Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
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Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, tra cui il National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Dichiarazione di non responsabilità: il NIH, i suoi funzionari e dipendenti non raccomandano o approvano alcuna azienda, prodotto o servizio.

NOTA: La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo di citometria a flusso.
1) Preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare i terreni per la diluizione degli enzimi e per la coltura dei tessuti.<ol><li>Aggiungere 5 mL di soluzione tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) in 500 mL di terreno RPMI e agitare bene. Conservare il terreno a 4 °C fino al successivo utilizzo.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare il volume della soluzione en...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Questa revisione descrive una metodologia dettagliata per isolare le cellule da impianti di biomateriali per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Inoltre, è stato fornito un protocollo dettagliato per la colorazione della sospensione cellulare per la citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per la configurazione di un citometro a flusso per ottenere risultati ottimali. I metodi di isolamento cellulare possono comportare più fasi, spesso utilizzando la dissezione manuale dei tessuti seguita dalla dig...

I progressi nel campo della medicina hanno portato all'uso frequente di materiali impiantati per sostenere la funzione o la ricrescita del tessuto danneggiato 1,2. Questi includono dispositivi come pacemaker, impianti cosmetici ricostruttivi e placche ortopediche utilizzate per la fissazione delle fratture ossee 3,4. Tuttavia, i materiali utilizzati per realizzare questi impianti e le posizioni in cui vengono impiantati giocano un ruolo importante nel determinare il successo di questi impianti 5,6,7. Come corpi estranei, questi impianti possono generare una risposta immunitaria da parte dell'ospite che può portare al rigetto o alla tolleranza8. Questo fattore ha spinto la ricerca sui biomateriali a generare materiali in grado di attrarre la risposta immunitaria desiderata dopo l'impianto 9,10,11,12.
La risposta immunitaria è un requisito essenziale nel campo della medicina rigenerativa, dove un tessuto o un organo viene coltivato attorno a uno scheletro biomateriale (scaffold) in laboratorio per la sostituzione di un tessuto o di un organo danneggiato13,14,15,16. Nella medicina rigenerativa, l'obiettivo è quello di sostituire il tessuto mancante o danneggiato attraverso l'uso di cellule, segnali e scaffold, ognuno dei quali può essere notevolmente modulato dalle risposte immunitarie17. Inoltre, anche quando si desidera una mancanza di risposta immunitaria, molto raramente si tratta di un'assenza di attività immunitaria piuttosto che della presenza di un profilo regolatorio che è auspicabile18. Tecniche come la citometria a flusso possono svolgere un ruolo significativo nella caratterizzazione del modello di risposta immunitaria a vari biomateriali utilizzati per il rivestimento di dispositivi implantari o per lo sviluppo di scaffold per l'ingegneria tissutale19.
Queste informazioni, a loro volta, aiuteranno in ultima analisi nello sviluppo di biomateriali per impianti che possono essere ben tollerati dal sistema immunitario o nello sviluppo di scaffold che possono svolgere un ruolo costruttivo nell'ingegneria tissutale. La corretta preparazione dei campioni per l'analisi mediante citometria a flusso è un passo importante per evitare risultati imprecisi nella caratterizzazione immunitaria tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza20,21. Pertanto, questa revisione presenta una metodologia dettagliata che può essere utilizzata per l'isolamento di cellule dal tessuto dell'impalcatura, la colorazione della sospensione cellulare e l'analisi mediante citometria a flusso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Il successo dell'impianto di un tessuto coltivato in laboratorio o di un dispositivo medico in un individuo è soggetto alla risposta immunitaria dell'ospite ricevente. Considerando un impianto come un corpo estraneo, una risposta immunitaria ostile e disregolata può portare al rigetto dell'impianto, mentre una risposta regolata e il recupero dell'omeostasi possono portare alla sua accettazione. L'analisi dei microambienti degli impianti sezionati in ambienti in vivo o ex vivo può aiutare a comprendere il modello di risposta immunitaria, che può in ultima analisi aiutare nello sviluppo di nuove generazioni di biomateriali. La citometria a flusso è una tecnica ben nota per caratterizzare le cellule immunitarie e i loro sottogruppi in base ai loro marcatori di superficie cellulare. Questa revisione descrive un protocollo basato sul taglio manuale a cubetti, la digestione enzimatica e la filtrazione attraverso un filtro cellulare per l'isolamento di sospensioni cellulari uniformi dal tessuto implantare sezionato. Inoltre, è stato spiegato un protocollo di colorazione della citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per le impostazioni iniziali del citometro per caratterizzare e quantificare queste cellule isolate mediante citometria a flusso.

Il processo di sviluppo dei pannelli di citometria a flusso per l'analisi immunitaria si basa spesso sul confronto dei risultati con i dati esistenti e la letteratura in materia. La conoscenza di come le popolazioni possono presentarsi nella citometria a flusso è fondamentale per una corretta interpretazione dei dati. Indipendentemente da ciò, le popolazioni e i tipi di cellule possono apparire in modo diverso nei diversi tessuti, quindi è prevedibile una certa variabilità. Nel contes...

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High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

L'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro caratterizzazione mediante citometria a flusso possono contribuire in modo significativo alla comprensione del modello di risposta immunitaria contro gli impianti. Questo articolo descrive un metodo preciso per l'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro colorazione per l'analisi citofluorimetrica.

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Questo protocollo può aiutarci a caratterizzare la risposta immunitaria dell'ospite contro diversi biomateriali che possono successivamente aiutare a progettare migliori impianti medici futuri. La citometria a flusso ci fornisce informazioni sulle cellule immunitarie che si infiltrano in un biomateriale che ci aiuta a determinare i meccanismi di come le cellule rispondono alla lesione e all'impianto di materiale, nonché i bersagli per migliorare le terapie. Lo stesso protocollo può essere modificato per caratterizzare la risposta immunitaria in diversi contesti.Sezionare il muscolo quadricipite di topi che hanno ricevuto un impianto ECM una settimana fa e raccolti in una provetta da 50 millilitri contenente cinque millilitri di terreno privo di siero. Infine tagliate a dadini il fazzoletto con le forbici. Quindi, aggiungi cinque millilitri di media di enzimi digestivi al tubo.Mettere la provetta contenente i terreni digestivi e i fazzoletti tagliati a cubetti in un'incubatrice agitata per 45 minuti a 37 gradi Celsius e 100 giri/min. Al termine dell'incubazione, filtrare la sospensione tissutale digerita attraverso un colino da 70 micron in una provetta individuale da 50 millilitri. Utilizzare una testina da siringa da cinque millilitri per schiacciare qualsiasi pezzo solido di fazzoletti e lavare il filtro con PBS a temperatura ambiente.Eliminare eventuali residui nel filtro e regolare il volume del tubo a 50 millilitri con PBS a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 10 millilitri di soluzione fredda di EDTA da cinque millimolari in PBS. Se nel campione sono presenti cellule del sangue, risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi, incubare per 10 minuti, quindi aggiungere nove millilitri di EDTA.Lasciare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi regolare il volume a 50 millilitri con PBS freddo. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere i pellet e 100 microlitri di PBS freddo.Trasferire 10 microlitri della sospensione in singole provette da microcentrifuga e mescolare con 10 microlitri di trip e blu per il conteggio. Erogare il volume rimanente di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Rimuovere 20 microlitri di cellule dal pozzetto e aggiungerle in un nuovo pozzetto da utilizzare come controllo non colorato.Quindi utilizzare PBS per portare il volume finale in ciascun pozzetto a 200 microlitri. Raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti della piastra mediante centrifugazione e risospendere le cellule in 100 microlitri di una concentrazione da uno a 1000 di colorante di vitalità per pozzetto. Al termine dell'incubazione, lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di PBS fresco e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone colorante per pozzetto.Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule in 50 microlitri di diluizione da uno a 100 di bloccante monocitario. Incubare la sospensione cellulare per cinque minuti su ghiaccio e poi aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi. Incubare per 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.Quindi lavare i pozzetti con 100 microlitri di tampone colorante per pozzetto. Centrifugare nuovamente le cellule e lavarle con 200 microlitri di tampone colorante. Ripetere il processo altre due volte e poi risospendere le cellule in 400 microlitri di tampone colorante.Prima di analizzare il campione, eseguire un campione non colorato per consentire di regolare la popolazione cellulare su un grafico a dispersione laterale rispetto a un grafico a dispersione diretta. Successivamente, eseguire il campione colorato. Estrarre la firma autofluorescente.Quindi importare i file FCS per utilizzarli come controllo per l'unmixing. Fare clic sull'icona di unmixing per aprire la procedura guidata di unmixing ed eseguire l'unmixing utilizzando tutti i controlli di un singolo colore controllando le popolazioni positive e negative. Quindi, fai clic sulla sezione QC e guarda l'indice di complessità.L'indice di complessità è una misura di quanto sia distinguibile una raccolta di firme spettrali quando le firme spettrali non sono mescolate insieme. Infine, demixate il campione facendo clic su Live Unmix. Qui, si possono osservare i risultati di un 14 fatti di colore sul tessuto di topo di controllo.In questa analisi, è stato possibile osservare diverse popolazioni di lobbisti, come i neutrofili positivi ly6g e le classi di monociti ly6c a media e alta espressione. Le cellule dendritiche positive ad alto MHC CD11c erano prontamente evidenti quando sono state gate contro CD11b per escludere i macrofagi e altre cellule della linea mieloide come neutrofili e monociti. Un sottogruppo di cellule dendritiche CD206 positive CD86 positive potrebbe essere identificato concentrandosi su questa popolazione CD11c positiva, che include sia CD86 ad alto M1 come le cellule dendritiche che CD206 ad alto M2 come le popolazioni di cellule dendritiche.F4/80 ha dimostrato un gradiente di espressione come si osserva comunemente in varie popolazioni di macrofagi. Siglec-F era presente sia su popolazioni F4-80 positive che negative, molto probabilmente corrispondenti rispettivamente a un sottogruppo di macrofagi e a eosinofili. Sebbene la colorazione con marcatori di superficie cellulare consenta di effettuare queste designazioni di tipi di cellule, è importante notare che le cellule che esprimono marcatori diversi dovrebbero essere viste in modo funzionale rispetto a una classificazione più binaria.Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la comprensione della firma autofluorescente dei campioni sottoprodotti prima di progettare il pannello è fondamentale per ottenere una migliore miscelazione. Oltre ad analizzare le cellule, le cellule isolate possono essere suddivise in popolazioni specifiche per valutazioni a valle con saggi cellulari, in vitro, analisi trascrittomica o per analisi microscopiche per valutare la morfologia cellulare. La crescente complessità delle analisi di citometria a flusso dei biomateriali aiuta a colmare il divario tra gli studi immunologici di base e l'ingegnerizzazione di nuove terapie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Ricerca

Bioingegneria

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Dispositivi elettrici e a campo magnetico per la stimolazione dei tessuti biologici

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...