Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

نشكر ماريا بيا ديبالما على تحرير الفيديو. كما نشكر مكتب التوعية التعليمية والخدمات الطلابية في جامعة ولاية أريزونا على مساعدتهم السخية في رسوم النشر. وقد دعمت البحث لهذا البروتوكول من قبل كلية علوم الحياة، جامعة ولاية أريزونا.

1. زراعة N. بنثاميانا النباتات
<ol><li>ضع كريات الخث التربة على صينية وتصب مسلوقة سابقا، لا تزال ساخنة (~ 40-45 درجة مئوية)، والمياه على الكريات الخث للتوسع الكامل. بعد يتم توسيع الكريات بالكامل، مكان 2-3 N. بذور بنثاميانا على كل بيليه الخث باستخدام ملاقط.</li>
	<li>صب حوالي 0....

ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقق البصرية من أي أب المؤتلف أو البروتين المؤتلف المنتجة في N. بنثاميانا النباتات، بما في ذلك تلك التي تتطلب التعرض المؤقت للبيئات الحمضية لأغراض تنقية العمود42،43،44. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون دمج asGF...

وتشير تقارير الصناعة إلى أن ثلاثة عشر من أصل العقاقير العشرين الأكثر دخلاً في الولايات المتحدة كانت بيولوجية (أدوية قائمة على البروتين)، منها تسعة أدوية مضادة. اعتبارا من عام 2019، كان هناك أكثر من 570 الأجسام المضادة (AB) العلاج في مختلف مراحل التنمية السريرية1,2,3. مبيعات AB العالمية الحالية تتجاوز 100 مليار دولار أمريكي، ومن المتوقع أن يحقق سوق العلاجية Ab (mAb) أحادية النسيلة ما يصل إلى 300 مليار دولار أمريكي بحلول عام 20251،4. مع هذا الطلب المرتفع والزيادات المتوقعة في الإيرادات ، يعمل الباحثون على تطوير طرق لإنتاج علاجات Ab على نطاق أكبر من أي وقت مضى ، مع جودة أعلى وتكاليف أقل. نظم التعبير النباتية لديها العديد من المزايا على خطوط الخلايا الثدييات التقليدية لتصنيع بأسعار معقولة وعلى نطاق واسع من العلاجات Ab5،6. إنتاج علاجات البروتين في النباتات ("pharming الجزيئية") لا يتطلب المفاعلات الحيوية باهظة الثمن أو مرافق زراعة الخلايا كما تفعل الثدييات التقليدية تقنيات زراعة الخلايا7,8. لا يمكن للنباتات أن تُسْتَمِر مسببات الأمراض البشرية، مما يقلل من التلوث المحتمل9. ويمكن استخدام كل من التعبير البروتيني النباتي العابر والمحول وراثياً كبدائل أقل تكلفة لنظم إنتاج الثدييات أو البكتيرية10. على الرغم من أن النباتات المعدلة وراثيا هي المفضلة لإنتاج المحاصيل، إنتاج البروتين المؤتلف باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تتطلب أسابيع إلى أشهر. التقدم في التعبير العابر باستخدام ناقلات الفيروسية إما عن طريق حقنة أو فراغ الزراعية تصفية تسمح لإنتاج الصغيرة وعلى نطاق واسع، على التوالي، من البروتين المطلوب في أيام11،12،13،14. إنتاج mAbs ضد الإيبولا، حمى الضنك و، زيكا، والعديد من البروتينات المؤتلفة الأخرى، وقد تم إنتاج وتنقيت بسرعة وكفاءة باستخدام التعبير العابر في N. النباتات بنثاميانا 15،16،17،18،19. هذه الظروف تجعل التعبير النباتي العابر خيارا جذابا لتطوير علاجات Ab متعددة والأساليب التي أظهرت في هذا البروتوكول20.
وكان الجيل الأول mAbs من الاشتقاق المورين، مما أدى إلى عدم مناعة محددة عند استخدامها في التجارب البشرية21. مع مرور الوقت، تم إنتاج الشميرك، أنسانية، وفي نهاية المطاف، ABS الإنسان بالكامل لتقليل المناعة الناجمة عن علاجات Ab. للأسف، بعض هذه عبس لا تزال تسبب المُضيف المناعي بسبب الاختلافات في جليكوسيل21. وقد سمحت التطورات في هندسة النباتات لتعديل جليكلان Ab ، وهو أمر ضروري منذ استقرار Ab وظيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل الدولة glycosylation22. وقد سمحت التطورات الإنتاج في النظم النباتية من التعبير على مستوى عال من mAbs أنس، التي تحتوي على الجليكانات الإنسان ونتيجة لذلك الصفات البيولوجية المطلوبة من الأدوية البشرية المنتجة على نطاق واسع19،21.
بالإضافة إلى عبس المؤتلف، تم استكشاف جزيئات الانصهار Ab (Ab fusions) لأغراض مختلفة في العقود الأخيرة. يتكون الانصهار AB في كثير من الأحيان من جزء Ab أو Ab منصهر لجزيء أو بروتين ومصممة للحصول على استجابات من الخلايا المناعية23. وقد تم إنشاء هذه الجزيئات كتدخلات علاجية محتملة لعلاج الأمراض المختلفة مثل السرطان وأمراض المناعة الذاتية24,25,26,27. المجمعات المناعية المؤتلفة (RICs) هي فئة أخرى من الانصهار Ab التي تم توظيفها كمرشحين للقاح28. RICs الاستفادة من قدرة الجهاز المناعي للتعرف على مناطق Fc من الانصهار Ab وقد تم العثور على تحسين المناعية عند دمجها مع منصات لقاح أخرى29,30,31.
بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو بروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قناديل البحر Aequorea فيكتوريا، الذي ينبعث الضوء الأخضر عندما متحمس من قبل الأشعة فوق البنفسجية32،33. على مر السنين، وقد توسعت استخدام GFP كعلامة بصرية للتعبير الجيني من التعبير في Escherichia القولونية إلى العديد من أنظمة التعبير البروتين، بما في ذلك N. النباتات بنثاميانا 34،35،36،37،38. وللعلامات المرئية، مثل برنامج التعليم العام، آثار كثيرة في تدريس المفاهيم العلمية وتعلمها. يصف العديد من الطلاب المبتدئين صعوبات في فهم المفاهيم العلمية عندما تكون الفكرة التي يتم تدريسها غير مرئية للعين المجردة ، مثل مفاهيم البيولوجيا الجزيئية والمجالات ذات الصلة39. وبالتالي، يمكن للعلامات البصرية، مثل برنامج العمل العالمي، أن تسهم في معالجة المعلومات المتعلقة بالعمليات العلمية ويمكن أن تساعد في تقليل الصعوبات التي يبلغ عنها الطلاب في تعلم العديد من المفاهيم العلمية.
على الرغم من أن GFP غالبا ما يستخدم كعلامة للإشارة إلى الجينات والتعبير في الجسم الحي، فمن الصعب تصور ذلك في العمليات المصب إذا كان استخدام الظروف الحمضية. هذا الظرف هو في المقام الأول لأن GFP لا يحافظ على هيكلها وفلورسنس الناتجة في انخفاض40. وغالبا ما تكون هناك حاجة إلى بيئات حمضية مؤقتة في عمليات تنقية مختلفة، مثل البروتين G، البروتين A، و بروتين L الكروماتوغرافيا، وغالبا ما تستخدم لتنقية Ab41،42،43،44. وقد استخدمت المسوخ GFP للاحتفاظ الفلوريسنس تحت الظروف الحمضية45,46.
هنا نحن وصف طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية من البروتينات الانصهار IgG المؤتلف في N. النباتات بنثاميانا. أنتجنا GFP التقليدية تنصهر إلى N-هدفينوس من سلسلة ثقيلة IgG أنساء، وخلق الانصهار GFP-IgG. في الوقت نفسه ، طورنا دمج تسلسل codon المصنع الأمثل لGFP حمض مستقرة (asGFP) إلى N-terminus من سلسلة ثقيلة IgG أنس ، وخلق الانصهار asGFP - IgG. مزايا إنتاج GFP-IgG تشمل القدرة على تصور وجود البروتين المستهدف أثناء التعبير، في حين أن asGFP-IgG يسمح برؤية وجود البروتين المؤتلف ليس فقط في التعبير واستخلاص الخطوات ولكن أيضا في خطوات تنقية البروتين. يمكن تكييف هذا البروتوكول لإنتاج وتنقية وتصور مجموعة من بروتينات الانصهار GFP المنتجة في N. benthamiana وتنقيتها باستخدام تقنيات الكروماتوغرافيا التي تتطلب انخفاض في الحموضة. ويمكن أيضا أن تكون مصممة هذه العملية لكميات مختلفة من مواد ورقة. في حين أن Abs والبروتينات الانصهار الموسومة مع GFP أو asGFP لا يقصد استخدامها للعلاجات ، يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط أثناء التجارب ويمكن أيضا أن تستخدم كأداة تعليمية للبيولوجيا الجزيئية والخلوية والتكنولوجيا الحيوية ، سواء في شخص أو تقريبا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

ارتفاع الطلب على الأجسام المضادة كتدخلات علاجية لمختلف الأمراض المعدية، الأيضية، المناعة الذاتية، النيبلاستيك، وغيرها من الأمراض يخلق حاجة متزايدة في تطوير أساليب فعالة لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة. اعتبارًا من عام 2019 ، كان هناك أكثر من 70 أجسامًا مضادة أحادية النسيلة وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير ، وهناك إمكانات نمو هائلة. وعلى الرغم من وعدهم، فإن العوامل المقيدة للاستخدام على نطاق واسع هي تكاليف التصنيع وتعقيده. من المحتمل أن تقدم النباتات استراتيجيات تصنيع البروتين منخفضة التكلفة وآمنة وسهلة التوسع. لا يمكن للنباتات مثل Nicotiana benthamiana فقط أن تُطوى وتُجمّع بروتينات الثدييات المعقدة، بل يمكنها أيضًا إضافة تعديلات حاسمة بعد الترجمة مماثلة لتلك التي تقدمها ثقافات خلايا الثدييات. في هذا العمل، باستخدام GFP الأصلي وناديل حمض مستقر من البروتين الفلوري (GFP) منصهرة للأجسام المضادة أحادية النسيلة البشرية، كنا قادرين على تصور التعبير المضاد العابر بأكمله وعملية تنقية من N. النباتات بنثامينا. اعتمادا على الغرض من التجربة ، يمكن أن يضمن الاندماج GFP الأصلي تصورًا أسهل أثناء مرحلة التعبير في النباتات ، بينما يسمح دمج GFP المستقر بالأحماض بالتصور أثناء معالجة المصب. يمكن إجراء هذا الإجراء القابل للتحجيم ومباشر من قبل باحث واحد لإنتاج كميات مليغرام من الأجسام المضادة النقية للغاية أو بروتينات الانصهار الأجسام المضادة في غضون أيام باستخدام عدد قليل من النباتات الصغيرة فقط. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى تصور أي نوع من عملية تنقية الأجسام المضادة وربما العديد من البروتينات الأخرى، سواء في النباتات أو غيرها من أنظمة التعبير. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التقنيات أن تستفيد من التعليمات الافتراضية ويتم تنفيذها في مختبر التدريس من قبل طلاب المرحلة الجامعية الذين يمتلكون الحد الأدنى من الخبرة السابقة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وتوفير أساس لاستكشاف المشاريع القائمة مع تطبيقات في العالم الحقيقي.

توضح هذه الدراسة طريقة سهلة وسريعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة وتصورها في جميع مراحل عمليات المصب. باستخدام N. benthamiana وبعد البروتوكول المقدمة، يمكن أن يتحقق إنتاج البروتين المؤتلف الموصوف هنا في أقل من أسبوع. يظهر سير العمل الكلي للتعبير النباتي، الاستخراج، والتنقية في ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

نحن نصف هنا طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية IgG الإنسان المؤتلف تنصهر إلى GFP في Nicotiana benthamiana. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتنقية وتصور العديد من البروتينات التي تستخدم الكروماتوغرافيا العمود. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول قابل للتكيف مع مختبر التدريس الشخصي والكلي الافتراضي، ويوفر الاستكشاف القائم على المشروع.

إنتاج بروتينات IgG فيوجن أعرب عنها بشكل عابر في نيكوتيانا بنثاميانا

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

هذا هو دليل على طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية IgG الإنسان المؤتلف تنصهر إلى GFP في النباتات نيكوتيانا بنثاميانا التبغ ذات الصلة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية وتصور الأجسام المضادة المنتجة في النباتات ، وانصهارات الأجسام المضادة ، ومعظم البروتينات التي يمكن تنقيتها من خلال الكروماتوغرافيا العمود. يسمح هذا البروتوكول للباحثين والطلاب في مختبرات العمل الجامعية بتصور البروتينات الموسومة GFP في معظم خطوات عملية إنتاج البروتين.وضع الكريات الخث التربة على صينية وتصب المغلي سابقا، لا يزال الماء الساخن على الكريات الخث للتوسع الكامل. الكريات سوف يستغرق بضع دقائق لتوسيع كامل. بعد توسيع المنصات بشكل كامل، ضع اثنين إلى ثلاثة بذور Nicotiana benthamiana على كل بيليه الخث باستخدام ملاقط.بعد ذلك، ستحتاج إلى صب حوالي 0.5 بوصة من الماء لتغطية الجزء السفلي من الدرج. لا تنسى أن تسمية علبة مع تاريخ البذر. الاستمرار في المياه الشتلات يوميا مع كميات مناسبة من الأسمدة.يجب أن تكون مغطاة علبة مع أعلى humidome ومكان في غرفة النمو. وينبغي أن تبقى بيليه الجفت المصنف في غرفة النمو في 23 إلى 25 درجة مئوية مع فترة صورة 16 ساعة والرطوبة النسبية 60٪. بعد أسبوع واحد، وإزالة نبات إضافي من بيليه ترك كل البليت الخث مع شتلة واحدة فقط.عندما تكون النباتات من عمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، قم بنقل كل بيليه خث إلى وعاء فردي يحتوي على رطوبة تسيطر عليها التربة. مواصلة شتلات المياه يوميا مع غرام واحد لكل لتر الأسمدة، أبدا ترك التربة جافة تماما. النباتات جاهزة للتسلل عندما يكون عمرها 5 إلى 6 أسابيعيجب أن يتم الخطوات التالية بجانب ناسخ بونسن وينبغي تطبيق التقنيات الأساسية المطهرة لتجنب التلوث. سوف تحتاج إلى لوحة lb kanamycin. تركيز واحد من ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين.صارمة مع اثنين من الطفرات EHA105 إيواء الخاص بك المطلوب البناء مقاومة kanamycin ونمت بين عشية وضحاها. EHA105 هي واحدة من السلالات الأكثر استخداما من Agrobacterium اثنين من الطفرات. لبدء الثقافة، وملء أنبوب مخروطي مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام lb، المقبل، في 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل المليلتر كاناميسين، يمكنك أيضا إضافة 10 ميكرولترات من 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من ريفامبيسين لمنع تلوث القولونية e-.من لوحة، عليك استخدام مستعمرة معزولة واحدة التحقق من قبل PCR لتنمية ثقافتك الجديدة. اختيار مستعمرة معزولة الخاص بك وتطعيمه في رطل. وضع التطعيم على شاكر.احتضان في 30 درجة مئوية و 120 إلى 150 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إذا تم رسمها ثقافة البكتيريا الزراعية إلى OD600 يساوي 0.6 إلى 0.9 يمكن استخدامها للتسلل. إذا كان متضخم OD600 فوق واحد إلى مليلتر واحد ينبغي نقل إلى رطل الطازجة مع المضادات الحيوية ونمت إلى OD600 المطلوبة.مرة واحدة في OD600 المناسبة وضع الثقافات في جهاز طرد مركزي، والتأكد من أن جهاز الطرد المركزي متوازن. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4، 500G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا يمكنهم التراكب من كلتا العينتينثم إعادة تعليق كل بيليه واحد X تسلل العازلة لتحقيق OD النهائي إلى 0.4. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من كل بناء الانصهار IgG مع بناء سلسلة الضوء، للحصول على OD النهائي من 0.2 لكل بناء في كل أنبوب. خذ مشبك ورق و5 إلى 6 أسابيع من العمر ومصنع بنثاميانا من الخطوة الأولى.باستخدام حافة حادة مشبك الورق تكشفت جعل ثقب صغير في الطبقة البشرة الأولى من ورقة. تجنب ثقب ورقة على طول الطريق من خلال. ملء حقنة ملليلتر واحد دون إبرة تعلق مع حل الزراعية البكتيريا المعدة من الخطوة الثانية.تغطية ثقب المحرز في الخطوة السابقة مع نهاية الحقنة. وتدفع ببطء لحقن البكتيريا في ورقة بينما تطبيق ضغط العداد لطيف من وراء ورقة. محاولة التسلل إلى معظم ورقة وكزة ورقة كحد أقصى من ثلاث إلى أربع مرات، قد الضرر ورقة الزائدة تعوق إنتاج البروتين.مشاهدة ورقة داكنة كما يتم حقن الحل دون ممارسة الكثير من الضغط على الحقنة. ورقة النبات المتسللة سوف تظهر في الغالب الظلام من وجهة النظر السفلية. لاحظ أن هذا الحل البكتيري يجب أن يكون كافياً لما لا يقل عن ثلاثة إلى أربعة نباتات لكل بناء.اتوماتيف أي محلول بكتيري متبقي قبل التخلص منه. بعد الانتهاء من تسرب إبرة أقل، وضع النباتات مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا. لاحظ أوراق للكلور، نخر وكذلك لفلوريسنس GFP، مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويلة وقصيرة الموجة في فصل الشتاء.عادة ما يترك في الأيام أربعة وخمسة تظهر أعلى الفلورس GFP. حصاد جميع الأوراق في أربعة إلى خمسة أيام بعد التسلل ووزنها المبلغ الإجمالي لمواد ورقة. يمكنك استخدام مادة ورقة فورا لمعالجة المصب، أو يمكنك تجميده في السلبية 80 درجة مئوية حتى أنها مستعدة لاستخدام مكان النباتات تسلل مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا.لاحظ أوراق للكلور، نخر، التغيرات في اللون وموت الأنسجة ورقة في المناطق المتسللة. محطات الملاحظة لفلوريسنس GFP. إذا كان GFP موجود تحت موجة طويلة وقصيرة مصباح الأشعة فوق البنفسجية.يزيد تعبير البروتين بمرور الوقت، مع أعلى الفلورية لكل من بناءات GFP التي تحدث عادة بين أربعة أيام وخمسة أيام. حصاد جميع الأوراق في أربعة إلى خمسة أيام بعد التسلل ووزنها مجموع المواد ورقة. استخدامه على الفور لعمليات المصب أو تجميد في درجة مئوية سلبية 80 حتى جاهزة للاستخدام.أثناء عملية المزج، تأكد من الاحتفاظ بالمخازن المؤقتة وأكواب الخلاط على الجليد أو عند أربع درجات مئوية قبل الاستخدام. ضع الأنسجة النباتية من الخطوة الرابعة إلى كوب الخلاط قبل المحاكمة. في مخزن الاستخراج المبرد الذي يحتوي على تركيزات الـ PMSSF والصوديوم على كأس الخلاط.ضع كوب الخلاط على الخلاط، خذ ورقة ما قبل القطع من فيلم para واتمددها على الجزء العلوي من كأس الخلاط. مزيج من نسيج ورقة مع استخراج العازلة لتخيل 80 مع فواصل 22. سيكون لديك لتحريك جيدا بين دورات مزيج حسب الحاجة.يجب أن يظهر الخليط متجانس بدون قطع من مادة الأوراق. نقل المواد المخلوطة إلى القارق. في شريط اثارة ويحرك لمدة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز ذوبان البروتين والسماح لهطول الأمطار من المواد الصلبة.ضع طبقتين من القماش العاري فوق بواكر نظيف على الجليد وسكب المقتطف من خلاله لإزالة حطام الأوراق الكبيرة. بعد كل استخراج هو سكب من خلال مرآة القماش أضعاف القماش مرآة للضغط على استخراج ورقة المتبقية. يجب أن تظهر استخراج الأخضر الداكن دون الجسيمات مرئية.نقل استخراج إلى أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي استخراج في 16، 000Gs لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. هذا سوف بيليه أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية.تأكد من أن كلا الأنابيب متوازنة وأن غطاء الدوار يتم تشديده بشكل آمن. بعد الطرد المركزي، يجب أن تكون بيليه مرئية، ويقول سوبرناتور والتخلص من بيليه. تصفية المناط باستخدام حقنة 50 ملليلتر وتصفية الألياف الزجاجية.جمع 50 ميكرولترات من عينة وتسمية استخراج الخام لتحليلها في وقت لاحق. إعداد عمود البولي بروبلين الذي يحتوي على 20 ملليلتر من العينة. تقدير كمية الطين اللازمة اعتمادا على نوع الغلوبولين المناعي المستهدف وتقاربه مع الراتنج.في هذه المظاهرة، نستخدم ثلاثة ملليلترات من الطين. عموما ثلاثة ملليلتر من الملاط الكلي مع 1.5 ملليلتر حجم السرير هو فعال لتنقية عدة ملليغرام من الأجسام المضادة. بعناية ماصة الكمية المطلوبة من الطين resuspended في العمود توج.افتح منفذ العمود من أسفل العمود واسمح له باستنزفه حتى يختفي معظم المخزن المؤقت. صب على الفور 10 ملليلتر من غسل العازلة مرة واحدة برنامج تلفزيوني على القمة. السماح لها استنزاف وتكرار هذه الخطوة غسل مرتين.تطبيق نموذج تمت تصفيتها من الخطوة الخامسة إلى العمود وجمع تدفق عبر. Aliquot 50 ميكرولترات من تدفق من خلال لتحليلها في وقت لاحق. حفظ بقية تدفق من خلال في حالة عدم ربط الأجسام المضادة في الراتنج.غسل الراتنج مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مرة واحدة للحد من الربط غير محددة. إذا رغبت في ذلك، aliquot 50 ميكرولترات من غسل كما المصارف العازلة من خلال العمود للتحقق من أن الأجسام المضادة الهدف لا يلمح مع عازلة الغسيل. في حين أن العازلة غسل يعمل من خلال الراتنج، والإعداد وتسمية خمسة أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة مع 125 ميكرولترات من العقيمة، واحد المولى تريس-HCL في رقم H8 لتحييد عازلة elution.بدلا من ذلك، إضافة 30 ميكرولترات من اثنين من قاعدة تريس الضرس للحصول على مزيد من eluate تتركز. خلال elution، يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية للتصور. هذا لا يحتاج أن يتمّ طوال المدة من ال elution.إذا كنت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية، تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة لتجنب تلف العينين والجلد. لا يحتاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى أن يستخدم خلال خطوة elution. Elute الأجسام المضادة عن طريق تطبيق خمسة ملليلترات من عازلة elution إلى العمود وجمع كسور ملليلتر واحد، إلى كل أنبوب المعينة من الخطوة السابقة.تجديد العمود فورا عن طريق تطبيق 20 ملليلتر تليها 10 ملليلتر من العازلة الغسيل. ضمان لا يترك الراتنج في بيئة حمضية لفترة طويلة من الزمن. يجب أن يظهر Elution الفلورسنت.وغالبا ما ينظر إلى أعلى fluorescence في elution الثانية، ولكن يمكن أن تختلف من استخراج إلى استخراج. للتخزين، وغسل الراتنج مع 10 ملليلتر من 20٪ الإيثانول وبرنامج تلفزيوني والسماح استنزاف في منتصف الطريق. خلاصة الجزء العلوي، ثم الجزء السفلي من العمود والحفاظ على تستقيم في أربع درجات C.Determine تركيز الأجسام المضادة باستخدام مطياف الصورة عن طريق قياس الامتصاص في 280 نانومتر.تخزين الذرات في درجة مئوية سالبة 80 و aliquot 50 ميكرولترات من كل جزء إلى أنبوب منفصل لمزيد من التحليل. عموما يمكن إعادة استخدام فترات البروتين تصل إلى 10 مرات دون خسارة كبيرة من الكفاءة. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل محددة تحدد تركيز الأجسام المضادة، باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.تخزين الذرات في ناقص 80 درجة مئوية و aliquot 50 ميكرولترات من كل جزء في أنبوب منفصل لمزيد من التحليل. تحليل البروتين النقي من قبل Zs الصفحة يمكن أن يتم عن طريق اتباع البروتوكولات القياسية. لوحظ الفلور نتيجة تشير إلى نجاح الاستنساخ والتسلل والتعبير عن بناء يحتوي على GFP.على مدى بضعة أيام، ينبغي أن الفلورسنت زيادة تدريجية مع الفلورس عالية في الأيام الرابعة والخامسة. عندما يتم استخدام البروتين G بروتين الفلورسنت ملزمة و elution لاحقة من العمود يشير إلى تنقية الانصهار IgG التي تحتوي على كـ GFP مستقرة. وجل الأشعة فوق البنفسجية المكشوفة، يمكنك أن ترى فقط 25KDa و 75KDa العصابات من سلم.يمكنك أيضا أن نرى، غير انخفاض elution 2 العينة. يحتفظ elution غير مخفضة بفلوره كما حجم النسبية التي يتوقعها من IgG سليمة كما الانصهار GFP مستقرة. في الجل وصمة عار coomassie يتم تصور كل من عينات مخفضة وغير مخفضة.جميع مكونات سلم مرئية، ويمكن رؤية البروتينات المحلية والانصهار IgG في استخراج الإجمالي supernatant وتدفق من خلال العينات. يحتوي الغسل على كمية صغيرة من الانصهار IgG. يحتوي Elution واحد وأربعة على بروتين أقل تركيزًا كما هو متوقع لأن معظم البروتين قد استعصى بشكل عام من خطوات الـ elution الثانية والثالثة.Elution 2 غير الحد يمكن أيضا أن ينظر إليها عدة عصابات موجودة في جميع عينات elution الحد. 75KDa يشير إلى سلسلة ثقيلة الصمامات إلى GFP. يشير 50KDa إلى سلسلة ثقيلة وحدها، يشير 25KDa إلى سلسلة ضوئية فقط، ويشير 10 KDA على الأرجح إلى التدهور الذي يمكن منعه من خلال إضافة مثبطات البروتياز.يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية أي جسم مضاد منصهر لأي بروتين مستهدف مرغوب فيه. يمكن تحرير العملية لاستيعاب كميات مختلفة من مواد الأوراق ، كما يسمح بالتصميم البصري لوجود البروتين قبل وأثناء وبعد الانتهاء من عمليات استخراج البروتين وتنقيته. يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط ويمكن أن تكون غرضا لتقنيات التدريس.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

الترشيح الزراعي والإصابة بالزراعة PVX في البطاطا ونيكوتيانا بنثاميانا

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...