Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH, waaronder het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Disclaimer: De NIH, haar functionarissen en werknemers bevelen geen enkel bedrijf, product of dienst aan of onderschrijven het.

OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van het flowcytometrieprotocol.
1) Bereiding van reagens
<ol><li>Bereid media voor op het verdunnen van enzymen en voor weefselkweek.<ol><li>Voeg 5 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)-bufferoplossing toe aan 500 ml RPMI-medium en schud goed. Bewaar het medium bij 4 °C tot verder gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereken het volume van de enzymoplossing. OPMERKING: Het volume van de enzymoplossing is...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Deze review beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van cellen uit biomateriaalimplantaten om een uniforme celsuspensie te verkrijgen. Daarnaast is er een gedetailleerd protocol voor het kleuren van de celsuspensie voor meerkleurige flowcytometrie, samen met de stappen voor het configureren van een flowcytometer voor optimale resultaten. Celisolatiemethoden kunnen meerdere stappen omvatten, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van handmatige weefseldissectie gevolgd door enzymatische vertering met prot...

Vooruitgang op het gebied van de geneeskunde heeft geleid tot het veelvuldig gebruik van geïmplanteerde materialen ter ondersteuning van de functie of hergroei van beschadigd weefsel 1,2. Deze omvatten apparaten zoals pacemakers, reconstructieve cosmetische implantaten en orthopedische platen die worden gebruikt voor fixatie van botbreuken 3,4. De materialen die worden gebruikt om deze implantaten te maken en de locaties waar ze worden geïmplanteerd, spelen echter een belangrijke rol bij het bepalen van het succes van deze implantaten 5,6,7. Als vreemde lichamen kunnen deze implantaten een immuunrespons van de gastheer opwekken die kan leiden tot afstoting of tolerantie8. Deze factor heeft biomateriaalonderzoek ertoe aangezet materialen te genereren die de gewenste immuunrespons kunnen aantrekken na implantatie 9,10,11,12.
De immuunrespons is een essentiële vereiste op het gebied van regeneratieve geneeskunde, waarbij in een laboratorium een weefsel of een orgaan wordt gekweekt rond een biomateriaalskelet (steiger) voor de vervanging van een beschadigd weefsel of orgaan13,14,15,16. In de regeneratieve geneeskunde is het doel om ontbrekend of beschadigd weefsel te vervangen door het gebruik van cellen, signalen en steigers, die elk sterk kunnen worden gemoduleerd door immuunresponsen17. Bovendien, zelfs wanneer een gebrek aan immuunrespons gewenst is, is het zeer zelden een afwezigheid van immuunactiviteit in plaats van de aanwezigheid van een regulerend profiel dat gewenst is18. Technieken zoals flowcytometrie kunnen een belangrijke rol spelen bij het karakteriseren van het patroon van immuunrespons op verschillende biomaterialen die worden gebruikt voor het coaten van implantaten of voor het ontwikkelen van steigers voor weefselmanipulatie19.
Deze informatie zal op zijn beurt uiteindelijk helpen bij het ontwikkelen van biomaterialen voor implantaten die goed kunnen worden verdragen door het immuunsysteem of bij het ontwikkelen van steigers die een constructieve rol kunnen spelen bij tissue engineering. Een goede voorbereiding van monsters voor analyse door middel van flowcytometrie is een belangrijke stap om onnauwkeurige resultaten bij immuunkarakterisering via fluorescentie-geactiveerde celsorteringte voorkomen 20,21. Daarom presenteert deze review een gedetailleerde methodologie die kan worden gebruikt voor de isolatie van cellen uit steigerweefsel, het kleuren van de celsuspensie en analyse door middel van flowcytometrie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Het succes van het implanteren van in het laboratorium gekweekt weefsel of een medisch hulpmiddel bij een persoon is afhankelijk van de immuunrespons van de ontvangende gastheer. Als een implantaat als een vreemd lichaam wordt beschouwd, kan een vijandige en ontregelde immuunrespons leiden tot de afstoting van het implantaat, terwijl een gereguleerde respons en het herwinnen van homeostase kan leiden tot de acceptatie ervan. Het analyseren van de micro-omgevingen van implantaten die zijn ontleed onder in vivo of ex vivo settings kan helpen bij het begrijpen van het patroon van immuunrespons, wat uiteindelijk kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe generaties biomaterialen. Flowcytometrie is een bekende techniek voor het karakteriseren van immuuncellen en hun subsets op basis van hun markers op het celoppervlak. Deze review beschrijft een protocol gebaseerd op handmatige dobbelstenen, enzymatische vertering en filtratie door een celzeef voor de isolatie van uniforme celsuspensies uit ontleed implantaatweefsel. Verder is een meerkleurig flowcytometriekleuringsprotocol uitgelegd, samen met stappen voor initiële cytometerinstellingen om deze geïsoleerde cellen te karakteriseren en te kwantificeren door middel van flowcytometrie.

Het proces van ontwikkeling van flowcytometriepanels voor immuunanalyse is vaak afhankelijk van de vergelijking van resultaten met bestaande gegevens en de literatuur in het veld. Kennis van hoe populaties zich kunnen presenteren in flowcytometrie is van cruciaal belang voor een goede interpretatie van gegevens. Hoe dan ook, populaties en celtypen kunnen er in verschillende weefsels anders uitzien, dus enige variabiliteit is te verwachten. In de context van goed gedefinieerde controleweef...

Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Dit protocol kan ons helpen bij het karakteriseren van de immuunrespons van de gastheer tegen verschillende biomaterialen, wat vervolgens kan helpen bij het ontwerpen van betere toekomstige medische implantaten. Flowcytometrie geeft ons informatie over immuuncellen die een biomateriaal infiltreren, wat ons helpt mechanismen te bepalen van hoe cellen reageren op verwonding en materiaalimplantatie, evenals doelen voor verbeterde therapieën. Hetzelfde protocol kan worden aangepast om de immuunrespons in verschillende omgevingen te karakteriseren.Ontleed de quad-spier van muizen die een week geleden een ECM-implantaat hebben gekregen en zijn verzameld in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter serumvrije media. Snijd ten slotte het weefsel in blokjes met een schaar. Voeg vervolgens vijf milliliter spijsverteringsenzymmedia toe aan de buis.Plaats de buis met spijsverteringsmedia en in blokjes gesneden weefsels gedurende 45 minuten in een schudincubator bij 37 graden Celsius en 100 RPM. Filtreer aan het einde van de incubatie de verteerde weefselsuspensie door een zeef van 70 micron in een individuele buis van 50 milliliter. Gebruik een spuitkop van vijf milliliter om een vast stuk tissues te pureren en was de zeef met PBS op kamertemperatuur.Gooi eventuele resterende resten in de zeef weg en pas het volume van de buis aan tot 50 milliliter met PBS op kamertemperatuur. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellets in 10 milliliter koude EDTA-oplossing van vijf millimolaire in PBS. Als er bloedcellen in het monster aanwezig zijn, resuspendeer de pellet dan in één milliliter RBC-lysisbuffer, incubeer gedurende 10 minuten en voeg vervolgens negen milliliter EDTA toe.Laat de suspensie 10 minuten op ijs staan. Pas vervolgens het volume aan tot 50 milliliter met koude PBS. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellets en 100 microliter koude PBS.Breng 10 microliter van de suspensie over in individuele microcentrifugebuisjes en meng met 10 microliter trip en blauw om te tellen. Doseer het resterende volume cellen in elk putje van een V-bodem met 96 putjes. Verwijder 20 microliter cellen uit het putje en voeg ze toe aan een nieuw putje om te gebruiken als ongekleurde controle.Gebruik vervolgens PBS om het uiteindelijke volume in elk putje op 200 microliter te brengen. Verzamel de cellen op de bodem van de plaatputjes door centrifugeren en resuspendeer de cellen in 100 microliter van een concentratie van één tot 1000 levensvatbaarheidskleurstof per putje. Was aan het einde van de incubatie elk putje met 100 microliter vers PBS en resuspendeer de pellets in 200 microliter kleurbuffer per putje.Na de tweede centrifugatie resuspenderen de cellen in 50 microliter van één tot 100 verdunning van monocytenblokker. Incubeer de celsuspensie gedurende vijf minuten op ijs en voeg vervolgens 50 microliter antilichaamcocktail toe. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht.Was de putjes vervolgens met 100 microliter kleurbuffer per putje. Centrifugeer de cellen opnieuw en was ze met 200 microliter kleurbuffer. Herhaal het proces nog twee keer, gevolgd door de cellen opnieuw te suspenderen in 400 microliter kleuringsbuffer.Voordat u de steekproef analyseert, voert u een ongekleurde steekproef uit zodat de celpopulatie kan worden aangepast op een zijspreiding versus een voorwaartse spreidingsplot. Voer vervolgens het gekleurde monster uit. Extraheer de autofluorescerende signatuur.Importeer vervolgens de FCS-bestanden om ze te gebruiken als besturingselement voor het ontmengen. Klik op het pictogram voor het ontmengen om de wizard voor het ontmengen te openen en het ontmengen uit te voeren met behulp van alle besturingselementen voor één kleur door de positieve en negatieve populaties te vergrendelen. Klik vervolgens op het gedeelte QC en bekijk de complexiteitsindex.De complexiteitsindex is een maat voor hoe te onderscheiden een verzameling spectrale signaturen is wanneer de spectrale signaturen niet met elkaar vermengd zijn. Maak ten slotte de sample ongemengd door op live unmix te klikken. Hier kunnen de resultaten van 14 kleurenfeiten op controlemuizenweefsel worden waargenomen.In deze analyse konden verschillende lobbypopulaties worden waargenomen, zoals ly6g-positieve neutrofielen en ly6c-monocytklassen met gemiddelde en hoge expressie. CD11c hoge MHC twee positieve dendritische cellen waren duidelijk zichtbaar wanneer ze werden afgeschermd tegen CD11b om macrofagen en andere myeloïde afstammingscellen zoals neutrofielen en monocyten uit te sluiten. Een subset van CD206-positieve CD86-positieve dendritische cellen kan worden geïdentificeerd door zich te concentreren op deze CD11c-positieve populatie, die zowel CD86 hoge M1-achtige dendritische cellen als CD206 hoge M2-achtige dendritische celpopulaties omvat.F4/80 vertoonde een gradiënt van expressie zoals vaak wordt waargenomen in verschillende macrofaagpopulaties. Siglec-F was aanwezig op zowel F4-80 positieve als negatieve populaties, die hoogstwaarschijnlijk overeenkwamen met respectievelijk een macrofaagsubgroep en eosinofielen. Hoewel kleuring met celoppervlaktemarkers het mogelijk maakt om deze aanduidingen van celtypen te maken, is het belangrijk op te merken dat cellen die verschillende markers tot expressie brengen, op een functionele manier moeten worden bekeken in tegenstelling tot een meer binaire classificatie.Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het begrijpen van de autofluorescerende signatuur van uw ondergekleurde monsters voordat u uw paneel ontwerpt, de sleutel is tot het bereiken van een betere en menging. Naast het analyseren van cellen, kunnen de geïsoleerde cellen worden gesorteerd in specifieke populaties voor stroomafwaartse evaluaties met cellulaire assays, in vitro, transcriptomische analyse of voor microscopische analyse om de cellulaire morfologie te evalueren. De toenemende complexiteit van flowcytometrie-analyses van biomaterialen helpt de kloof te overbruggen tussen fundamentele immunologische studies en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field fluorescentie microscopie en fluorescentie imaging Flowcytometrie op een mobiele telefoon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolatie van primaire humane Colon tumorcellen uit Chirurgische weefsels en kweken ze rechtstreeks op zachte elastische substraten voor Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektrische en magnetische veldapparaten voor stimulatie van biologische weefsels

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...