Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Denna forskning stöddes delvis av NIH:s intramurala forskningsprogram, inklusive National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfriskrivning: NIH, dess tjänstemän och anställda rekommenderar eller stöder inte något företag, produkt eller tjänst.

OBS: Figur 1 ger en överview av flödescytometriprotokollet.
1) Beredning av reagens
<ol><li>Bered media för utspädning av enzymer och för vävnadsodling.<ol><li>Tillsätt 5 ml buffertlösning av 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) till 500 ml RPMI-medium och skaka väl. Förvara mediet vid 4 °C tills du använder det igen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beräkna enzymlösningens volym. OBS: Volymen av enzymlösningen är volymen av mediet som inn...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Denna översikt beskriver en detaljerad metod för att isolera celler från biomaterialimplantat för att erhålla en enhetlig cellsuspension. Dessutom har ett detaljerat protokoll tillhandahållits för färgning av cellsuspensionen för flerfärgad flödescytometri, tillsammans med stegen för att konfigurera en flödescytometer för optimala resultat. Cellisoleringsmetoder kan involvera flera steg, ofta med manuell vävnadsdissektion följt av enzymatisk nedbrytning med proteolytiska enzymer för att dissociera den ex...

Framsteg inom det medicinska området har lett till frekvent användning av implanterade material för att stödja funktionen eller återväxten av skadad vävnad 1,2. Dessa inkluderar enheter som pacemakers, rekonstruktiva kosmetiska implantat och ortopediska plattor som används för fixering av benfrakturer 3,4. Materialen som används för att tillverka dessa implantat och de platser där de implanteras spelar dock viktiga roller för att avgöra framgången för dessa implantat 5,6,7. Som främmande kroppar kan dessa implantat generera ett immunsvar från värden som antingen kan leda till avstötning eller tolerans8. Denna faktor har drivit biomaterialforskningen för att generera material som kan attrahera det önskade immunsvaret efter implantation 9,10,11,12.
Immunsvaret är ett väsentligt krav inom regenerativ medicin, där en vävnad eller ett organ odlas runt ett skelett av biomaterial (byggnadsställning) i ett laboratorium för ersättning av en skadad vävnad eller ett skadat organ13,14,15,16. Inom regenerativ medicin är målet att ersätta saknad eller skadad vävnad genom användning av celler, signaler och byggnadsställningar, som var och en i hög grad kan moduleras av immunsvar. Dessutom, även när en brist på immunsvar är önskvärd, är det mycket sällan en frånvaro av immunaktivitet snarare än närvaron av en regulatorisk profil som är önskvärd18. Tekniker som flödescytometri kan spela en viktig roll för att karakterisera mönstret för immunsvar mot olika biomaterial som används för att belägga implantat eller för att utveckla strukturer för vävnadsteknik19.
Denna information kommer i sin tur i slutändan att hjälpa till att utveckla biomaterial för implantat som kan tolereras väl av immunsystemet eller att utveckla strukturer som kan spela en konstruktiv roll i vävnadsteknik. Korrekt förberedelse av prover för analys med flödescytometri är ett viktigt steg för att undvika felaktiga resultat i immunkarakterisering via fluorescensaktiverad cellsortering20,21. Därför presenterar denna översikt en detaljerad metodik som kan användas för isolering av celler från byggnadsställningsvävnad, färgning av cellsuspensionen och analys genom flödescytometri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Framgången med att implantera laboratorieodlad vävnad eller en medicinteknisk produkt i en individ är beroende av immunsvaret hos den mottagande värden. Om man betraktar ett implantat som en främmande kropp kan ett fientligt och oreglerat immunsvar leda till att implantatet avvisas, medan ett reglerat svar och återfående av homeostas kan leda till att det accepteras. Att analysera mikromiljöerna hos implantat som dissekerats under in vivo- eller ex vivo-miljöer kan hjälpa till att förstå mönstret för immunsvar, vilket i slutändan kan hjälpa till att utveckla nya generationer av biomaterial. Flödescytometri är en välkänd teknik för att karakterisera immunceller och deras undergrupper baserat på deras cellytemarkörer. Denna granskning beskriver ett protokoll baserat på manuell tärning, enzymatisk matsmältning och filtrering genom en cellsil för isolering av enhetliga cellsuspensioner från dissekerad implantatvävnad. Vidare har ett flerfärgat flödescytometrifärgningsprotokoll förklarats, tillsammans med steg för initiala cytometerinställningar för att karakterisera och kvantifiera dessa isolerade celler genom flödescytometri.

Processen för utveckling av flödescytometripaneler för immunanalys bygger ofta på jämförelse av resultat med befintliga data och litteraturen inom området. Kunskap om hur populationer kan uppträda i flödescytometri är avgörande för korrekt tolkning av data. Oavsett vilket kan populationer och celltyper se olika ut i olika vävnader, så en viss variabilitet kan förväntas. I samband med väldefinierade kontrollvävnader kan sådan färgningsoptimering utvärderas mot känd v?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Isolering av celler från dissekerade implantat och deras karakterisering genom flödescytometri kan avsevärt bidra till att förstå mönstret av immunsvar mot implantat. Denna artikel beskriver en exakt metod för isolering av celler från dissekerade implantat och deras färgning för flödescytometrisk analys.

Högdimensionell flödescytometri för immunfunktionsanalys av dissekerade implantatvävnader

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Detta protokoll kan hjälpa oss att karakterisera värdens immunsvar mot olika biomaterial, vilket sedan kan hjälpa till att designa bättre framtida medicinska implantat. Flödescytometri ger oss information om immunceller som infiltrerar ett biomaterial, vilket hjälper oss att bestämma mekanismer för hur celler svarar på skada och materialimplantation samt mål för förbättrade terapier. Samma protokoll kan modifieras för att karakterisera immunsvar i olika miljöer.Dissekera lårmuskeln hos möss som fick ett ECM-implantat för en vecka sedan och samlades i ett 50 milliliters rör som innehöll fem milliliter serumfria medier. Till sist tärnade jag vävnaden med en sax. Tillsätt sedan fem milliliter matsmältningsenzymmedia till röret.Placera röret som innehåller matsmältningsmedia och tärnad vävnad i en skakinkubator i 45 minuter vid 37 grader Celsius och 100 varv per minut. I slutet av inkubationen filtrerar du den upplösta vävnadssuspensionen genom en 70 mikron-sil till ett enskilt 50 ml-rör. Använd ett fem milliliters spruthuvud för att mosa en fast bit av vävnader och tvätta silen med rumstemperatur PBS.Kassera eventuella rester i silen och justera rörets volym till 50 milliliter med rumstemperatur PBS. Samla cellerna genom centrifugering och återsuspendera pelletsen i 10 ml kall 5 millimolär EDTA-lösning i PBS. Om det finns blodkroppar i provet, återsuspendera pelleten i en milliliter RBC-lysbuffert, inkubera i 10 minuter och tillsätt sedan nio milliliter EDTA.Låt suspensionen ligga på is i 10 minuter. Justera sedan volymen till 50 milliliter med kall PBS. Samla in cellerna genom centrifugering och återsuspendera pelletsen och 100 mikroliter kall PBS.Överför 10 mikroliter av suspensionen till individuella mikrocentrifugrör och blanda med 10 mikroliter tripp och blått för räkning. Dispensera den återstående volymen av celler i varje brunn på en V botten 96 brunnsplatta. Ta bort 20 mikroliter celler från brunnen och lägg dem i en ny brunn för att använda som ofärgad kontroll.Använd sedan PBS för att få den slutliga volymen i varje brunn till 200 mikroliter. Samla upp cellerna i botten av plattbrunnarna genom centrifugering och återsuspendera cellerna i 100 mikroliter av en koncentration på 1 till 1000 av livsduglighetsfärgämne per brunn. I slutet av inkubationen, tvätta varje brunn med 100 mikroliter färsk PBS och återsuspendera pelletsen i 200 mikroliter färgningsbuffert per brunn.Efter den andra centrifugeringen återsuspenderas cellerna i 50 mikroliter utspädning av monocytblockeraren med en till 100 grader. Inkubera cellsuspensionen i fem minuter på is och tillsätt sedan 50 mikroliter antikroppscocktail. Inkubera i 30 minuter på is skyddad från ljus.Tvätta sedan brunnarna med 100 mikroliter färgningsbuffert per brunn. Centrifugera cellerna igen och tvätta med 200 mikroliter färgningsbuffert. Upprepa processen ytterligare två gånger följt av att återsuspendera cellerna i 400 mikroliter färgningsbuffert.Innan du analyserar provet, kör ett ofärgat prov så att cellpopulationen kan justeras på en sidospridning kontra en framåtspridningsplott. Kör sedan det färgade provet. Extrahera den autofluorescerande signaturen.Importera sedan FCS-filerna för att använda dem som en kontroll för avblandning. Klicka på avblandningsikonen för att öppna avblandningsguiden och utför avblandning med alla enfärgskontroller genom att styra de positiva och negativa populationerna. Klicka sedan på avsnittet QC och titta på komplexitetsindexet.Komplexitetsindexet är ett mått på hur urskiljbar en samling spektrala signaturer är när de spektrala signaturerna är oblandade tillsammans. Slutligen tar du bort provet genom att klicka på live unmix. Här kan resultaten av en 14 färgfakta på kontrollmusvävnad observeras.I denna analys kunde flera lobbyistpopulationer, såsom ly6g-positiva neutrofiler och ly6c-medel- och höguttryckande monocytklasser, observeras. CD11c hög MHC två positiva dendritiska celler var tydligt när de var låsta mot CD11b för att utesluta makrofager och andra myeloida härstamningsceller såsom neutrofiler och monocyter. En undergrupp av CD206-positiva CD86-positiva dendritiska celler kunde identifieras genom att fokusera på denna CD11c-positiva population, som inkluderar både CD86-höga M1-liknande dendritiska celler och CD206-höga M2-liknande dendritiska cellpopulationer.F4/80 uppvisade en gradient av uttryck som är vanligt förekommande i olika makrofagpopulationer. Siglec-F förekom på både F4-80-positiva och negativa populationer, vilket sannolikt motsvarade en undergrupp av makrofager respektive eosinofiler. Även om färgning med cellytemarkörer gör det möjligt att göra dessa beteckningar av celltyper, är det viktigt att notera att celler som uttrycker olika markörer bör ses på ett funktionellt sätt i motsats till en mer binär klassificering.När du försöker detta protokoll, kom ihåg att det är viktigt att förstå den autofluorescerande signaturen för dina underfärgade prover innan du designar din panel för att uppnå en bättre och blandning. Förutom att analysera celler kan de isolerade cellerna sorteras in i specifika populationer för nedströmsutvärderingar med cellulära analyser, in vitro, transkriptomisk analys eller för mikroskopisk analys för att utvärdera cellulär morfologi. Ökad komplexitet i flödescytometrianalyser av biomaterial hjälper till att överbrygga klyftan mellan grundläggande immunologiska studier och utveckling av nya terapier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-området fluorescensmikroskopi och fluorescerande Imaging flödescytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Känslig detektion av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flödescytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Äggstocks cancer detektion med Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriska och magnetiska fältenheter för stimulering av biologiska vävnader

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...