Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros du NIH, y compris l’Institut national d’imagerie biomédicale et de bio-ingénierie. Avis de non-responsabilité : Les NIH, leurs dirigeants et leurs employés ne recommandent ni n’approuvent aucune entreprise, produit ou service.

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole de cytométrie en flux.
1) Préparation des réactifs
<ol><li>Préparer les milieux pour la dilution des enzymes et pour la culture tissulaire.<ol><li>Ajouter 5 mL de solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans 500 mL de milieu RPMI et bien agiter. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Calculez le volume de la solut...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Cette revue décrit une méthodologie détaillée pour isoler les cellules des implants de biomatériaux afin d’obtenir une suspension cellulaire uniforme. De plus, un protocole détaillé a été fourni pour la coloration de la suspension cellulaire pour la cytométrie en flux multicolore, ainsi que les étapes de configuration d’un cytomètre en flux pour des résultats optimaux. Les méthodes d’isolement cellulaire peuvent impliquer plusieurs étapes, utilisant souvent la dissection manuelle des tissus suivie d?...

Les progrès dans le domaine de la médecine ont conduit à l’utilisation fréquente de matériaux implantés pour soutenir la fonction ou la repousse des tissus endommagés 1,2. Il s’agit notamment de dispositifs tels que les stimulateurs cardiaques, les implants cosmétiques reconstructifs et les plaques orthopédiques utilisées pour la fixation des fractures osseuses 3,4. Cependant, les matériaux utilisés pour fabriquer ces implants et les endroits où ils sont implantés jouent un rôle important dans la détermination du succès de ces implants 5,6,7. En tant que corps étrangers, ces implants peuvent générer une réponse immunitaire de la part de l’hôte qui peut conduire soit au rejet, soit à la tolérance8. Ce facteur a conduit la recherche sur les biomatériaux à générer des matériaux capables d’attirer la réponse immunitaire souhaitée après l’implantation 9,10,11,12.
La réponse immunitaire est une exigence essentielle dans le domaine de la médecine régénérative, où un tissu ou un organe est cultivé autour d’un squelette de biomatériau (échafaudage) dans un laboratoire pour le remplacement d’un tissu ou d’un organe endommagé13,14,15,16. En médecine régénérative, l’objectif est de remplacer les tissus manquants ou endommagés par l’utilisation de cellules, de signaux et d’échafaudages, chacun pouvant être fortement modulé par les réponses immunitaires17. De plus, même lorsqu’une absence de réponse immunitaire est souhaitée, c’est très rarement une absence d’activité immunitaire plutôt que la présence d’un profil régulateur qui est souhaitée18. Des techniques telles que la cytométrie en flux peuvent jouer un rôle important dans la caractérisation du modèle de réponse immunitaire à divers biomatériaux utilisés pour le revêtement des dispositifs implantaires ou pour le développement d’échafaudages pour l’ingénierie tissulaire19.
Ces informations, à leur tour, aideront à développer des biomatériaux pour les implants qui peuvent être bien tolérés par le système immunitaire ou à développer des échafaudages qui peuvent jouer un rôle constructif dans l’ingénierie tissulaire. La préparation correcte des échantillons pour l’analyse par cytométrie en flux est une étape importante pour éviter des résultats inexacts dans la caractérisation immunitaire par tri cellulaire activé par fluorescence20,21. Par conséquent, cette revue présente une méthodologie détaillée qui peut être utilisée pour l’isolement des cellules du tissu d’échafaudage, la coloration de la suspension cellulaire et l’analyse par cytométrie en flux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Le succès de l’implantation d’un tissu cultivé en laboratoire ou d’un dispositif médical chez un individu dépend de la réponse immunitaire de l’hôte receveur. Si l’on considère un implant comme un corps étranger, une réponse immunitaire hostile et dérégulée peut entraîner le rejet de l’implant, tandis qu’une réponse régulée et la récupération de l’homéostasie peuvent conduire à son acceptation. L’analyse des microenvironnements d’implants disséqués dans des contextes in vivo ou ex vivo peut aider à comprendre le modèle de réponse immunitaire, ce qui peut finalement aider à développer de nouvelles générations de biomatériaux. La cytométrie en flux est une technique bien connue pour caractériser les cellules immunitaires et leurs sous-ensembles en fonction de leurs marqueurs de surface cellulaire. Cette revue décrit un protocole basé sur le découpage manuel en dés, la digestion enzymatique et la filtration à travers un tamis cellulaire pour l’isolement de suspensions cellulaires uniformes à partir de tissus implantaires disséqués. De plus, un protocole de coloration par cytométrie en flux multicolore a été expliqué, ainsi que des étapes pour les réglages initiaux du cytomètre afin de caractériser et de quantifier ces cellules isolées par cytométrie en flux.

Le processus de développement de panels de cytométrie en flux pour l’analyse immunitaire repose souvent sur la comparaison des résultats avec les données existantes et la littérature dans le domaine. La connaissance de la façon dont les populations peuvent se présenter en cytométrie en flux est essentielle pour une interprétation correcte des données. Quoi qu’il en soit, les populations et les types de cellules peuvent apparaître différemment dans différents tissus, il fa...

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High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Ce protocole peut nous aider à caractériser la réponse immunitaire de l’hôte contre différents biomatériaux, ce qui peut par la suite aider à concevoir de meilleurs implants médicaux futurs. La cytométrie en flux nous donne des informations sur les cellules immunitaires qui infiltrent un biomatériau, ce qui nous aide à déterminer les mécanismes de réponse des cellules aux lésions et à l’implantation du matériau, ainsi que des cibles pour améliorer les traitements. Le même protocole peut être modifié pour caractériser la réponse immunitaire dans différents contextes.Disséquez le muscle quadruple de souris qui ont reçu un implant ECM il y a une semaine et qui ont été recueillies dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieux sans sérum. Enfin, coupez le mouchoir en dés à l’aide de ciseaux. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu enzymatique digestif dans le tube.Placez le tube contenant le milieu digestif et les mouchoirs en dés dans un incubateur agité pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 100 tr/min. À la fin de l’incubation, filtrez la suspension tissulaire digérée à travers une passoire de 70 microns dans un tube individuel de 50 millilitres. Utilisez une tête de seringue de cinq millilitres pour écraser n’importe quel morceau solide de tissus et lavez la passoire avec du PBS à température ambiante.Jetez tout résidu restant dans la passoire et ajustez le volume du tube à 50 millilitres avec du PBS à température ambiante. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre les pastilles en suspension dans 10 millilitres de solution froide d’EDTA de cinq millimolaires dans du PBS. Si des cellules sanguines sont présentes dans l’échantillon, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges, incuber pendant 10 minutes, puis ajouter neuf millilitres d’EDTA.Laissez la suspension sur glace pendant 10 minutes. Ajustez ensuite le volume à 50 millilitres avec du PBS froid. Collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension les granulés et 100 microlitres de PBS froid.Transférez 10 microlitres de suspension dans des microtubes à centrifuger individuels et mélangez avec 10 microlitres de trip et de bleu pour le comptage. Distribuez le volume restant de cellules dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond en V. Retirez 20 microlitres de cellules du puits et ajoutez-les dans un nouveau puits pour les utiliser comme contrôle non coloré.Ensuite, utilisez PBS pour porter le volume final dans chaque puits à 200 microlitres. Recueillir les cellules au fond des puits de plaques par centrifugation et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres d’une concentration de 1 à 1000 colorant de viabilité par puits. À la fin de l’incubation, laver chaque puits avec 100 microlitres de PBS frais et remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration par puits.Après la deuxième centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 50 microlitres d’une dilution de un à 100 bloqueurs de monocytes. Incubez la suspension cellulaire pendant cinq minutes sur de la glace, puis ajoutez 50 microlitres de cocktail d’anticorps. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.Lavez ensuite les puits avec 100 microlitres de tampon de coloration par puits. Centrifugez à nouveau les cellules et lavez-les avec 200 microlitres de tampon de coloration. Répétez le processus deux fois de plus, puis remettez les cellules en suspension dans 400 microlitres de tampon de coloration.Avant d’analyser l’échantillon, exécutez un échantillon non coloré pour permettre d’ajuster la population cellulaire sur un nuage de points latéral par rapport à un nuage de points avant. Ensuite, exécutez l’échantillon coloré. Extraire la signature autofluorescente.Importez ensuite les fichiers FCS pour les utiliser comme contrôle de démixage. Cliquez sur l’icône de démixage pour ouvrir l’assistant de démixage et effectuez le démixage à l’aide de toutes les commandes de couleur unique en contrôlant les populations positives et négatives. Ensuite, cliquez sur la section QC et regardez l’indice de complexité.L’indice de complexité est une mesure de la distinction d’un ensemble de signatures spectrales lorsque les signatures spectrales ne sont pas mélangées. Enfin, annulez le mixage de l’échantillon en cliquant sur le démixage en direct. Ici, les résultats d’un 14 faits de couleur sur des tissus de souris témoins peuvent être observés.Dans cette analyse, plusieurs populations lobbyistes, telles que les neutrophiles ly6g positifs et les classes de monocytes ly6c exprimant moyenne et élevée, ont pu être observées. CD11c élevé CMH deux cellules dendritiques positives étaient facilement apparentes lorsqu’elles étaient opposées à CD11b pour exclure les macrophages et d’autres cellules de la lignée myéloïde telles que les neutrophiles et les monocytes. Un sous-ensemble de cellules dendritiques CD206 positives CD206 a pu être identifié en se concentrant sur cette population CD11c positive, qui comprend à la fois des cellules dendritiques de type CD86 à forte teneur en M1 et des populations de cellules dendritiques à forte teneur en M2 de CD206.F4/80 a montré un gradient d’expression comme on l’observe couramment dans diverses populations de macrophages. Siglec-F était présent à la fois sur les populations F4-80 positives et négatives, correspondant très probablement à un sous-ensemble de macrophages et à des éosinophiles respectivement. Bien que la coloration avec des marqueurs de surface cellulaire permette de faire ces désignations de types cellulaires, il est important de noter que les cellules exprimant des marqueurs différents doivent être considérées de manière fonctionnelle par opposition à une classification plus binaire.Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la compréhension de la signature autofluorescente de vos échantillons sous-colorés avant de concevoir votre panneau est essentielle pour obtenir un meilleur mélange. Outre l’analyse des cellules, les cellules isolées peuvent être triées en populations spécifiques pour des évaluations en aval avec des tests cellulaires, in vitro, une analyse transcriptomique ou pour une analyse microscopique afin d’évaluer la morphologie cellulaire. La complexité croissante des analyses par cytométrie en flux des biomatériaux permet de combler le fossé entre les études d’immunologie fondamentale et l’ingénierie de nouvelles thérapies.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Champ large Microscopie fluorescente et cytométrie de flux fluorescente imagerie sur un téléphone portable

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Détection du cancer de l'ovaire à l'aide de la cytométrie du flux photoacoustique

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...