Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Denne forskning blev delvist støttet af NIH's intramurale forskningsprogram, herunder National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfraskrivelse: NIH, dets officerer og medarbejdere anbefaler eller godkender ikke noget firma, produkt eller service.

BEMÆRK: Figur 1 giver et overblik over flowcytometriprotokollen.
1) Fremstilling af reagens
<ol><li>Forbered medier til fortynding af enzymer og til vævskultur.<ol><li>Tilsæt 5 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) bufferopløsning i 500 ml RPMI-medium og ryst godt. Opbevar substratet ved 4 °C indtil yderligere brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Beregn volumenet af enzymopløsningen. BEMÆRK: Volumenet af enzymopløsningen er volumenet af med...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Denne gennemgang beskriver en detaljeret metode til isolering af celler fra biomaterialeimplantater for at opnå en ensartet cellesuspension. Derudover er der tilvejebragt en detaljeret protokol til farvning af cellesuspensionen til flerfarvet flowcytometri sammen med trinene til konfiguration af et flowcytometer for optimale resultater. Celleisoleringsmetoder kan involvere flere trin, ofte ved hjælp af manuel vævsdissektion efterfulgt af enzymatisk fordøjelse med proteolytiske enzymer for at dissociere den ekstracell...

Fremskridt inden for medicin har ført til hyppig brug af implanterede materialer til støtte for funktionen eller genvæksten af beskadiget væv 1,2. Disse omfatter enheder såsom pacemakere, rekonstruktive kosmetiske implantater og ortopædiske plader, der anvendes til knoglefrakturfiksering 3,4. Imidlertid spiller de materialer, der bruges til at fremstille disse implantater, og de steder, hvor de implanteres, vigtige roller i bestemmelsen af succesen med disse implantater 5,6,7. Som fremmedlegemer kan disse implantater generere et immunrespons fra værten, der enten kan føre til afvisning eller tolerance8. Denne faktor har drevet biomaterialeforskning til at generere materialer, der kan tiltrække det ønskede immunrespons efter implantation 9,10,11,12.
Immunresponset er et væsentligt krav inden for regenerativ medicin, hvor et væv eller et organ dyrkes omkring et biomaterialeskelet (stillads) i et laboratorium til udskiftning af et beskadiget væv eller organ13,14,15,16. I regenerativ medicin er målet at erstatte manglende eller beskadiget væv ved brug af celler, signaler og stilladser, som hver især kan moduleres kraftigt af immunresponser17. Selv når der ønskes manglende immunrespons, er det desuden meget sjældent et fravær af immunaktivitet snarere end tilstedeværelsen af en regulatorisk profil, der ønskes18. Teknikker som flowcytometri kan spille en væsentlig rolle i karakteriseringen af mønsteret af immunrespons på forskellige biomaterialer, der anvendes til belægning af implantatanordninger eller til udvikling af stilladser til vævsteknik19.
Disse oplysninger vil igen i sidste ende hjælpe med at udvikle biomaterialer til implantater, der kan tolereres godt af immunsystemet eller udvikle stilladser, der kan spille en konstruktiv rolle i vævsteknik. Korrekt forberedelse af prøver til analyse ved flowcytometri er et vigtigt skridt for at undgå unøjagtige resultater i immunkarakterisering via fluorescensaktiveret cellesortering20,21. Derfor præsenterer denne gennemgang en detaljeret metode, der kan bruges til isolering af celler fra stilladsvæv, farvning af cellesuspensionen og analyse ved flowcytometri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Succesen med at implantere laboratoriedyrket væv eller medicinsk udstyr hos et individ er underlagt modtagerværtens immunrespons. I betragtning af et implantat som fremmedlegeme kan et fjendtligt og dysreguleret immunrespons resultere i afvisning af implantatet, mens et reguleret respons og genvinding af homeostase kan føre til dets accept. Analyse af mikromiljøerne af implantater dissekeret under in vivo eller ex vivo indstillinger kan hjælpe med at forstå mønsteret af immunrespons, som i sidste ende kan hjælpe med at udvikle nye generationer af biomaterialer. Flowcytometri er en velkendt teknik til karakterisering af immunceller og deres undergrupper baseret på deres celleoverflademarkører. Denne gennemgang beskriver en protokol baseret på manuel terning, enzymatisk fordøjelse og filtrering gennem en cellesi til isolering af ensartede cellesuspensioner fra dissekeret implantatvæv. Yderligere er en flerfarvet flowcytometrifarvningsprotokol blevet forklaret sammen med trin til indledende cytometerindstillinger for at karakterisere og kvantificere disse isolerede celler ved flowcytometri.

Processen med udvikling af flowcytometripaneler til immunanalyse er ofte afhængig af sammenligning af resultater med eksisterende data og litteraturen på området. Viden om, hvordan populationer kan præsentere i flowcytometri, er afgørende for korrekt fortolkning af data. Uanset hvad kan populationer og celletyper forekomme forskelligt i forskellige væv, så der kan forventes en vis variation. I forbindelse med veldefinerede kontrolvæv kan en sådan farvningsoptimering evalueres mod...

Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Isolering af celler fra dissekerede implantater og deres karakterisering ved flowcytometri kan bidrage væsentligt til at forstå mønsteret af immunrespons mod implantater. Dette papir beskriver en præcis metode til isolering af celler fra dissekerede implantater og deres farvning til flowcytometrisk analyse.

Højdimensionalitetsflowcytometri til immunfunktionsanalyse af dissekeret implantatvæv

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Denne protokol kan hjælpe os med at karakterisere værtens immunrespons mod forskellige biomaterialer, som efterfølgende kan hjælpe med at designe bedre fremtidige medicinske implantater. Flowcytometri giver os information om immunceller, der infiltrerer et biomateriale, hvilket hjælper os med at bestemme mekanismer for, hvordan celler reagerer på skade og materialeimplantation samt mål for forbedret terapi. Den samme protokol kan ændres for at karakterisere immunrespons i forskellige indstillinger.Dissekere quadmusklen hos mus, der modtog et ECM-implantat for en uge siden og opsamlet i et 50 ml rør indeholdende fem milliliter serumfrie medier. Endelig terninger vævet ved hjælp af en saks. Derefter tilsættes fem milliliter fordøjelsesenzymmedier til røret.Anbring røret indeholdende fordøjelsesmedier og ternede væv i en rystende inkubator i 45 minutter ved 37 grader Celsius og 100 RPM. Ved afslutningen af inkubationen filtreres den fordøjede vævssuspension gennem en 70 mikron sil ind i et individuelt 50 ml rør. Brug et fem milliliter sprøjtehoved til at mose enhver fast del af væv og vask silen med stuetemperatur PBS.Kassér eventuelle resterende rester i silen, og juster rørets volumen til 50 ml med stuetemperatur PBS. Saml cellerne ved centrifugering og resuspender pellets i 10 ml kold fem millimolær EDTA-opløsning i PBS. Hvis blodlegemer er til stede i prøven, resuspenderes pellet i en milliliter RBC-lysebuffer, inkuberes i 10 minutter og tilsættes derefter ni ml EDTA.Lad suspensionen stå på is i 10 minutter. Juster derefter lydstyrken til 50 ml med kold PBS. Opsaml cellerne ved centrifugering og resuspender pellets og 100 mikroliter kold PBS.Overfør 10 mikroliter suspension til individuelle mikrocentrifugerør og bland med 10 mikroliter trip og blå til tælling. Fordel det resterende volumen af celler i hver brønd i en V bund 96 brøndplade. Fjern 20 mikroliter celler fra brønden og tilsæt dem i en ny brønd til brug som ufarvet kontrol.Brug derefter PBS til at bringe det endelige volumen i hver brønd til 200 mikroliter. Saml cellerne i bunden af pladebrøndene ved centrifugering og resuspender cellerne i 100 mikroliter af en til 1000 koncentration af levedygtighedsfarve pr. Brønd. Ved afslutningen af inkubationen vaskes hver brønd med 100 mikroliter frisk PBS og resuspenderes pellets i 200 mikroliter farvningsbuffer pr. Brønd.Efter den anden centrifugering resuspenderes cellerne i 50 mikroliter af en til 100 fortynding af monocytblokker. Inkuber cellesuspensionen i fem minutter på is og tilsæt derefter 50 mikroliter antistofcocktail. Inkuber i 30 minutter på is beskyttet mod lys.Vask derefter brøndene med 100 mikroliter farvningsbuffer pr. Brønd. Centrifuger cellerne igen og vask med 200 mikroliter farvningsbuffer. Gentag processen to gange mere efterfulgt af resuspendering af cellerne i 400 mikroliter farvningsbuffer.Før du analyserer prøven, skal du køre en ufarvet prøve for at tillade, at cellepopulationen justeres på en sidespredning versus et fremadrettet spredningsplot. Kør derefter den farvede prøve. Uddrag den autofluorescerende signatur.Importer derefter FCS-filerne for at bruge dem som et kontrolelement til unmixing. Klik på unmixing-ikonet for at åbne unmixing-guiden og udføre unmixing ved hjælp af alle enkeltfarvekontroller ved at gating de positive og negative populationer. Klik derefter på QC-sektionen og se på kompleksitetsindekset.Kompleksitetsindekset er et mål for, hvor skelnelig en samling spektrale signaturer er, når spektralsignaturerne er ublandede sammen. Til sidst skal du fjerne blandingen af prøven ved at klikke på live unmix. Her kan resultaterne af en 14 farve fakta om kontrol musevæv observeres.I denne analyse kunne flere lobbyistpopulationer, såsom ly6g-positive neutrofiler og ly6c-medium og høje ekspressive monocytklasser observeres. CD11c højt MHC to positive dendritiske celler var let synlige, når de var lukket mod CD11b for at udelukke makrofager og andre myeloide afstamningsceller såsom neutrofiler og monocytter. En delmængde af CD206-positive CD86-positive dendritiske celler kunne identificeres ved at fokusere på denne CD11c-positive population, som omfatter både CD86 høj M1 som dendritiske celler og CD206 høj M2 som dendritiske cellepopulationer.F4/80 viste en gradient af ekspression, som det almindeligvis observeres i forskellige makrofagpopulationer. Siglec-F var til stede på både F4-80 positive og negative populationer, sandsynligvis svarende til henholdsvis en makrofagundergruppe og eosinofiler. Selvom farvning med celleoverflademarkører gør det muligt at foretage disse betegnelser for celletyper, er det vigtigt at bemærke, at celler, der udtrykker forskellige markører, skal ses på en funktionel måde i modsætning til en mere binær klassificering.Når du forsøger denne protokol, skal du huske på, at forståelse af den autofluorescerende signatur af dine underfarvede prøver, før du designer dit panel, er nøglen til at opnå en bedre og blanding. Udover at analysere celler kan de isolerede celler sorteres i specifikke populationer til nedstrøms evalueringer med cellulære assays, in vitro, transkriptomisk analyse eller til mikroskopisk analyse for at evaluere cellulær morfologi. Stigende kompleksitet af flowcytometrianalyser af biomaterialer hjælper med at bygge bro mellem grundlæggende immunologistudier og konstruktion af nye behandlinger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field Fluorescent Microscopy og Fluorescerende Imaging Flowcytometri på en Cell-telefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Følsomme Påvisning af Proteopathic Seeding Aktivitet med FRET flowcytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering af primære murin retinalganglionceller (RGC&#39;er) ved flowcytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Påvisning af kræft i æggestokkene ved hjælp af foto akustisk flow cytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriske og magnetiske feltenheder til stimulering af biologisk væv

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...