Name: high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

Bu araştırma kısmen, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü de dahil olmak üzere NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Feragatname: NIH, yetkilileri ve çalışanları herhangi bir şirketi, ürünü veya hizmeti önermez veya onaylamaz.

NOT: Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.
1) Reaktif hazırlama
<ol><li>Enzimleri seyreltmek ve doku kültürü için ortam hazırlayın.<ol><li>500 mL RPMI ortamına 5 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Ortamı daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzim çözeltisinin hacmini hesaplayın. NOT: Enzim çözeltisinin hacmi...

<ol>
	<li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+implantable+medical+devices:+from+an+engineering+perspective.">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li><li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules.">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li><li>Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fibrotic+response+to+implanted+biomaterials:+implications+for+tissue+engineering.">The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering.</a> Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).</li><li>Erdem, S., G&#252;r, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions.">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li><li>Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing:+part+I.">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds.">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine.">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li><li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling.">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response.">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction.">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li><li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction.">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li><li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable,+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications.">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li><li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+polymerizations:+untapped+potential+for+biomaterials.">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).</li><li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells.">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li><li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression.">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li><li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine.">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li><li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance.">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li><li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry:+practices,+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials.">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , (2003).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy.">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li><li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts.">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li><li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties.">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).</li><li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+sputum:+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways.">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li><li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry.">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li></ol>

Bu derleme, tek tip bir hücre süspansiyonu elde etmek için biyomateryal implantlardan hücreleri izole etmek için ayrıntılı bir metodolojiyi açıklamaktadır. Ek olarak, çok renkli akış sitometrisi için hücre süspansiyonunun boyanması için ayrıntılı bir protokol ve optimum sonuçlar için bir akış sitometresi yapılandırma adımları sağlanmıştır. Hücre izolasyon yöntemleri, dokudaki hücre dışı matrisi ayrıştırmak ve tek tek hücreleri dokudan serbest bırakmak için hücre-hücre bağl...

Tıp alanındaki gelişmeler, hasarlı dokunun işlevini veya yeniden büyümesini desteklemek için implante edilen malzemelerin sıklıkla kullanılmasına yol açmıştır 1,2. Bunlar arasında kalp pilleri, rekonstrüktif kozmetik implantlar ve kemik kırığı fiksasyonu için kullanılan ortopedik plakalar gibi cihazlar bulunur 3,4. Ancak bu implantları yapmak için kullanılan materyaller ve implante edildikleri yerler bu implantların başarısını belirlemede önemli rol oynamaktadır 5,6,7. Yabancı cisimler olarak, bu implantlar konakçıdan reddedilmeye veya toleransa yol açabilecek bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir8. Bu faktör, implantasyondan sonra istenen bağışıklık tepkisini çekebilecek materyaller üretmek için biyomateryal araştırmalarını yönlendirmiştir 9,10,11,12.
Bağışıklık tepkisi, hasarlı bir doku veya organın değiştirilmesi için bir laboratuvarda bir doku veya organın bir biyomateryal iskeleti (iskele) etrafında büyütüldüğü rejeneratif tıp alanında temel bir gerekliliktir13,14,15,16. Rejeneratif tıpta amaç, her biri bağışıklık tepkileri tarafından büyük ölçüde modüle edilebilen hücreler, sinyaller ve iskeleler kullanarak eksik veya hasarlı dokuyu değiştirmektir17. Ayrıca, immün yanıt eksikliği istendiğinde bile, çok nadiren istenen düzenleyici bir profilin varlığından ziyade immün aktivitenin yokluğudur18. Akış sitometrisi gibi teknikler, implant cihazlarını kaplamak veya doku mühendisliği için iskele geliştirmek için kullanılan çeşitli biyomalzemelere karşı bağışıklık tepkisi modelini karakterize etmede önemli bir rol oynayabilir19.
Bu bilgi, sonuçta, bağışıklık sistemi tarafından iyi tolere edilebilen implantlar için biyomateryallerin geliştirilmesine veya doku mühendisliğinde yapıcı bir rol oynayabilecek iskelelerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Akış sitometrisi ile analiz için numunelerin uygun şekilde hazırlanması, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla immün karakterizasyonda yanlış sonuçlardan kaçınmak için önemli bir adımdır20,21. Bu nedenle, bu derleme, hücrelerin iskele dokusundan izolasyonu, hücre süspansiyonunun boyanması ve akım sitometrisi ile analizi için kullanılabilecek ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>566385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td>For only fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>For preparing FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>Clone: M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117325</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD197 PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120121</td>
			<td>Clone: 4B12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200R3 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142207</td>
			<td>Clone: Ba13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141705</td>
			<td>Clone: C068C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612778</td>
			<td>Clone: 104/A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564199</td>
			<td>Clone: GL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100737</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comp Bead anti-mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td>For compensation control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123113</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>For fixing and permeabilization of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Buffer to supplement cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Blend of purified Collagenase I and Collagenase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6c AF488</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128015</td>
			<td>Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6g BV510</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127633</td>
			<td>Clone: 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>742894</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875176</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740388</td>
			<td>Clone: E50-2440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom 96-well plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-dimensionality flow cytometry for immune function analysis of dissected implant tissues

Laboratuvarda yetiştirilen bir doku veya tıbbi bir cihazın bir bireye implante edilmesinin başarısı, alıcı konağın bağışıklık tepkisine bağlıdır. Bir implantı yabancı bir cisim olarak kabul etmek, düşmanca ve düzensiz bir bağışıklık tepkisi implantın reddedilmesine neden olabilirken, düzenlenmiş bir yanıt ve homeostazın yeniden kazanılması, kabulüne yol açabilir. İn vivo veya ex vivo ortamlarda diseke edilen implantların mikro ortamlarının analiz edilmesi, sonuçta yeni nesil biyomateryallerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek bağışıklık tepkisi modelinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerini ve alt kümelerini hücre yüzey belirteçlerine göre karakterize etmek için iyi bilinen bir tekniktir. Bu derlemede, diseke edilmiş implant dokusundan tek tip hücre süspansiyonlarının izolasyonu için manuel küp küp doğrama, enzimatik sindirim ve bir hücre süzgecinden filtrasyona dayalı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, bu izole edilmiş hücreleri akış sitometrisi ile karakterize etmek ve ölçmek için ilk sitometre ayarları için adımlarla birlikte çok renkli bir akış sitometrisi boyama protokolü açıklanmıştır.

İmmün analiz için akış sitometrisi panellerinin geliştirilmesi süreci genellikle sonuçların mevcut verilerle ve alandaki literatürle karşılaştırılmasına dayanır. Popülasyonların akış sitometrisinde nasıl bulunabileceğinin bilinmesi, verilerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Ne olursa olsun, popülasyonlar ve hücre tipleri farklı dokularda farklı görünebilir, bu nedenle bazı değişkenlikler beklenebilir. İyi tanımlanmış kontrol dokuları...

Watch this Scientific Journal Video about High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues at JoVE.com

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Bu protokol, daha sonra gelecekteki daha iyi tıbbi implantların tasarlanmasına yardımcı olabilecek farklı biyomalzemelere karşı konakçı bağışıklık tepkisini karakterize etmemize yardımcı olabilir. Akış sitometrisi bize bir biyomateryale sızan bağışıklık hücreleri hakkında bilgi verir, bu da hücrelerin yaralanmaya ve materyal implantasyonuna nasıl tepki verdiğinin mekanizmalarını ve ayrıca gelişmiş terapötikler için hedefleri belirlememize yardımcı olur. Aynı protokol, farklı ortamlarda bağışıklık tepkisini karakterize etmek için değiştirilebilir.Bir hafta önce ECM implantı alan ve beş mililitre serumsuz ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplanan farelerin dörtlü kasını inceleyin. Sonunda makas kullanarak dokuyu doğradı. Daha sonra, tüpe beş mililitre sindirim enzimi ortamı ekleyin.Sindirim ortamı ve doğranmış dokuları içeren tüpü, 37 santigrat derece ve 100 RPM'de 45 dakika boyunca çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, sindirilmiş doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik ayrı bir tüpe süzün. Herhangi bir katı doku parçasını ezmek için beş mililitrelik bir şırınga kafası kullanın ve süzgeci oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.Süzgeçte kalan kalıntıları atın ve tüpün hacmini oda sıcaklığında PBS ile 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri PBS'de 10 mililitre soğuk beş milimolar EDTA çözeltisinde yeniden süspanse edin. Numunede kan hücreleri varsa, peleti bir mililitre RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin, 10 dakika inkübe edin, ardından dokuz mililitre EDTA ekleyin.Süspansiyonu 10 dakika buz üzerinde bırakın. Ardından soğuk PBS ile ses seviyesini 50 mililitreye ayarlayın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri ve 100 mikrolitre soğuk PBS'yi yeniden süspanse edin.Süspansiyonun 10 mikrolitresini ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve saymak için 10 mikrolitre trip ve mavi ile karıştırın. Kalan hücre hacmini, V tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Kuyudan 20 mikrolitre hücre çıkarın ve lekesiz kontrol olarak kullanmak için yeni bir kuyuya ekleyin.Ardından, her bir kuyucuktaki son hacmi 200 mikrolitreye getirmek için PBS kullanın. Santrifüjleme ile plaka kuyucuklarının altındaki hücreleri toplayın ve hücreleri kuyucuk başına bir ila 1000 konsantrasyonda canlılık boyasının 100 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, her bir kuyucuğu 100 mikrolitre taze PBS ile yıkayın ve peletleri oyuk başına 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri 50 mikrolitrelik bir ila 100 monosit bloker seyreltmesinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve ardından 50 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin. Işıktan korunan buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Daha sonra kuyucukları kuyu başına 100 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 200 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. İşlemi iki kez daha tekrarlayın, ardından hücreleri 400 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin.Örneği analiz etmeden önce, hücre popülasyonunun bir yan dağılım ile bir ileri dağılım grafiğinde ayarlanmasına izin vermek için boyanmamış bir örnek çalıştırın. Ardından, lekeli örneği çalıştırın. Otofloresan imzayı ayıklayın.Ardından, karıştırmayı çözmek için bir kontrol olarak kullanmak üzere FCS dosyalarını içe aktarın. Karıştırma sihirbazını açmak için karıştırma simgesine tıklayın ve pozitif ve negatif popülasyonları geçitleyerek tüm tek renk kontrollerini kullanarak karıştırma işlemini gerçekleştirin. Ardından, QC bölümüne tıklayın ve karmaşıklık endeksine bakın.Karmaşıklık indeksi, spektral imzalar birbirine karıştırılmadığında bir spektral imza koleksiyonunun ne kadar ayırt edilebilir olduğunun bir ölçüsüdür. Son olarak, canlı karışımı kaldır'a tıklayarak örneği karıştırın. Burada, kontrol faresi dokusu üzerindeki 14 renk gerçeğinin sonuçları gözlemlenebilir.Bu analizde, ly6g pozitif nötrofiller ve ly6c orta ve yüksek eksprese eden monosit sınıfları gibi çeşitli lobici popülasyonlar gözlemlenebilir. CD11c yüksek MHC iki pozitif dendritik hücre, makrofajları ve nötrofiller ve monositler gibi diğer miyeloid soy hücrelerini ekarte etmek için CD11b'ye karşı kapılandığında kolayca belirgindi. CD206 pozitif CD86 pozitif dendritik hücrelerin bir alt kümesi, hem CD86 yüksek M1 benzeri dendritik hücreleri hem de CD206 yüksek M2 benzeri dendritik hücre popülasyonlarını içeren bu CD11c pozitif popülasyona odaklanarak tanımlanabilir.F4/80, çeşitli makrofaj popülasyonlarında yaygın olarak gözlemlendiği gibi bir ekspresyon gradyanı gösterdi. Siglec-F, hem F4-80 pozitif hem de negatif popülasyonlarda mevcuttu ve büyük olasılıkla sırasıyla bir makrofaj alt kümesine ve eozinofillere karşılık geliyordu. Hücre yüzeyi belirteçleri ile boyama, hücre tiplerinin bu tanımlamalarının yapılmasına izin verse de, farklı belirteçleri ifade eden hücrelerin daha ikili bir sınıflandırmanın aksine işlevsel bir şekilde görülmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.Bu protokolü denerken, panelinizi tasarlamadan önce alt boyanmış numunelerinizin otofloresan imzasını anlamanın, daha iyi ve karıştırma elde etmenin anahtarı olduğunu unutmayın. Hücrelerin analiz edilmesinin yanı sıra, izole edilen hücreler, hücresel tahliller, in vitro, transkriptomik analiz veya hücresel morfolojiyi değerlendirmek için mikroskobik analiz ile aşağı akış değerlendirmeleri için spesifik popülasyonlara ayrılabilir. Biyomalzemelerin akış sitometrisi analizlerinin artan karmaşıklığı, temel immünoloji çalışmaları ile yeni terapötiklerin mühendisliği arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Biyomühendislik

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...