Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Diese Forschung wurde teilweise durch das Intramurale Forschungsprogramm der NIH unterstützt, einschließlich des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Haftungsausschluss: Die NIH, ihre leitenden Angestellten und Mitarbeiter empfehlen oder befürworten keine Unternehmen, Produkte oder Dienstleistungen.

HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Durchflusszytometrieprotokoll.
1) Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie Medien für die Verdünnung von Enzymen und für die Gewebekultur vor.<ol><li>5 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung in 500 ml RPMI-Medium geben und gut schütteln. Lagern Sie das Medium bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung.<br...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Diese Übersichtsarbeit beschreibt eine detaillierte Methodik zur Isolierung von Zellen aus Biomaterialimplantaten, um eine einheitliche Zellsuspension zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein detailliertes Protokoll für die Färbung der Zellsuspension für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie sowie die Schritte zur Konfiguration eines Durchflusszytometers für optimale Ergebnisse bereitgestellt. Zellisolierungsmethoden können mehrere Schritte umfassen, wobei häufig eine manuelle Gewebedissektion gefolgt von einem enzyma...

Fortschritte auf dem Gebiet der Medizin haben dazu geführt, dass häufig implantierte Materialien zur Unterstützung der Funktion oder des Nachwachsens von geschädigtem Gewebe verwendet werden 1,2. Dazu gehören Geräte wie Herzschrittmacher, rekonstruktive kosmetische Implantate und orthopädische Platten, die zur Fixierung von Knochenbrüchen verwendet werden 3,4. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Implantate verwendet werden, und die Stellen, an denen sie implantiert werden, spielen jedoch eine wichtige Rolle für den Erfolg dieser Implantate 5,6,7. Als Fremdkörper können diese Implantate eine Immunantwort des Wirts hervorrufen, die entweder zu einer Abstoßung oder zu einer Toleranz führen kann8. Dieser Faktor hat die Biomaterialforschung vorangetrieben, um Materialien zu entwickeln, die nach der Implantation die gewünschte Immunantwort hervorrufenkönnen 9,10,11,12.
Die Immunantwort ist eine wesentliche Voraussetzung im Bereich der regenerativen Medizin, bei der ein Gewebe oder ein Organ in einem Labor um ein Biomaterialskelett (Gerüst) herum gezüchtet wird, um ein beschädigtes Gewebe oder Organ zu ersetzen13,14,15,16. In der regenerativen Medizin besteht das Ziel darin, fehlendes oder beschädigtes Gewebe durch den Einsatz von Zellen, Signalen und Gerüsten zu ersetzen, von denen jedes durch Immunantworten stark moduliert werden kann17. Selbst wenn eine fehlende Immunantwort erwünscht ist, ist es sehr selten eine Abwesenheit von Immunaktivität und nicht das Vorhandensein eines regulatorischen Profils, das erwünscht ist18. Techniken wie die Durchflusszytometrie können eine wichtige Rolle bei der Charakterisierung des Musters der Immunantwort auf verschiedene Biomaterialien spielen, die für die Beschichtung von Implantaten oder für die Entwicklung von Gerüsten für das Tissue Engineering verwendet werden19.
Diese Informationen wiederum werden letztendlich dazu beitragen, Biomaterialien für Implantate zu entwickeln, die vom Immunsystem gut vertragen werden können, oder Gerüste zu entwickeln, die eine konstruktive Rolle beim Tissue Engineering spielen können. Die richtige Vorbereitung der Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie ist ein wichtiger Schritt, um ungenaue Ergebnisse bei der Immuncharakterisierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu vermeiden20,21. Daher wird in dieser Übersichtsarbeit eine detaillierte Methodik vorgestellt, die für die Isolierung von Zellen aus Gerüstgewebe, die Färbung der Zellsuspension und die Analyse mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Der Erfolg der Implantation von im Labor gezüchtetem Gewebe oder eines medizinischen Geräts in eine Person hängt von der Immunantwort des Empfängerwirts ab. Betrachtet man ein Implantat als Fremdkörper, kann eine feindliche und dysregulierte Immunantwort zur Abstoßung des Implantats führen, während eine regulierte Reaktion und Wiedererlangung der Homöostase zu seiner Akzeptanz führen kann. Die Analyse der Mikroumgebungen von Implantaten, die unter In-vivo- oder Ex-vivo-Bedingungen präpariert werden, kann dazu beitragen, das Muster der Immunantwort zu verstehen, was letztendlich zur Entwicklung neuer Generationen von Biomaterialien beitragen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine bekannte Technik zur Charakterisierung von Immunzellen und ihren Untergruppen anhand ihrer Zelloberflächenmarker. Diese Übersichtsarbeit beschreibt ein Protokoll, das auf manuellem Würfeln, enzymatischem Aufschluss und Filtration durch ein Zellsieb zur Isolierung einheitlicher Zellsuspensionen aus präpariertem Implantatgewebe basiert. Des Weiteren wurde ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Färbeprotokoll erläutert, zusammen mit Schritten für anfängliche Zytometereinstellungen, um diese isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Der Prozess der Entwicklung von Durchflusszytometrie-Panels für die Immunanalyse beruht häufig auf dem Vergleich der Ergebnisse mit vorhandenen Daten und der Literatur auf diesem Gebiet. Das Wissen darüber, wie sich Populationen in der Durchflusszytometrie präsentieren können, ist entscheidend für die richtige Interpretation von Daten. Unabhängig davon können Populationen und Zelltypen in verschiedenen Geweben unterschiedlich aussehen, so dass eine gewisse Variabilität zu erwarte...

Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Dieses Protokoll kann uns helfen, die Immunantwort des Wirts gegen verschiedene Biomaterialien zu charakterisieren, was anschließend dazu beitragen kann, bessere zukünftige medizinische Implantate zu entwickeln. Die Durchflusszytometrie liefert uns Informationen über Immunzellen, die ein Biomaterial infiltrieren, was uns hilft, Mechanismen zu bestimmen, wie Zellen auf Verletzungen und Materialimplantation reagieren, sowie Ziele für verbesserte Therapeutika. Dasselbe Protokoll kann modifiziert werden, um die Immunantwort in verschiedenen Situationen zu charakterisieren.Sezieren Sie den Quad-Muskel von Mäusen, die vor einer Woche ein ECM-Implantat erhalten und in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern serumfreiem Medium gesammelt wurden. Zum Schluss das Gewebe mit einer Schere würfeln. Als nächstes gibst du fünf Milliliter Verdauungsenzymmedium in das Röhrchen.Legen Sie das Röhrchen mit Verdauungsmedien und gewürfeltem Gewebe für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 100 U/min in einen Schüttelinkubator. Am Ende der Inkubationsfiltration wird die aufgegeschlossene Gewebesuspension durch ein 70-Mikron-Sieb in ein einzelnes 50-Milliliter-Röhrchen gefiltert. Verwenden Sie einen Fünf-Milliliter-Spritzenkopf, um feste Taschentücher zu zerdrücken, und waschen Sie das Sieb mit PBS bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie alle verbleibenden Rückstände im Sieb und stellen Sie das Volumen des Röhrchens auf 50 Milliliter mit PBS bei Raumtemperatur ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 10 Milliliter kalter fünf-Millimolar-EDTA-Lösung in PBS. Wenn Blutzellen in der Probe vorhanden sind, wird das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert, 10 Minuten lang inkubiert und dann neun Milliliter EDTA hinzugefügt.Lassen Sie die Suspension 10 Minuten auf Eis. Stellen Sie dann die Lautstärke mit kaltem PBS auf 50 Milliliter ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets und 100 Mikroliter kaltes PBS.10 Mikroliter der Suspension in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 10 Mikrolitern Trip und Blau zum Zählen mischen. Geben Sie das verbleibende Zellvolumen in jede Vertiefung einer V-Boden-96-Well-Platte. Entnehmen Sie 20 Mikroliter Zellen aus der Vertiefung und geben Sie sie in eine neue Vertiefung, um sie als ungefärbte Kontrolle zu verwenden.Verwenden Sie dann PBS, um das endgültige Volumen in jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter zu bringen. Sammeln Sie die Zellen am Boden der Plattenvertiefungen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern einer Konzentration von eins bis 1000 Lebensfähigkeitsfarbstoff pro Well. Am Ende der Inkubation wird jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern frischem PBS gewaschen und die Pellets in 200 Mikroliter Färbepuffer pro Vertiefung resuspendiert.Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern einer bis 100-fachen Verdünnung des Monozytenblockers. Inkubieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang auf Eis und fügen Sie dann 50 Mikroliter Antikörpercocktail hinzu. 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis inkubieren.Anschließend werden die Vertiefungen mit 100 Mikrolitern Färbepuffer pro Vertiefung gewaschen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und waschen Sie sie mit 200 Mikrolitern Färbepuffer. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male, gefolgt von der Resuspension der Zellen in 400 Mikroliter Färbepuffer.Bevor Sie die Probe analysieren, führen Sie eine ungefärbte Probe aus, damit die Zellpopulation in einem Seitenstreudiagramm im Vergleich zu einem Vorwärtsstreudiagramm angepasst werden kann. Führen Sie als Nächstes die gefärbte Probe aus. Extrahieren Sie die autofluoreszierende Signatur.Importieren Sie dann die FCS-Dateien, um sie als Steuerelement für die Entmischung zu verwenden. Klicken Sie auf das Symbol zum Aufheben der Entmischung, um den Assistenten zum Aufheben der Entmischung zu öffnen, und führen Sie die Entmischung mit allen Steuerelementen für einzelne Farben durch, indem Sie die positiven und negativen Populationen ansteuern. Klicken Sie als Nächstes auf den Abschnitt QC und sehen Sie sich den Komplexitätsindex an.Der Komplexitätsindex ist ein Maß dafür, wie unterscheidbar eine Sammlung von spektralen Signaturen ist, wenn die spektralen Signaturen nicht miteinander vermischt sind. Zum Schluss können Sie das Sample entmischen, indem Sie auf Live Unmix klicken. Hier können die Ergebnisse einer 14 Farbfakten an Kontroll-Mausgewebe beobachtet werden.In dieser Analyse konnten mehrere Lobbyisten-Populationen, wie z.B. ly6g-positive Neutrophile und ly6c-Monozytenklassen mit mittlerer und hoher Expression beobachtet werden. CD11c-hohe MHC-zwei positive dendritische Zellen waren leicht zu erkennen, wenn sie gegen CD11b gerichtet wurden, um Makrophagen und andere myeloische Zellen wie Neutrophile und Monozyten auszuschließen. Eine Untergruppe von CD206-positiven CD86-positiven dendritischen Zellen konnte identifiziert werden, indem man sich auf diese CD11c-positive Population konzentrierte, die sowohl CD86 hohe M1-ähnliche dendritische Zellen als auch CD206 hohe M2-ähnliche dendritische Zellpopulationen umfasst.F4/80 zeigte einen Expressionsgradienten, wie er häufig in verschiedenen Makrophagenpopulationen beobachtet wird. Siglec-F war sowohl in F4-80-positiven als auch in negativen Populationen vorhanden, was höchstwahrscheinlich einer Makrophagen-Untergruppe bzw. Eosinophilen entspricht. Obwohl die Färbung mit Zelloberflächenmarkern diese Bezeichnungen von Zelltypen ermöglicht, ist es wichtig zu beachten, dass Zellen, die verschiedene Marker exprimieren, auf funktionelle Weise und nicht auf eine eher binäre Klassifizierung betrachtet werden sollten.Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, denken Sie daran, dass das Verständnis der autofluoreszierenden Signatur Ihrer unterfärbten Proben vor dem Entwerfen Ihres Panels der Schlüssel ist, um eine bessere und gemischte Wirkung zu erzielen. Neben der Analyse von Zellen können die isolierten Zellen in spezifische Populationen sortiert werden, um sie mit zellulären Assays, in vitro, transkriptomischer Analyse oder für mikroskopische Analysen zur Bewertung der Zellmorphologie auszuwerten. Die zunehmende Komplexität der durchflusszytometrischen Analysen von Biomaterialien trägt dazu bei, die Lücke zwischen grundlegenden immunologischen Studien und der Entwicklung neuer Therapeutika zu schließen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Forschung

Biotechnik

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...