Name: capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

A.J.C, J.A.T och I.L bekräftar finansiering från Europeiska kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Bidrag nr. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkänner doktorsfinansiering från China Scholarship Council (CSC, nr 201507060011). R.R erkänner det ekonomiska stödet från Vidis bidragssystem från Den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO Vidi 723.0160330).

Användning av human biofluid godkändes enligt IRB-protokollriktlinjerna från University of Leiden och Innsbruck Medical University. När biofluider från människor eller djur undersöks krävs etiskt godkännande från forskningsinstitutionen och har erhållits om resultaten framgår av detta protokoll. Dessutom bör lämplig rapportering också utföras för att säkerställa insyn och återanvändbarhet av uppgifter i framtida arbete9,29,30.
1. Beredning av bakgrundselektrolyter (BGE)
OBS: Alla lösningsmedel ska beredas i en lämplig rökhuva och lämplig personlig skyddsutrustning måste användas för alla steg (labcoat, handskar och skyddsglasögon). I varje steg krävs lågbindande plastflaskor för att minimera antåförlust och kontaminering av prov med salter som utlakats från glas.
<ol><li>Förbered 10% ättiksyra BGE (v/v), pH 2.2 dagligen för metabolomik.<ol>
<li>Tillsätt 1 ml ättiksyra i en 10 ml mätkolv, följt av tillsats av avjoniserat (DI) vatten till den markerade linjen och noggrann blandning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered 100 mM ättiksyra, pH 2,9 dagligen för proteomik.<ol>
<li>Tillsätt 57 μL ättiksyra i en volymetrisk kolv på 10 ml, följt av tillsats av DI-vatten till den markerade linjen och noggrann blandning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM-förberedelse
<ol><li>Sprid NMs kraftigt i vatten med hjälp av publicerade riktlinjer31,32,33. OBS: I utvecklingen av detta protokoll användes 7 NMs enligt följande: 100 och 1,000 nm karboxylerad polystyren användes för protein och metabolit corona, respektive. 100 nm omodifierade polystyren NMs, 13 nm anatas TiO2 NMs som var oförändrade eller belagda med antingen polyakrylat eller PVP polymerer och 22 nm omodifierade SiO2 NMs användes för både protein och metabolit koronor. Metoden utvecklades och demonstrerades med hjälp av dessa NMs, men det bör noteras att detta tillvägagångssätt skulle tillämpas för ett brett spektrum av NM-kompositioner, storlekar, former och morfologier.</li>
	<li>Karakterisera partikelstorleken med antingen dynamiskt ljusspridning34,35, en partikel induktivt kopplade plasmamasspektrometri36, nanopartikelspårningsanalys37, eller transmissionselektronmikroskopi och ytladdning som zetapotential med hjälp av en zeta sizer34.</li>
</ol>3. Biomolekylär coronabildning
<ol><li>Dela 2 ml human plasma (eller biofluidval) i 1 ml alikvoter, en för metabolit- och proteinnatron och den andra för plasmametabolomkarakterisering.</li>
	<li>Inkubera 1 mg/ml NMs i humanplasma i 1 timme vid 37 °C samtidigt som du försiktigt blandar vid 500 varv/min i en termomixer. Efter inkubation centrifug provet vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs.</li>
	<li>Samla plasma supernatant för metabolit corona analys. Behåll NM-protein coronakomplexet för protein corona karakterisering.</li>
</ol>4. Protein corona isolering
<ol><li>Återanvänd NM-proteinkomplexet (pelleten) i 1 ml 10x PBS-buffert och virvel kraftigt i 2 minuter för att avlägsna obundna proteiner. Centrifugera PBS-lösningen vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs och ta försiktigt bort supernaten utan att störa pelleten.</li>
	<li>Återanvänd pelleten i 1 ml ammoniumbikarbonatbuffert (ABC) (100 mM, pH 8,0) och virvel kraftigt i 2 minuter för att avlägsna obundna proteiner och oönskade salter. Centrifugera vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs. ta bort och kassera supernaten. Upprepa det här steget.</li>
	<li>Minska proteindisulfidbindningarna genom att lösa upp NM-proteinpelleten i 20 μL ABC-buffert (100 mM pH 8) som innehåller 10 mM dithiotheritol. Inkubera reduktionslösningen i 30 min vid 56 °C.</li>
	<li>För att smälta proteiner, tillsätt 2 μg sekvenseringsgrad Trypsin till 20 μL ABC som innehåller 0,1% tensid. Inkubera smältlösningen i 16 timmar vid 37 °C.</li>
	<li>Alkylera provet genom tillsats av 20 μL jodacetamid vid 55 mM i 100 mM ABC och inkubera vid rumstemperatur i 20 min.</li>
	<li>Tillsätt 20 μL 0,1 M HCl för att klyva tensiden och låt den vara i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Berika och desaltpeptider med en C18-packad avsaltningspipettspets.<ol>
<li>Blöt spetsen med 80 μL 0,1% myrsyra 50% acetonitril 5 gånger, rengör med 80 μL 0,1% myrsyra 5 gånger, dra upp och eluera prov 10 gånger, desaltprov genom att spola 80 μL 0,1 % myrsyra 5 gånger och eluera provet 2 gånger med 80 μL 0,1% myrsyra 70% acetonitril till ett rent lågbindande PCR-rör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyofilisera proverna och förvara vid -20 °C tills analysen.</li>
</ol>5. Metabolit coronaisolering
<ol><li>Ta kontrollplasman och supernatanten från NM plasmainkubation från steg 3.3 och håll på is under provberedningen.</li>
	<li>Ta 50 μL från var och en till separata injektionsflaskar och späd 1 av 10 med DI-vatten. Ta 50 μL av varje utspädd prov och flytta till nya injektionsflaskar för steg 5.3.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL kloroform, 250 μL metanol och 350 μL DI-vatten och virvelblandning kraftigt i 2 minuter. Centrifugera i 10 min vid 20 800 x g vid 4 °C.</li>
	<li>Ta 500 μL supernatant och filtrera genom ett 3 kDa centrifugalfilter i 2 timmar vid 10 000 x g vid 4 °C. Ta 430 μL ultrafiltrat och torka i en hastighetsvacka. Proverna kan nu frysas före analys.</li>
</ol>6. Utarbetande av CESI-MS-system38
OBS: Innan kapillärerna installeras, kontrollera att kapillärens inlopps- och utloppsslut är intakta och att det inte finns några synliga brott i kapillären.
<ol><li>Installation av neutralbelagd kapillär för protein coronaanalys39.<ol>
<li>Placera en ny neutralbelagd kapillär (90 cm lång med 30 μm innerdiameter) i CESI-instrumentet enligt tillverkarens riktlinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förberedelse av CESI kapillärer för proteomisk analys.<ol>
<li>Spola separationskapilleriet i framåtriktad riktning med 100 mM HCl i 5 min vid 100 psi och kontrollera om droppformationen finns vid kapillärens utlopp. Spola separationskapilleriet med BGE vid 100 psi i 10 min och sedan DI-vatten vid 100 psi i 30 min (detta krävs endast för nya kapillärer).</li>
		<li>Spola både separationskapilleriet och den ledande kapillären med BGE vid 90 psi i 5 min och se till att droppar bildas vid utloppsslutet på båda kapillärerna.</li>
		<li>Spola separationskapilleriet med DI-vatten vid 90 psi i 10 min, sedan 50 psi i 10 min med 0,1 M HCl, följt av 90 psi i 10 min med DI-vatten och slutligen BGE vid 90 psi i 10 min. Koppla CESI till MS med hjälp av en nanospraykälla och adapter enligt tidigare beskrivet38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation av bar smält kiseldioxid kapillär för metabolit koronar karakterisering38.<ol>
<li>Placera en ny kal smält kiseldioxidkapär (90 cm lång med en innerdiameter på 30 μm) i CESI-instrumentet enligt tillverkarens riktlinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beredning av CESI kapillärer för metabolomik analys.<ol>
<li>Spola separationskapilleriet i framåtriktad riktning med 100% MeOH vid 50 psi i 15 min och kontrollera om droppformationen vid kapillärens utlopp. Spola både separationskapilleriet och den ledande kapillären med BGE vid 90 psi i 5 minuter och se till att droppar bildas vid utloppet av båda kapillärerna.</li>
		<li>Spola separationskapilleriet med DI-vatten vid 90 psi i 10 min, sedan 50 psi i 10 min med 0,1 M NaOH, följt igen med 90 psi i 10 min med DI-vatten och slutligen BGE vid 90 psi i 10 min. Koppla CESI till ESI-MS med hjälp av en nanospraykälla och adapter som tidigare beskrivits. 38 (38)
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS för protein coronaanalys
<ol><li>Återanvända prover från steg 4,8 i 20 μL på 50 mM ammoniumacetat pH 4,0.</li>
	<li>Utför 5 psi 10 s hydrodynamisk injektion av provet. Separera med en 30 kV separationsspänning med följande tryckgradient: 0-10 min vid 1 psi, 10-35 min vid 1,5 psi och 35-45 min vid 5 psi med 100 mM, pH 2,9 ättiksyra som BGE.</li>
	<li>Samla in masspektra mellan 250-2000 m/z med topp-10 databeroende fragmenteringsförvärv.</li>
	<li>Skölj kapillären med 0,1 M HCl i 3 min vid 100 psi och 10 min 100 psi BGE för separationskapilleri och i 3 min vid 100 psi för den ledande flytande kapillären.</li>
</ol>8. CESI-MS för metabolit coronaanalys
OBS: Alla prover måste analyseras två gånger, en gång i positivt läge för detektion av cations och en gång i negativt läge för detektion av anjoner. Kontrollplasmaproverna måste analyseras minst 5 gånger.
<ol><li>Återanvända NM-exponerade och oexponerade plasmaprover från steg 5,4 i 430 μL DI-vatten och kraftigt virvel i 2 minuter. Filtrera genom ett 0,1 μm membranfilter.</li>
	<li>Ta 95 μL filtrat och tillsätt 5 μL interna standarder vid 200 μM för cations (L-metioninsulfon) och 400 μM för anjoner (2,2,4,4-D4-citronsyra) och virvel kraftigt. Centrifugera vid 4 000 x g vid 4 °C i 10 minuter före CESI-MS-analys.</li>
	<li>Injicera provet hydrodynamiskt i 30 s (cations) och 40 s (anjoner) vid 2 psi.</li>
	<li>Separera metaboliter i 10% ättiksyra med en separationsspänning på 30 kV framåt (cations) och omvänd (anjon) läge. Omvänd separationsläge assisteras med 0,5 psi framåttryck på separations kapillären.</li>
	<li>Ställ in masspektrometern för att samla in data i positivt (cations) eller negativt (anjon) läge över massområdet 65-1000 m/z. Skölj kapillären med 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI-vatten och BGE i 50 psi i 2 minuter mellan proverna.</li>
</ol>

J.A.T är anställd på AB Sciex UK Ltd som deltar som branschpartner i ACEnano-projektet, J.A.T och alla andra författare har ingen intressekonflikt i detta arbete.

Detta är den första metoden som föreslås för att karakterisera den fullständiga biomolekylära koronan som innehåller proteiner och metaboliter, från samma prov, med CESI-MS. Förmågan att karakterisera både proteiner och metaboliter från samma prov kommer att avsevärt öka mängden data som samlas in från en enda experimentell exponering som möjliggör nya insikter om processen för koronanbildning och dess effekter för NMs toxicitet och effekt som nanomediciner. Dessutom är CESI-MS en idealisk plattform för att karakterisera båda klasserna av biomolekyler med bara en förändring av kapillären som krävs. Framöver kommer nya metoder som utvecklats för icke-vattenhaltiga CE att göra det möjligt att utföra lipidomics med CE-MS40, vilket innebär att det nu är möjligt att analysera proteiner, metaboliter och lipider med hjälp av en enda plattform. De nuvarande konventionella metoderna skulle kräva två dedikerade LC-MS-plattformar, en för proteinet koronan och en för metaboliten corona. Således kan detta tillvägagångssätt samla in dubbelt så mycket data med hjälp av en enda analysplattform.
Det finns vissa varningar till detta tillvägagångssätt, särskilt med metaboliten corona eftersom detta protokoll föreslår en indirekt mätning av corona. Som sådan kan problem uppstå när metabolitnivåerna finns vid höga koncentrationer i förhållande till NMs och den efterföljande minskningen av metabolitkoncentrationen i matrisen är liten. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en "en storlek passar alla" -metoden för att isolera metaboliten koronan kommer att utvecklas på grund av att varje NM har unika ytkemier. Framöver är det mer troligt att NM-specifika metoder för att isolera metaboliten corona kommer att utvecklas och valideras. Detta kommer endast att gälla för det specifika NM. Trots detta kommer CESI-MS fortfarande att vara en mycket lämplig plattform för karakterisering av de polära laddade metaboliterna oavsett hur de isoleras. Det är också anmärkningsvärt att om en pellet inte bildas under centrifuugeringsstegen som är utformade för att pelleta NMs, kan en högre centrifugalkraft krävas. Detta är mest sannolikt att inträffa med mindre täta NMs. Det är också viktigt att alla filtreringssteg följs inom protokollet på grund av kapillärens smala borrhål, dessa kan lätt blockeras om något partiklar inte har eliminerats tillräckligt från provet.
Medan protein corona har varit ett intensivt forskningsområde under ett antal år förmågan att kombinera det med metaboliten corona är ett nytt intresseområde för forskare som undersöker bionanogränssnittet6,14. Hittills har majoriteten av dessa studier fokuserat på den icke-polära, lipidfraktionen av metaboliten corona9,28. Denna nuvarande metod möjliggör karakterisering av de mycket polära och laddade metaboliterna i koronan som inkluderar viktiga metaboliter involverade i energimetabolism, glykolys och DNA-syntes. Som ett resultat, i kombination med proteomics arbetsflöde, är en mer holistisk karakterisering av biomolekylär corona möjligt. Detta möjliggör en mer djupgående analys av bionanointeraktioner framöver. Denna metod möjliggör förbättrade mekanistiska insikter i receptormedierad endocytos via protein- och metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Dessutom kan interaktioner mellan och intra corona mellan proteiner och små molekyler utforskas. till exempel har det nyligen visat sig att proteinerna i corona spelar en nyckelroll i rekryteringen av metaboliter15. Det är värt att notera att de representativa resultaten i figur 3 och figur 4 är absolut kvantifiering av metaboliter, men ett oföränderligt tillvägagångssätt med hjälp av multivariat dataanalys för att jämföra alla CE-MS-funktioner i kontroller jämfört med exponerad plasma skulle också klargöra metabolitbindning. Det finns således ett betydande utrymme för att undersöka hur, och vilka, metaboliter och proteiner påverkar deras respektive rekrytering till NM-koronor. Dessa ytterligare studier kan hjälpa till att utforma koronor för att optimera leveransen av nanomediciner eller avslöja ytterligare hinder för deras utveckling, såsom undertryckande av farmaceutisk verkan på grund av biomolekylär coronablockering eller maskering av inriktningsfunktioner.
CESI-MS med sina nanovågsflöden på cirka 20 nL/min och minimal användning av organiska lösningsmedel ger en förbättring av gröna och ekonomiska referenser jämfört med standard LC-MS och nanoLC-MS när det gäller lösningsmedelsanvändning, de största utmaningarna för metabolomik respektive proteomikstudier. CESI-MS erbjuder mycket reproducerbara resultat för både migreringstid och toppområde som kan jämföras med LC-MS-baserademetoder 11,15. Jämfört med nanoLC-MS är överföring inte heller ett problem i CESI-MS. Därför krävs inte omfattande systemrensning mellan provanalyser, vilket avsevärt förbättrar provgenomströmningen11.
Sammanfattningsvis är det föreslagna arbetsflödet det första som beskriver ett tillvägagångssätt för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den fullständiga biomolekylära koronan hos NMs. Detta låser upp en ny aspekt av bionanointeraktioner, metaboliten koronan, vilket möjliggör insamling av dubbelt så mycket data från samma prov, vilket möjliggör en mer fullständig förståelse av interaktioner vid bionanogränssnittet.

Bionanointeraktioner, i gränslandet mellan nanomaterial (NM) ytor och biologiska matriser från vilka biomolekyler adsorberar till NM, är ett intensivt forskningsområde som ligger till grund för nanosäkerhet och nanomedicin1. Detta lager av adsorberade biomolekyler ger NMs en biologisk identitet, vilket innebär att celler identifierar dem som "jag", vilket senare påverkar cellulärt upptag, distribution och biologiska slutpunkter2,3,4. De allra flesta bionanostudier har fokuserat på proteinerna i koronan och har visat att proteinerna varierar kvantitativt och kvalitativt mellan NMs av olikasammansättningar 5. Denna variation är beroende av både nm:s egenskaper, såsom storlek, funktionalisering och material utöver egenskaperna hos den biologiska matrisen inklusive komposition och saltinnehåll5. Ett växande intresseområde för bionanogränssnittet är de metaboliter som adsorberas till NMs6. Flera studier har visat att NM-egenskaper, som med proteinerna, är en nyckelfaktor för att bestämma sammansättningen av metaboliterna i koronan och att de kan påverka biologiska resultat avNM-exponering 6,7,8.
I studier av den biomolekylära koronan finns det fyra distinkta faser till dess karakterisering, koronabildning, isoleringen av biomolekylerna i koronan, deras upptäckt via kvalitativ eller kvantitativ masspektrometri och identifiering9. Hittills har en rad tekniker antagits för att isolera proteinet corona inklusive kokning i SDS-PAGE löpande buffert, lösningsmedel och saltextraktion eller direkt matsmältning av proteiner på plats på ytan av NMs. När det gäller metaboliterna i koronan är isoleringen mer komplex med olika metoder med lösningsmedel eller till och med upplösningen av de NMs som föreslås somlösningar 8,10,11. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en "en storlek passar alla" -metoden kommer att tillämpas på isolering av metaboliter från NMs, på grund av det breda kemiska utrymmet som upptas av metabolomen och mångfalden av möjliga NMs. Ett alternativt tillvägagångssätt är att karakterisera den biologiska matrisen före och efter NM-exponeringen med skillnaden i metabolitkoncentrationer som tillskrivs adsorptionen av metaboliter till NMs.
Detta alternativa tillvägagångssätt skulle vara tillämpligt på alla biofluider och NMs och även om det kräver dubbelt så mycket analys, erbjuder det följaktligen ett mycket mer exakt mått på metaboliten korona och har ingen risk för att låga metaboliter återhämtar sig från NM-ytan misstas för låg bindning av den specifika metaboliten.
Det andra steget i den biomolekylära coronaanalysen är upptäckten av biomolekylerna. Traditionellt för proteinerna i koronan har detta varit ett ansvarsområde för nano-LC-MS, proteomikens arbetshäst; Andra tillvägagångssätt som NMR13,1D och 2D SDS-PAGE har också tillämpats. När det gäller metaboliten koronar LC-MS7,GC-MS8 och direkt infusion massa spektrometri har använts14. Ett nytt tillvägagångssätt har dock nyligen börjat få dragkraft, nämligen kapillärelektrometri-masspektrometri (CE-MS)11,15 och har funnits i NM-laboratorier som en fristående teknik för att karakterisera olika fysiska och kemiska egenskaper hos NMs16. CE-MS är en orthogonal separationsteknik till nanoLC-MS och GC-MS och kan möjliggöra detektering av högpolära och laddade metaboliter17,18. Dessutom är CE-MS väl lämpad för analys av proteiner och deras posttranslational modifieringar såsom fosforylering och glykosylering19,20,21,22. Det sista steget, identifiering och dataanalys kan utföras på flera sätt beroende på om en kvantitativ / kvalitativ eller riktad / obelaget metod används, detta faller dock utanför detta protokolls ansvarsområde.
CESI-MS, en kombination av CE och ett nanoESI-gränssnitt, är ett nytt framsteg inom CE-teknik som använder ett mantningslöst gränssnitt. Detta möjliggör direktanslutning av ultralågflödes-CE (<20 nL/min) till en högupplöst masspektrometer utan utspädning, vilket resulterar i avsevärt förbättrad detektionskänslighet23,24,25. CESI-MS gör det möjligt att analysera volymbegränsade prover (< 10 μL) samtidigt som en mycket känslig analys26 bibehålls. CESI-MS jämför också positivt med traditionella nanoLC-MS-metoder med lågt flöde som används inom proteomik och metabolomik när det gäller reproducerbarhet27,28,genomströmning och överföring vilket gör det till en spännande utsikt för den kompletta biomolekylära coronakarakteriseringen.
För att belysa CESI-MS:s potential för analyser av bionanointeraktioner beskriver detta arbete det provpreparat som krävs för att isolera NM biomolekylär korona från ett enda humant plasmaprov på ett sådant sätt att data maximeras från både protein- och metabolitaspekterna av den fullständiga biomolekylära NM-koronan. Medan vi rapporterar om användningen av human plasma, detta protokoll skulle vara lika lämpligt för andra biofluider såsom blodserum, komplett cellkultur medium, cell lysat, ryggmärgsvätska eller urin. Analyserna av dessa två komponenter (proteiner och metaboliter) kommer sedan att beskrivas med neutralbelagda CESI-kapillärer för proteinet korona och kala smälta kiseldioxid kapillärer för både katjoniska och anjoniska metaboliter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Adsorptionen av biomolekyler från omgivande biologiska matriser till ytan av nanomaterial (NMs) för att bilda corona har varit av intresse under det senaste decenniet. Intresset för bionanogränssnittet beror på att den biomolekylära koronan ger NMs en biologisk identitet och därmed får kroppen att identifiera dem som "jag". Tidigare studier har till exempel visat att proteinerna i koronan kan interagera med membranreceptorer för att påverka cellulärt upptag och konstaterat att koronan är ansvarig för cellulär handel med NMs och deras eventuella toxicitet. Hittills har de flesta forskning fokuserat på proteinet corona och förbisett de möjliga effekterna av de metaboliter som ingår i koronan eller synergistiska effekter mellan komponenter i den kompletta biomolekylära koronan. Som sådan visar detta arbete metoder för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den biomolekylära koronan med hjälp av bottom-up proteomik och metabolomik närmar sig parallellt. Detta inkluderar en partikelsammanfattning av proteinet corona med ett tensid som används för att öka proteinåtervinningen och en passiv karakterisering av metaboliten koronan genom att analysera metabolitmatriser före och efter NM-exponeringar. Detta arbete introducerar kapillärelektrofores – masspektrometri (CESI-MS) som en ny teknik för NM-koronarkarakterisering. De protokoll som beskrivs här visar hur CESI-MS kan användas för tillförlitlig karakterisering av både proteinet och metaboliten corona som förvärvats av NMs. Flytten till CESI-MS minskar kraftigt den mängd prov som krävs (jämfört med traditionell vätskekromatografi – masspektrometri (LC-MS) med flera injektioner möjliga från så lite som 5 μL prov, vilket gör det idealiskt för volymbegränsade prover. Dessutom minskas analysernas miljökonsekvenser med avseende på LC-MS på grund av de låga flödeshastigheterna (<20 nL/min) i CESI-MS och användningen av vattenhaltiga elektrolyter som eliminerar behovet av organiska lösningsmedel.

Den beskrivna metoden är den första som karakteriserar både proteiner och metaboliter i NM biomolekylär korona med samma mänskliga plasmaprov. Denna metod kan upptäcka >200-proteiner och >150-metaboliter, vilket gör det möjligt att bestämma den mest omfattande översikten över den fullständiga biomolekylära koronan, vilket möjliggör ökad förståelse för NMs cellulära fastsättning, upptag och stötar.
Användningen av CESI-MS för både proteomik(figur 1)och metabolomik(figur 2)separation och detektion visar bra separationsfönster på båda kapillärerna för varje inflygning.
Denna metod kan skilja mellan proteinerna i koronan över ett brett spektrum av NMs-kompositioner, vilket visar metodernas tillämplighet på NMs över ett brett spektrum av fysiska och kemiska egenskaper (tabell 1).
De unika fingeravtrycken från metaboliten koronan kan också särskiljas med hjälp av den metabolomiska grenen av denna metod (figur 3). Även om detta tillvägagångssätt använder ett passivt tillvägagångssätt för att karakterisera NM-metaboliten corona kan det fortfarande avslöja intressanta insikter om metaboliternas roll i den biomolekylära koronan som differential adsorption av isomerer (Figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figur 1: Exempel på elektrosfärogram av en SiO2-protein coronaseparation med CESI-MS efter en partikelsammanfattning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figur 2: Exempel på extraherade jonelektrosfärogram erhållna från endogena föreningar i plasma från CE-MS. De numrerade föreningarna är följande: 1. Ornitin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanine; 8. Valine, 9. Isoleucin; 10. Leucin; 11. Serine, 12. Treonin; 13. Sparris. 14. Metionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsyra; 17. Fenyl-D5-alanin; 18. Fenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Proline; 21. Metioninsulfon (intern standard). Publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens och reproducerad från Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Tabell 1: Analys av protein koronan över en rad 6 NMs. Värmekarta över proteinklasser som identifierats på kiseldioxid (SiO2),titania (TiO2),PVP-kapsejsad titania (TiO2-PVP), dispex-täckta titania (TiO2-Dispex), polystyren och karboxylerade polystyren-NMs. Procentsatser avser proteinets överflöd i förhållande till den totala proteinhalten baserat på topp 3-peptider överflöd för varje protein. Med tanke på de skillnader som observerats i de relativa överflöden av proteiner i de olika NM-koronanerna är det uppenbart att detta föreslagna protokoll är tillräckligt känsligt för att skilja mellan protein corona hos olika NMs. Figur reproducerad från en CESI-MS-analys av proteinet corona, publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figur 3: Riktad analys av katjonmetaboliterna i NM-koronan. Adsorption av cations till SiO2 och TiO2 NMs. Röd avser den ursprungliga koncentrationen av metaboliter medan blått avser koncentrationen av metaboliter efter en 1 h inkubation med NMs vid 37 °C. Minskningen av metabolitkoncentrationen i lösningen är ett resultat av metabolit adsorption till NM-ytan. Ingen signifikant adsorption av metaboliter observerades för polystyren NMs. Box-diagram representerar minimi- och maximivärden, median- och interkvartilintervall. Figur reproducerad från en CESI-MS riktad analys av metaboliten corona publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figur 4: Riktad analys av de anjoniska metaboliterna i NM-koronan med fokus på isomer-adsorption. Adsorption av anjoner till en rad olika titania-NMs visar tydliga skillnader mellan olika isomerer som sockerfosfater. Rött avser den ursprungliga koncentrationen av metaboliter medan blått avser koncentrationen av metaboliter efter en inkubation på 1 timme med NM vid 37 °C. Minskningen av metabolitkoncentrationen i lösningen är ett resultat av metabolit adsorption till NM-ytan. Ingen signifikant adsorption av metaboliter observerades för SiO2 och polystyren-NMs. Box-diagram representerar minimi- och maximivärden, median- och interkvartilintervall. Figur reproducerad från en CESI-MS riktad analys av metaboliten corona publicerad under en open access Creative Common CC BY-licens15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyte (analyte)</td>
			<td>Genomsnittligt RSD-toppområde</td>
			<td>Genomsnittlig RSD-migreringstid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptider intradag 1928 (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations intra-day (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 katjoner inter-day (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Reproducerbarhet av CESI-MS tekniska replikat för peptider och katjonmetaboliter. RSD: relativ standardavvikelse, som ett mått på reproducerbarhet. Cesi-MS reproducerbarhet när det gäller toppområden och migrationstider är mycket bra, med alla analyter som har en genomsnittlig RSD-<15% och migrationstider <2,2%. Dessa resultat visar den höga grad av förtroende som kan hänföras till de data som samlas in med hjälp av denna teknik och bekräftar att upptäckta variationer beror på verkliga skillnader i provsammansättning (anrikning på NMs) snarare än analytisk variation. Tabell 2 genereras från resultat som tidigarepresenterats 11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Här presenterar vi ett protokoll för att karakterisera den kompletta biomolekylära koronan, proteiner och metaboliter, förvärvade av nanomaterial från biofluider med hjälp av en kapillärelektrofores - masspektrometrimetod.

Kapillärelektrofores masspektrometri metoder för karakterisering av protein och metabolit korona förvärvas av nanomaterial

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysera Protein Dynamics Använda Hydrogen Exchange masspektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Masspektrometrisk Approaches att studera protein struktur och interaktioner i frystorkad Pulver

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Använda kapillärelektrofores att kvantifiera organiska syror från växtvävnad: ett pilotfall Undersöka<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Frön

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

En HS-MRM analysmetod för kvantifiering av värdcellen proteiner i Protein Biopharmaceuticals genom vätskekromatografi Ion rörlighet QTOF masspektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Realtid andedräkt analys med hjälp av sekundära Nanoelectrospray jonisering kopplat till hög upplösning masspektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillärelektrofores Mass Spectrometry för Single-cell metabolomik i Live groda (Xenopus laevis) embryon

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Analysera Protein arkitekturer och Protein-Ligand komplex av integrativ strukturella masspektrometri

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Storskaliga Top-down proteomik med kapillära zonen elektrofores Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Hög genomströmning och omfattande drog övervakning med Multisegment injektion-kapillär elektrofores masspektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...