Name: transuterine fetal tracheal occlusion model in mice
Uploaded: 2021-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice at JoVE.com

Denne forskningen mottok ikke noe spesifikt tilskudd fra finansieringsbyråer i offentlig, kommersiell eller ideell sektor. Alle forfattere har gitt betydelige bidrag til oppfatningen og utformingen av studien, oppkjøpet, analysen og tolkningen av data, utarbeidet artikkelen og revidert den for viktig intellektuelt innhold og endelig godkjenning av versjonen som skal sendes inn. Forfatterne takker Can Sabuncuoğlu for hans vennlige innsats for produksjon av kunstverket til den kirurgiske teknikken.

Alle eksperimenter har overholdt National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, revidert 1978). Prosedyren ble godkjent med IACUC-protokollen #2016-0068 av Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse
<ol><li>For å parre alderstilpassede wild-type (WT) C57BL /6 mus, plasser dem i samme bur kl. 18:00.m. og skill dem kl. 09:00.m. neste dag.</li>
	<li>For å bestemme embryonal dag...

<ol>
	<li>Wright, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+PaedSurg+Research+Collaboration.+Management+and+outcomes+of+gastrointestinal+congenital+anomalies+in+low,+middle+and+high+income+countries:+protocol+for+a+multicentre,+international,+prospective+cohort+study.">Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study.</a> BMJ Open. 9, 030452 (2019).</li><li>Aydin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approach+for+prenatally+diagnosed+congenital+anomalies+that+requires+surgery.">Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery.</a> Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).</li><li>Nolan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorrhage+after+on-ECMO+repair+of+CDH+is+equivalent+for+muscle+flap+and+prosthetic+patch.">Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).</li><li>Aydin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+diaphragmatic+hernia:+the+good,+the+bad,+and+the+tough.">Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough.</a> Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).</li><li>Ayd&#305;n, E., &#214;zler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peir&#243;, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+congenital+diaphragmatic+hernia-associated+musculoskeletal+deformities.">Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities.</a> Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).</li><li>Ayd&#305;n, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+primary+repair+is+not+enough:+a+comparison+of+synthetic+patch+and+muscle+flap+closure+in+congenital+diaphragmatic+hernia.">When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).</li><li>Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+fetal+tracheal+ligation+prevents+the+pulmonary+hypoplasia+associated+with+fetal+nephrectomy:+Possible+application+for+congenital+diaphragmatic+hernia.">Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).</li><li>Mudri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+tracheal+occlusion+on+Wnt+signaling+in+a+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia.">The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).</li><li>Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+occlusion:+a+review+of+obstructing+fetal+lungs+to+make+them+grow+and+mature.">Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+animal+models+to+human+congenital+diaphragmatic+hernia.">Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).</li><li>Varisco, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+reversal+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+ephrin+signaling+following+tracheal+occlusion+in+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia.">Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).</li></ol>

Denne metoden beskriver en kirurgisk prosedyre for fosterets trakeal okklusjon hos mus og dens innvirkning på lungeutviklingen. Det er noen kritiske trinn i protokollen som bør utføres nøye for vellykket TIL. Varmen i plattformen som operasjonen foregår på og saltvann introdusert i bukhulen er avgjørende for graviditetens progresjon. I tillegg må det påføres et lite trykk på valpens hode for å sikre eksponering av nakken.
En 6,0 polypropylen sutur er den eneste suturen som kan bruk...

Medfødt diafragmatisk brokk (CDH) forekommer i 1:2500 svangerskap og resulterer i lunge hypoplasi og neonatal lunge hypertensjon1,2,3,4,5,6. Føtal trakeal okklusjon (TO) er en etablert prenatal behandling hos alvorlige CDH-pasienter som involverer fosterkopi i den 26-30 svangerskapsuken der en ballong plasseres like over karinaen og deretter fjernes i den 32. Denne midlertidige TO induserer fosterets lungevekst og forbedrer overlevelsen. Medfødt high airway obstruksjon syndrom er en dødelig tilstand forbundet med lunge hyperplasi, som inspirerte kirurger til å utføre kunstig okklusjon av luftrøret for å fremme oppbevaring av utskilt epitelvæske. Denne okklusjonen økte lystrykket og induserte lungevekst7. Okklusjonen bør imidlertid reverseres for å muliggjøre epitelcellemodning.
Ulike dyremodeller av CDH og TO - ovine, kanin, rotte og mus - er utviklet for å forstå patofysiologien til CDH og TO. Alle har sine egne fordeler og ulemper som teknikkens vanskelighetsgrad, dyrets størrelse, kostnad, høy dødelighet og tilgjengeligheten av genetiske verktøy. Selv om den kirurgiske teknikken som brukes til eggstokkmodellen er svært lik den som brukes hos mennesker og kan reverseres, er de store ulempene ved denne modellen bekostning av dyret, den lange svangerskapsperioden og det begrensede antall operasjoner mulig. Kaninmodellen har en kortere svangerskapsperiode og er billigere enn sauemodellen. Kaninmodellen er imidlertid irreversibel8,9. Murine-modellen har lavest pris, det høyeste antallet fostre per graviditet, det best karakteriserte genomet og allment tilgjengelige verktøy for cellulære og molekylære analyser. En viktig ulempe er imidlertid mangelen på reversibilitet for TIL, noe som forhindrer full forståelse av virkningen av TIL. Heri presenteres en metode som kombinerer alle fordelene ved de tidligere nevnte modellene og skaper en enkel, potensielt reversibel og minimalt invasiv gnager TIL-modell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>Par Pharmaceutical</td>
			<td>NDC 42023-179-05</td>
			<td>For regional anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>&#160;Halocarbon Life Sciences</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td>For general anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification glasses</td>
			<td>USA Medical-Surgical</td>
			<td>SLR-250LBLK</td>
			<td>At least 2.5x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon 90i microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>3417</td>
			<td>Motorized Fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Tissue Kit&#160;</td>
			<td>Macherey-Nagel, D&#252;ren, Germany</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher, IL, USA</td>
			<td>23225</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>VCP451H</td>
			<td>4-0, 24 mm, cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine slides&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>48382-117</td>
			<td>Microscope adhesion slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y432H</td>
			<td>6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td>
			<td>R0278-50ml</td>
			<td>Protein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>VCP682G</td>
			<td>4-0, 24 mm, cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transuterine fetal tracheal occlusion model in mice

Fosterets trakeale okklusjon (TO), en etablert behandlingsmodalitet, fremmer fosterets lungevekst og overlevelse i alvorlig medfødt diafragmatisk brokk (CDH). Etter TIL øker oppbevaringen av den utskilte epitelvæsken lystrykket og induserer lungevekst. Ulike dyremodeller er definert for å forstå patofysiologien til CDH og TO. Alle har sine egne fordeler og ulemper som teknikkens vanskelighetsgrad, dyrets størrelse, kostnad, høy dødelighet og tilgjengeligheten av genetiske verktøy. Her beskrives en ny transuterinmodell av murinfetisal TO. Gravide mus ble bedøvet, og livmoren eksponert via en midline laparotomi. Luftrøret til utvalgte fostre ble ligatert med en enkelt transuterin sutur plassert bak luftrøret, en halspulsåre og en jugulær vene. Demningen ble stengt og fikk lov til å komme seg. Fostre ble samlet inn like før fødselen. Lunge-til-kroppsvekt-forholdet hos TIL-fostre var høyere enn hos kontrollfostrene. Denne modellen gir forskerne et nytt verktøy for å studere effekten av både TIL og økt lystrykk på lungeutvikling.

Denne studien undersøkte 37 fostre: 20 (54,1 %) sammenlignet med 17 (45,9 %) som kontroll. Siden luftrøret ikke kunne okkluderes i 4 fostre i TIL-gruppen, ble de ekskludert fra studien. Det var ingen signifikant forskjell i dødelighet i begge gruppene: 4 fostre (25 %) i TIL-gruppen og 2 fostre (12 %) i kontrollgruppen (p = 0,334, oddsforhold (OR) 2,5, 95% konfidensintervall (KI) 0,39-16,05). Gjennomsnittlig kroppsvekt, lungevekt og lunge-til-kroppsvekt-forhold (LBWR) var høyere i TIL-...

Watch this Scientific Journal Video about Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice at JoVE.com

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Ulike dyremodeller av medfødt diafragmatisk brokk og fostertrekk okklusjon presenterer fordeler og ulemper ved etiske problemer, kostnader, kirurgiske vanskeligheter, størrelse, overlevelse og tilgjengelighet av genetiske verktøy. Denne modellen gir et nytt verktøy for å studere effekten av både trakeal okklusjon og økt lystrykk på lungeutvikling.

Transuterine Fetal Tracheal Okklusjonsmodell hos mus

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

De viktigste fordelene med denne teknikken er reversibilitet, reduksjon i kostnader for dyr og vedlikehold, og en kortere graviditetsperiode. Videre reduseres dyredødeligheten fordi det ikke er behov for hysterektomi. Og det er bredere muligheter for genetisk arbeid.Denne teknikken kan brukes til å undersøke patofysiologien til den medfødte diafragmatiske brokk. Det kan også brukes til å forstå andre sykdommer i lungen, som kyr og lungehyplasia. Begynn med å la musene parre seg i samme bur fra 18:00 til 09:00 neste dag.For å bestemme E0, observere vaginalpluggen som har en homogen, ytre sone festet til vaginalveggen og en indre sone som er fibrøst og inkluderer noen spermatozoer som danner viklet masser blandet med fibrene i pluggmaterialet. Registrer vekten av musene på parringstidspunktet og på E10 for å sikre pågående graviditet og utføre operasjonen på E16.5. Steriliser instrumentene som skal brukes under operasjonen.Forvarm operasjonsplattformen til 24 grader Celsius og lag varm saltvann før operasjonen. Skap et varmt miljø for utvinning og la våt mat inne i buret for tidlig fôring. Rengjør bukoverflaten med alkohol og povidon jod og opprettholde sterile forhold gjennom hele operasjonen.Utfør et vertikalt snitt for laparotomi av gravide dammer og kutt alle lag separat. Identifiser livmorhornene på hver side og bestem kandidatfostrene for operasjonen. Operere på to fostre i hvert livmorhorn hvis det er et jevnt antall fostre på hver side.Og på ett foster i hvert livmorhorn hvis det er et oddetall. Bruk 2X forstørrelsesglass for visualisering, plasser livmorhornet på en tverrgående måte. Plasser valpene vendt oppover mellom to fingre ved hjelp av øynene og halen som en guide.Påfør forsiktig trykk på valpens hode for å tillate forlengelse av hodet og visualisering av nakken. Utfør trakeal okklusjon eller TIL ved hjelp av en atraumatisk nål og en 6 x 0 polypropylen sutur. Hold morkaken på siden og langt fra nålens inngangs- og utgangspunkter.Sett nålen tverrgående gjennom livmorens side, vekk fra morkaken gjennom den en tredjedel fremre delen av nakken. Beveg deretter nålen forsiktig til midtlinjen av nakken. Rett den til den fremre delen.Gå deretter ut av nakken mellom luftrøret og motsatt karotishylse og livmor. Knut suturen, pass på å opprettholde integriteten til membranene og livmorveggen. Bytt livmorhornet i magen og injiser to milliliter varm steril saltvann i bukhulen før lukking.Plasser en løpende 5 x 0 polyglactin sutur for å lukke bukveggen. Og lukk huden med en ikke-løpende silke sutur. Påfør 0,1 mikrogram per kilo buprenorfin intraperitonealt for analgesi og la demningen komme seg i en varm inkubator.Vær oppmerksom på at det opererte dyret kan mate seg selv og holde det alene i sitt individuelle bur. Høst alle fostrene ved E18.5 ved ceasarean-delen og sjekk deres levedyktighet ved å se på bevegelsene deres. Vei alle fostrene.Utfør et vertikalt snitt på thoraxen for en thoraxmy for å dissekere lungene. Og vei dem for å beregne totalt lunge-til kroppsvekt-forhold. Smør vevet i flytende nitrogen, optimal forbindelse med skjæretemperatur og tørris.Klipp prøvene i seksjoner på 10 mikrometer ved hjelp av en kryostat, og monter dem på polylysinbelagte lysbilder. Stek lysbildene over natten på 60 grader Celsius og flekk de bakte lysbildene med hematoksylin og eosin. Bilde av lysbildene ved 10 til 20X forstørrelse, ved hjelp av et widefield mikroskop.For protein- og DNA-analyser, snap fryse vevet og homogenisert det i 300 mikroliter av radioimmunoprecipitation analyse buffer. Sentrifuge ved 18.000 x g og 4 grader Celsius i fem minutter. Trekk deretter ut og kvantifisere protein, DNA og RNA.Gjennomsnittlig kroppsvekt, lungevekt og LBWR var høyere i TIL-gruppen enn i kontrollgruppen. Lunge-DNA-mengder og DNA-til-protein-forholdet var høyere i TIL-gruppen. Det ble ikke observert noen forskjell i lunge RNA, og proteinmengdene var lavere i TIL-gruppen enn i kontrollgruppen.Histologiske analyser av E18.5-kontroll lungene viste sen eller tidlig sakkulær stadium av lungeutvikling med utvikling av luftrom og fortykket interstitium mellom epiteloverflater. Lungene i TO-gruppen hadde utvidet sentrale og distale luftrom med subjektivt høyere antall kjerner. Når du prøver denne protokollen, Vi fikser suturene på en måte som fosterets øyne er synlige og nakken forlenges slik at nålen ikke forstyrrer de justerte strukturene.Fjerning av strukturene til gjenfødelsen av fosteret i nitrilviften og knockout-modellene av CDH vil være fremtidige anvendelser av denne teknikken.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

Instrumentering av Near-term Fetal Sheep for Multivariate kroniske ikke-bedøvede Recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fosterets musen hjerte Imaging bruker høyfrekvente ultralyd (30 / 45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Høy frekvens ultralyd for analyse av Fetal og Placental utvikling i Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Dyrking og måle fosterets og nyfødt murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating patte-til-avvenning overgang in vitro bruker fosterets intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...