate capillair voor eiwit corona-analyse39.<ol>
<li>Plaats een nieuw neutraal gecoat capillair (90 cm lengte met een inwendige diameter van 30 μm) in het CESI-instrument volgens de richtlijnen van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van CESI-haarvaten voor proteomische analyse.<ol>
<li>Spoel het scheidingscapillair in de voorwaartse richting met 100 mM HCl gedurende 5 minuten bij 100 psi en controleer op druppelvorming aan de uitlaat van het capillair. Spoel scheiding capillair met BGE op 100 psi gedurende 10 min en vervolgens DI water op 100 psi gedurende 30 min (dit is alleen nodig voor nieuwe haarvaten).</li>
		<li>Spoel zowel het scheidingscapillair als het geleidende haarvat gedurende 5 minuten met BGE op 90 psi en zorg ervoor dat er druppels ontstaan aan het uiteinde van beide haarvaten.</li>
		<li>Spoel de scheiding capillair met DI water op 90 psi gedurende 10 min, dan 50 psi voor 10 min met 0.1 M HCl, gevolgd door 90 psi voor 10 min met DI water en tenslotte BGE op 90 psi voor 10 min. Koppel CESI aan de MS met behulp van een nanospraybron en adapter zoals eerder beschreven38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installatie van kale gesmolten silicacapillair voor metaboliet coronakarakterisering38.<ol>
<li>Plaats een nieuw kaal gesmolten silicacapillair (90 cm lengte met een inwendige diameter van 30 μm) in het CESI-instrument volgens de richtlijnen van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van CESI-haarvaten voor metabolomics-analyse.<ol>
<li>Spoel het scheidingscapillair in de voorwaartse richting met 100% MeOH op 50 psi gedurende 15 minuten en controleer op druppelvorming aan de uitlaat van het capillair. Spoel zowel het scheidingscapillair als het geleidende haarvat gedurende 5 minuten met BGE op 90 psi en zorg ervoor dat er druppels ontstaan aan de uitlaat van beide haarvaten.</li>
		<li>Spoel het scheidingscapillair met DI-water op 90 psi gedurende 10 minuten, vervolgens 50 psi gedurende 10 minuten met 0,1 M NaOH, gevolgd door 90 psi gedurende 10 minuten met DI-water en ten slotte BGE bij 90 psi gedurende 10 minuten. Koppel CESI aan de ESI-MS met behulp van een nanospraybron en adapter zoals eerder beschreven. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS voor eiwit corona analyse
<ol><li>Resuspend monsters van stap 4.8 in 20 μL van 50 mM ammoniumacetaat pH 4.0.</li>
	<li>Voer 5 psi 10 s hydrodynamische injectie van monster uit. Scheid met een scheidingsspanning van 30 kV met de volgende drukgradiënt: 0-10 min bij 1 psi, 10-35 min bij 1,5 psi en 35-45 min bij 5 psi bij 100 mM, pH 2,9 azijnzuur als BGE.</li>
	<li>Verzamel massaspectra tussen 250-2000 m/z met top-10 data afhankelijke fragmentatie acquisitie.</li>
	<li>Spoel tussen de monsters capillair met 0,1 M HCl gedurende 3 minuten bij 100 psi en 10 min 100 psi BGE voor scheiding capillair en gedurende 3 min bij 100 psi voor het geleidende vloeibare capillair.</li>
</ol>8. CESI-MS voor metaboliet corona analyse
OPMERKING: Alle monsters moeten tweemaal worden geanalyseerd, eenmaal in de positieve modus voor de detectie van kationen en eenmaal in de negatieve modus voor de detectie van anionen. De controleplasmamonsters moeten minstens 5 keer worden geanalyseerd.
<ol><li>Resuspend NM blootgestelde en onbelichte plasmamonsters van stap 5.4 in 430 μL DI-water en krachtig vortex gedurende 2 min. Filtreer door een membraanfilter van 0,1 μm.</li>
	<li>Neem 95 μL filtraat en voeg 5 μL interne normen toe bij 200 μM voor kationen (L-methioninesulfon) en 400 μM voor anionen (2,2,4,4-D4-citroenzuur) en vortex krachtig. Centrifugeer bij 4.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten voorafgaand aan cesi-MS-analyse.</li>
	<li>Injecteer het monster hydrodynamisch gedurende 30 s (kationen) en 40 s (anionen) bij 2 psi.</li>
	<li>Afzonderlijke metabolieten in 10% azijnzuur met een scheidingsspanning van 30 kV in voorwaartse (kationen) en omgekeerde (anionen) modus. Omgekeerde scheidingsmodus wordt ondersteund met 0,5 psi voorwaartse druk op het scheidingscapillair.</li>
	<li>Stel massaspectrometer in om gegevens te verzamelen in positieve (kationen) of negatieve (anionen) modus over het massabereik 65-1000 m/z. Spoel tussen de monsters capillair met 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI water en BGE met 50 psi gedurende 2 min.</li>
</ol>

J.A.T is een werknemer van AB Sciex UK Ltd die als industriepartner deelneemt aan het ACEnano-project, J.A.T en alle andere auteurs hebben geen belangenverstrengeling in dit werk.

Dit is de eerste methode die wordt voorgesteld om de volledige biomoleculaire corona met eiwitten en metabolieten uit hetzelfde monster te karakteriseren met behulp van CESI-MS. Het vermogen om zowel de eiwitten als metabolieten uit hetzelfde monster te karakteriseren, zal de hoeveelheid gegevens die zijn verzameld uit één experimentele blootstelling aanzienlijk verhogen, waardoor nieuwe inzichten mogelijk worden in het proces van coronavorming en de effecten ervan op de toxiciteit en werkzaamheid van NMs als nanomedicijnen. Bovendien is CESI-MS een ideaal platform om beide klassen van biomoleculen te karakteriseren met slechts een verandering van capillair vereist. In de toekomst zullen nieuwe methoden die zijn ontwikkeld voor niet-waterige CE lipidomics kunnen uitvoeren met BEHULP VAN CE-MS40, dus het is nu mogelijk om eiwitten, metabolieten en lipiden te analyseren met behulp van één platform. De huidige conventionele benaderingen vereisen twee speciale LC-MS-platforms, één voor het eiwit corona en één voor de metaboliet corona. Deze aanpak kan dus twee keer zoveel gegevens verzamelen met behulp van één analytisch platform.
Er zijn enkele kanttekeningen bij deze aanpak, met name bij de metaboliet corona, omdat dit protocol een indirecte meting van de corona voorstelt. Als zodanig kan zich een probleem voordoen wanneer de metabolietniveaus aanwezig zijn in hoge concentraties ten opzichte van de NMs en de daaropvolgende daling van de metabolietconcentratie in de matrix klein is. In tegenstelling tot de eiwit corona is het echter onwaarschijnlijk dat een "one size fits all" benadering van het isoleren van de metaboliet corona zal worden ontwikkeld omdat elke NM unieke oppervlaktechemieën heeft. In de toekomst is het echter waarschijnlijker dat NM-specifieke benaderingen om de metaboliet corona te isoleren zullen worden ontwikkeld en gevalideerd; dit is alleen van toepassing op die specifieke NM. Desondanks zal de CESI-MS nog steeds een zeer geschikt platform zijn voor de karakterisering van de polaire geladen metabolieten, ongeacht hoe ze zijn geïsoleerd. Opmerkelijk is ook dat als er geen pellet ontstaat tijdens de centrifugeerstappen die zijn ontworpen om de NMs te pelleteren, een hogere centrifugaalkracht nodig kan zijn; dit zal waarschijnlijk gebeuren met minder dichte NMs. Het is ook van cruciaal belang dat alle filterstappen binnen het protocol worden nageleefd vanwege de smalle boring van de haarvaten, deze kunnen gemakkelijk worden geblokkeerd als er geen deeltjes voldoende uit het monster zijn verwijderd.
Hoewel het eiwit corona al een aantal jaren een intensief onderzoeksgebiedis,is het vermogen om dat te combineren met de metaboliet corona een nieuw interessegebied voor wetenschappers die de bio-nano-interface6,14onderzoeken . Tot op heden hebben de meeste van deze studies zich gericht op de niet-polaire, lipidefractie van de metaboliet corona9,28. Deze huidige methode maakt de karakterisering mogelijk van de sterk polaire en geladen metabolieten in de corona, waaronder belangrijke metabolieten die betrokken zijn bij energiemetabolisme, glycolyse en DNA-synthese. Hierdoor is, in combinatie met de proteomics workflow, een meer holistische karakterisering van de biomoleculaire corona mogelijk. Dit maakt een meer diepgaande analyse van bio-nano interacties mogelijk. Deze methode maakt verbeterde mechanistische inzichten mogelijk in receptorgemedieerde endocytose via eiwit- en metabolietinteracties met membraanreceptoren. Bovendien kunnen inter- en intra-corona-interacties tussen eiwitten en kleine moleculen worden onderzocht; zo is onlangs aangetoond dat de eiwitten in de corona een sleutelrol spelen bij de rekrutering van metabolieten15. Het is vermeldensgeschikt dat de representatieve resultaten in figuur 3 en figuur 4 absolute kwantificering van metabolieten zijn, maar een niet-gerichte benadering met behulp van multivariate gegevensanalyse om alle CE-MS-kenmerken in controles in vergelijking met blootgesteld plasma te vergelijken, zou ook de binding van metabolieten verduidelijken. Er is dus een aanzienlijke ruimte om te onderzoeken hoe en welke metabolieten en eiwitten hun respectieve rekrutering in NM-coronas beïnvloeden. Deze aanvullende studies kunnen helpen bij het ontwerpen van coronas om de levering van nanomedicijnen te optimaliseren of verdere obstakels voor hun ontwikkeling bloot te leggen, zoals het onderdrukken van farmaceutische actie vanwege de biomoleculaire corona-blokkering of maskeringstargeting-targetingfunctionaliteiten.
CESI-MS met zijn debieten op nanoschaal van ongeveer 20 nL/min en minimaal gebruik van organische oplosmiddelen biedt een verbetering van de groene en economische geloofsbrieven ten opzichte van standaard LC-MS en nanoLC-MS in termen van oplosmiddelgebruik, de belangrijkste uitdagingen voor respectievelijk metabolomics- en proteomicsstudies. CESI-MS biedt zeer reproduceerbare resultaten voor zowel migratietijd als piekgebied die gunstig zijn in vergelijking met lc-ms-gebaseerde methoden11,15. Bovendien is overdracht in vergelijking met nanoLC-MS geen probleem bij CESI-MS. Daarom is een uitgebreide systeemopruiming tussen monsteranalyses niet vereist, wat de monsterdoorvoer aanzienlijk verbetert11.
Samengevat is de voorgestelde workflow de eerste die een aanpak beschrijft om zowel de eiwit- als metabolietcomponenten van de volledige biomoleculaire corona van NMs te karakteriseren. Dit ontgrendelt een nieuw aspect van bio-nano-interacties, de metaboliet corona, waardoor het verzamelen van twee keer zoveel gegevens uit hetzelfde monster mogelijk is, waardoor een vollediger begrip van interacties op de bio-nano-interface mogelijk wordt.

Bio-nano-interacties, op het raakvlak tussen nanomateriaal (NM) oppervlakken en biologische matrices waaruit biomoleculen adsorberen aan de NM, is een intens onderzoeksgebied dat ten grondslag ligt aan nanoveiligheid en nanogeneeskunde1. Deze laag geadsorbeerde biomoleculen verleent een biologische identiteit aan NMs, waardoor cellen ze identificeren als "zelf", wat vervolgens de cellulaire opname, distributie en biologische eindpunten2,3,4beïnvloedt . De overgrote meerderheid van de bio-nano studies hebben zich gericht op de eiwitten in de corona, en hebben aangetoond dat eiwitten kwantitatief en kwalitatief variëren tussen NMs van verschillende samenstellingen5. Deze variatie is afhankelijk van zowel de eigenschappen van de NM zoals grootte, functionalisering en materiaal naast de eigenschappen van de biologische matrix inclusief samenstelling en zoutgehalte5. Een toenemend interessegebied in de bio-nano-interface zijn de metabolieten die adsorberen aan NMs6. Verschillende studies hebben aangetoond dat, net als bij de eiwitten, NM-eigenschappen een belangrijke factor zijn bij het bepalen van de samenstelling van de metabolieten in de corona en dat ze de biologische resultaten van NM-blootstelling6,7,8kunnen beïnvloeden .
In studies van de biomoleculaire corona zijn er vier verschillende fasen aan de karakterisering ervan, coronavorming, de isolatie van de biomoleculen binnen de corona, hun detectie via kwalitatieve of kwantitatieve massaspectrometrie en identificatie9. Tot op heden zijn verschillende technieken toegepast om het eiwit corona te isoleren, waaronder koken in SDS-PAGE lopende buffer-, oplosmiddel- en zoutextracties of directe vertering van eiwitten in situ op het oppervlak van NMs. Wat de metabolieten in de corona betreft , is de isolatie complexer met verschillende methoden met oplosmiddelen of zelfs de ontbinding van de NMs die worden voorgesteld als oplossingen8,10,11. In tegenstelling tot het eiwit corona is het echter onwaarschijnlijk dat een "one size fits all"-benadering van toepassing is op de isolatie van metabolieten van NMs, vanwege de grote chemische ruimte die wordt ingenomen door de metaboloom en de diversiteit van mogelijke NMs. Een alternatieve benadering is om de biologische matrix voor en na nm-blootstelling te karakteriseren met het verschil in metabolietconcentraties toegeschreven aan de adsorptie van metabolieten aan NMs.12
Deze alternatieve benadering zou van toepassing zijn op alle biofluïden en NMs en hoewel er twee keer zoveel analyse voor nodig is, biedt zij bijgevolg een veel nauwkeurigere meting van de corona van metabolieten en bestaat er geen risico dat lage metabolietherstel van het NM-oppervlak wordt verward met een lage binding van de specifieke metaboliet.
De tweede stap naar de biomoleculaire corona analyse is de detectie van de biomoleculen. Traditioneel voor de eiwitten in de corona is dit de taak van nano-LC-MS, het werkpaard van proteomica; andere benaderingen zoals NMR13,1D en 2D SDS-PAGE zijn ook toegepast. In termen van de metaboliet corona LC-MS7, GC-MS8 en directe infusie massaspectrometrie zijn gebruikt14. Een nieuwe aanpak is echter onlangs begonnen tractie te krijgen, namelijk capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS)11,15 en is aanwezig geweest in NM-laboratoria als een op zichzelf staande techniek om verschillende fysische en chemische eigenschappen van NMs16te karakteriseren . CE-MS is een orthogonale scheidingstechniek voor nanoLC-MS en GC-MS en is in staat de detectie van zeer polaire en geladen metabolieten17,18mogelijk te maken . Bovendien is CE-MS zeer geschikt voor de analyse van eiwitten en hun posttranslationele modificaties zoals fosforylering en glycosylatie19,20,21,22. De laatste stap, identificatie en data-analyse kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van of een kwantitatieve / kwalitatieve of gerichte / niet-gerichte aanpak wordt gebruikt, dit valt echter buiten de bevoegdheid van dit protocol.
CESI-MS, een combinatie van CE en een nanoESI-interface, is een recente vooruitgang in CE-technologie met behulp van een schedeloze interface. Dit maakt een directe aansluiting van ultralage debiet CE (<20 nL/min) op een massaspectrometer met hoge resolutie zonder verdunning mogelijk, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde detectiegevoeligheid23,24,25. CESI-MS maakt het mogelijk volumebeleenmonsters (< 10 μL) te analyseren met behoud van een zeer gevoelige analyse26. CESI-MS vergelijkt ook gunstig met traditionele nanoLC-MS-benaderingen met een laag debiet die worden gebruikt in proteomica en metabolomics in termen van reproduceerbaarheid27,28, doorvoer, en dragen over waardoor het een opwindend vooruitzicht is voor de volledige biomoleculaire coronakarakterisering.
Om het potentieel van CESI-MS voor de analyses van bio-nano-interacties te benadrukken, beschrijft dit werk het monsterpreparaat dat nodig is om de NM-biomoleculaire corona te isoleren van één menselijk plasmamonster op een zodanige manier dat de gegevens van zowel de eiwit- als metabolietaspecten van de volledige biomoleculaire NM-corona worden gemaximaliseerd. Hoewel we verslag uitbrengen over het gebruik van menselijk plasma, zou dit protocol even geschikt zijn voor andere biofluïden zoals bloedserum, volledig celkweekmedium, cellysaat, hersenvocht of urine. De analyses van deze twee componenten (eiwitten en metabolieten) zullen vervolgens worden beschreven met behulp van neutraal gecoate CESI-haarvaten voor het eiwit corona en kale gesmolten silicacapillairen voor zowel kationische als anionische metabolieten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

De adsorptie van biomoleculen van omringende biologische matrices naar het oppervlak van nanomaterialen (NMs) om de corona te vormen, is de afgelopen tien jaar van belang geweest. Interesse in de bio-nano interface komt voort uit het feit dat de biomoleculaire corona een biologische identiteit verleent aan NMs en er dus voor zorgt dat het lichaam ze identificeert als "zelf". Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de eiwitten in de corona in staat zijn om te interageren met membraanreceptoren om de cellulaire opname te beïnvloeden en hebben vastgesteld dat de corona verantwoordelijk is voor cellulaire handel in NMs en hun uiteindelijke toxiciteit. Tot op heden heeft het meeste onderzoek zich gericht op het eiwit corona en de mogelijke effecten van de metabolieten in de corona of synergetische effecten tussen componenten in de volledige biomoleculaire corona over het hoofd gezien. Als zodanig toont dit werk methodologieën aan om zowel de eiwit- als metabolietcomponenten van de biomoleculaire corona te karakteriseren met behulp van bottom-up proteomics en metabolomics benaderingen parallel. Dit omvat een on-particle digest van het eiwit corona met een oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om het eiwitherstel te verhogen, en een passieve karakterisering van de metaboliet corona door metabolietmatrices voor en na NM-blootstellingen te analyseren. Dit werk introduceert capillaire elektroforese – massaspectrometrie (CESI-MS) als een nieuwe techniek voor NM corona karakterisering. De hier beschreven protocollen laten zien hoe CESI-MS kan worden gebruikt voor de betrouwbare karakterisering van zowel het eiwit als de metaboliet corona die door NMs zijn verworven. De overgang naar CESI-MS vermindert het vereiste volume van het monster aanzienlijk (in vergelijking met traditionele vloeistofchromatografie - massaspectrometrie (LC-MS) benaderingen) met meerdere injecties mogelijk vanaf slechts 5 μL monster, waardoor het ideaal is voor volumebeleenmonsters. Bovendien worden de milieugevolgen van de analyse verminderd ten opzichte van LC-MS als gevolg van de lage debieten (<20 nL/min) bij CESI-MS en het gebruik van waterige elektrolyten, waardoor organische oplosmiddelen niet meer nodig zijn.

De beschreven methode is de eerste die zowel de eiwitten als metabolieten in de NM biomoleculaire corona karakteriseert met behulp van hetzelfde menselijke plasmamonster. Deze methode is in staat om >200 eiwitten en >150 metabolieten te detecteren, waardoor het meest uitgebreide overzicht van de volledige biomoleculaire corona kan worden bepaald, waardoor een beter begrip van NMs cellulaire gehechtheid, opname en effecten mogelijk wordt.
Het gebruik van CESI-MS voor zowel proteomica (figuur 1) als metabolomica (figuur 2) scheiding en detectie toont goede scheidingsvensters op beide haarvaten voor elke benadering.
Deze methode is in staat om onderscheid te maken tussen de eiwitten in de corona in een breed scala van NMs-samenstellingen, waardoor de toepasbaarheid van de methoden op NMs in een breed scala van fysische en chemische kenmerken wordt aangetoond (Tabel 1).
De unieke vingerafdrukken van de metaboliet corona kunnen ook worden onderscheiden met behulp van de metabolomische tak van deze methodologie (Figuur 3). Hoewel deze benadering een passieve benadering gebruikt om de NM-metaboliet corona te karakteriseren, is het nog steeds in staat om interessante inzichten te ontdekken in de rol van metabolieten in de biomoleculaire corona, zoals de differentiële adsorptie van isomeren (Figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figuur 1: Voorbeeld elektroferogram van een SiO2 eiwit corona scheiding met behulp van CESI-MS na een on-particle digest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbeeld van geëxtraheerde ionenelektroferogrammen verkregen uit endogene verbindingen in plasma door CE-MS. De genummerde verbindingen zijn als volgt: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginine; 4. Histidine; 5. Creatine; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucine; 10. Leucine; 11. Serine; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Methionine; 15. Glutamine; 16. Glutaminezuur; 17. Fenyl-D5-alanine; 18. Fenylalanine; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Methioninesulfon (interne standaard). Gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie en gereproduceerd uit Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Tabel 1: Analyse van eiwit corona over een array van 6 NMs. Hittekaart van eiwitklassen geïdentificeerd op silica (SiO2),titania (TiO2), PVP-afgedekte titania (TiO2-PVP), dispex capped titania (TiO2-Dispex), polystyreen en carboxylated polystyreen NMs. Percentages hebben betrekking op de overvloed van de eiwitten ten opzichte van het totale eiwitgehalte op basis van de top 3 peptiden overvloed voor elk eiwit. Gezien de verschillen waargenomen in de relatieve overvloed aan eiwitten in de verschillende NM-coronas, is het duidelijk dat dit voorgestelde protocol voldoende gevoelig is om onderscheid te maken tussen de eiwit corona van verschillende NMs. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS analyse van het eiwit corona, gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figuur 3: Gerichte analyse van de kationische metabolieten in de NM corona. Adsorptie van kationen op SiO2 en TiO2 NMs. Rood verwijst naar de initiële concentratie van metabolieten, terwijl blauw verwijst naar de concentratie metabolieten na een incubatie van 1 uur met de NMs bij 37 °C. De verlaging van de metabolietconcentratie in de oplossing is het gevolg van adsorptie van metabolieten op het NM-oppervlak. Er werd geen significante adsorptie van metabolieten waargenomen voor de polystyreen NMs. Boxplots vertegenwoordigen de minimum- en maximumwaarden, mediaan- en interkwartielbereiken. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS gerichte analyse van de metaboliet corona gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figuur 4: Gerichte analyse van de anionische metabolieten in de NM corona met een focus op isomeer adsorptie. Adsorptie van anionen op een reeks titania NMs vertoont duidelijke verschillen tussen verschillende isomeren zoals de suikerfosfaten. Rood verwijst naar de initiële concentratie metabolieten, terwijl blauw verwijst naar de concentratie metabolieten na een incubatietijd van 1 uur met nm bij 37 °C. De verlaging van de metabolietconcentratie in oplossing is het gevolg van adsorptie van metabolieten op het NM-oppervlak. Er werd geen significante adsorptie van metabolieten waargenomen voor de SiO2 en de polystyreen NMs. Boxplots vertegenwoordigen de minimum- en maximumwaarden, mediaan- en interkwartielbereiken. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS gerichte analyse van de metaboliet corona gepubliceerd onder een open access Creative Common CC BY licentie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyt</td>
			<td>Gemiddeld RSD-piekgebied</td>
			<td>Gemiddelde RSD-migratietijd</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptiden intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 kationen intra-dag (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 kationen inter-dag (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Reproduceerbaarheid van technische replica's van CESI-MS voor peptiden en kationische metabolieten. RSD: relatieve standaardafwijking, als maat voor reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van CESI-MS in termen van piekgebieden en migratietijden is zeer goed, met alle analyten met een gemiddelde RSD-<15% en migratietijden < 2,2%. Deze resultaten tonen de hoge mate van vertrouwen aan die kan worden toegeschreven aan de gegevens die met deze techniek worden verzameld en bevestigen dat de gedetecteerde variaties te wijten zijn aan echte verschillen in steekproefsamenstelling (verrijking op NMs) in plaats van analytische variatie. Tabel 2 wordt gegenereerd op basis van eerder gepresenteerde resultaten11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Hier presenteren we een protocol om de volledige biomoleculaire corona, eiwitten en metabolieten te karakteriseren, verkregen door nanomaterialen uit biofluïden met behulp van een capillaire elektroforese - massaspectrometriebenadering.

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Zaden

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...