Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

我们感谢玛丽亚皮娅迪帕尔玛编辑的视频。我们还感谢亚利桑那州立大学教育外联和学生服务办公室慷慨的出版费援助。该议定书的研究得到了亚利桑那州立大学生命科学学院的支持。

1. 培育 N. 本特塔米亚纳植物
<ol><li>将土壤泥炭颗粒放在托盘上，将以前煮沸、仍然热（+40-45 °C）的泥浆倒在泥炭颗粒上，进行完全膨胀。颗粒完全膨胀后，使用钳子将 2-3 N. 本特纳米纳种子放在每个泥炭颗粒上。</li>
	<li>倒入约0.5入水以盖住托盘底部。将托盘与播种日期标记。继续每天用适当数量的肥料给幼苗浇水。肥料（水溶性多用途植物食品）浓度一?...

该协议可用于视觉验证在N.Benthamiana植物生产的任何重组Ab或重组蛋白，包括那些需要暂时暴露在酸性环境中用于柱纯化目的42，43，44。此外，ASGFP与不同表达系统中的其他蛋白质的融合是实验可视化和教育的有用工具。此处的协议可以进一步缩放到更大和更小的叶材料，以产生所需的重组蛋白量。所述方法利用了先前的?...

行业报告显示，在美国20种最毛额的药物中，有13种是生物制剂（蛋白质为基础的药物），其中9种是抗体。截至2019年，在1、2、3等不同临床开发阶段，有570多种抗体（Ab）治疗。目前全球Ab销售额超过1000亿美元，到2025年1月4日，单克隆Ab（mAb）治疗市场有望创造高达3000亿美元。由于需求如此之高，预计收入将增加，研究人员一直在努力开发各种方法，以更高的质量和更低的成本，在更大范围下生产Ab疗法。植物表达系统比传统的哺乳动物细胞系具有若干优势，可以负担得起和大规模制造Ab治疗剂5，6。在植物中生产蛋白质疗法（"分子法基"）不需要像传统的哺乳动物细胞培养技术7、8那样需要昂贵的生物反应器或细胞培养设施。植物不能收缩人类病原体，最大限度地减少潜在的污染。瞬态和转基因植物蛋白表达都可以作为哺乳动物或细菌生产系统的低成本替代品。虽然转基因植物是作物生产的首选，但使用这种方法重组蛋白质的生产可能需要数周到数月的时间。使用病毒载体通过注射器或真空农业渗透的瞬态表达方面的进步，允许在第11天、第12天、第13天、第14天分别对所需的蛋白质进行小规模和大规模生产。在N.Benthamiana植物15、16、17、18、19中，利用瞬态表达，生产了埃博拉、登革热和寨卡和许多其他重组蛋白的mAbs。这些情况使得瞬态植物表达成为开发多种Ab疗法的有吸引力的选择，并且本协议20中演示的方法。
第一代mAbs是喃自语衍生的，在人体试验21中使用时导致非特异性免疫原性。随着时间的推移，嵌合，人性化，并最终，完全人类Abs产生，以减轻免疫原性诱导Ab治疗。不幸的是，其中一些Abs仍然导致宿主免疫原性，由于糖基化21的差异。植物工程的发展允许对Ab甘油进行改造，这一点至关重要，因为Ab的稳定性和功能可能受到其糖化状态22的显著影响。进步使得植物系统中能够生产出含有人类甘油的高水平表达，并因此产生了大量生产的人类药物19、21所需的生物特性。
近几十年来，除了重组Abs之外，Ab聚变分子（Ab融合）还被探索用于各种目的。Ab融合通常由融合到分子或蛋白质的Ab或Ab片段组成，旨在引起免疫效应细胞23的反应。这些分子已被创建为潜在的治疗干预措施，以治疗各种病理，如癌症和自身免疫性疾病24，25，26，27。重组免疫复合物（RICs）是另一类Ab融合，已被采用作为疫苗候选28。RIC利用免疫系统识别Ab融合的Fc区域的能力，并被发现与其他疫苗平台29，30，31相结合，以提高免疫原性。
绿色荧光蛋白（GFP）是一种生物发光蛋白，源自维多利亚水母，当被紫外线照射时发出绿光32，33。多年来，GFP作为基因表达的视觉标记的使用已经从大肠杆菌的表达扩展到许多蛋白质表达系统，包括N.Benthamiana植物34，35，36，37，38。可见标记，如GP，对科学概念的教学和学习有着丰富的意义。许多入门级学生描述在所教导的想法肉眼看不见时，如分子生物学的概念和相关领域39时，掌握科学概念的困难。因此，视觉标记（如GP）有助于处理与科学过程有关的信息，并有助于减轻学生报告学习许多科学概念时遇到的困难。
虽然GP经常被用作体内指示基因和表达的标记物，但如果使用酸性条件，很难在下游过程中显示它。这种情况的主要原因是GP不保持其结构和由此产生的荧光在低pH40。在各种纯化过程中，通常需要临时酸性环境，如蛋白质G、蛋白质 A和蛋白质L色谱，通常用于Ab纯化41、42、43、44。GFP突变体已用于在酸性条件下保持荧光45，46。
在这里，我们描述了一个简单的方法，用于表达、提取和纯化重组IgG融合 蛋白在N.Benthamiana植物 。我们生产传统的GP融合到人性化IgG重链的N术语，创造了一个GP-IgG融合。同时，我们开发了一种植物共融优化序列的融合，用于酸性稳定 GFP （asGFP） 与人性化 IgG 重链的 N 术语，从而创建 asGFP-IgG 融合。生产GFP-IgG的优点包括能够在表达过程中可视化目标蛋白的存在，而SigFP-IgG则允许在表达和提取步骤中，而且在蛋白质的纯化步骤中看到重组蛋白的存在。该协议可用于生产、纯化和可视化一系列在 N. benthamiana 中生产的 GFP 融合蛋白， 并使用需要低 pH 值的色谱技术进行纯化。该工艺还可以针对各种数量的叶料进行定制。虽然用GFP或 asGFP 标记的 Abs 和融合蛋白并不可用于治疗，但这些方法在实验期间可用作控制，还可以作为分子和细胞生物学和生物技术的教学工具，无论是亲自还是虚拟。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

对抗体作为各种传染性、代谢性、自身免疫性、肿瘤性和其他疾病的治疗干预措施的高需求，对开发有效的重组抗体生产方法的需求日益增长。截至2019年，有70多个FDA批准的单克隆抗体，并且有指数增长的潜力。尽管他们承诺，广泛使用的限制因素是制造成本和复杂性。工厂可能提供低成本、安全和易于扩展的蛋白质制造策略。像 Nicotiana benthamiana 这样的植物不仅能够正确折叠和组装复杂的哺乳动物蛋白质，还可以添加与哺乳动物细胞培养物类似的关键的翻译后修饰。在这项工作中，通过使用原生GP和绿色荧光蛋白（GFP）与人单克隆抗体融合的酸稳定变种，我们能够可视化来自 N.benthamiana 植物的整个瞬态抗体表达和纯化过程。根据实验的目的，本机 GFP 融合可以确保在植物的表达阶段更容易可视化，而酸稳定的 GFP 融合允许在下游处理期间实现可视化。这种可扩展和直接的程序可以由单个研究人员执行，只需几天就使用少数小植物就产生毫克量的高纯抗体或抗体融合蛋白。这种技术可以扩展到任何类型的抗体纯化过程和潜在的许多其他蛋白质的可视化，无论是植物和其他表达系统。此外，这些技术可以有利于虚拟指令，并在教学实验室由拥有分子生物学技术经验最少的本科生在教学实验室中执行，为基于项目的探索和实际应用奠定了基础。

这项研究演示了一种简单而快速的方法，可以产生重组蛋白，并在整个下游过程中可视化它们。使用N. benthamiana并遵循所提供的协议，可在不到一周内实现此处描述的重组蛋白生产。植物表达、提取和纯化的总体工作流程如图1所示。图1 A（1-3）显示了2周大幼苗、4周岁幼苗和6周岁幼苗的生长阶段，而图1B则描绘了因</s...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

我们在这里描述了一个简单的方法，表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GGFP 在尼科蒂亚娜本thamiana。该协议可以扩展到使用柱色谱的众多蛋白质的纯化和可视化。此外，该协议还适用于本学院教学实验室的亲上和虚拟教学实验室，提供基于项目的探索。

在尼科蒂亚娜本 thamiana中瞬态表达IgG融合蛋白的生产

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

这是一个简单的方法的表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GP在烟草相关的尼科蒂亚娜本thamiana植物。该协议可用于纯化和可视化植物产生的抗体、抗体融合和大多数蛋白质，这些蛋白质可以通过柱色谱进行纯化。该协议允许大学工作实验室的研究人员和学生可视化GP标记蛋白质在蛋白质生产过程的最步骤。将土壤泥炭颗粒放在托盘上，将以前煮熟的、仍然热水的热水倒在泥炭颗粒上，进行完全膨胀。颗粒需要几分钟才能完全展开。托盘完全膨胀后，使用钳子在每个泥炭颗粒上放置两到三个尼科蒂亚娜本thamiana 种子。完成此工作后，您需要倒入约 0.5 英寸的水以覆盖托盘的底部。不要忘记将托盘与播种日期标记。继续每天用适当数量的肥料给幼苗浇水。托盘应覆盖一个湿润的上衣，并放在一个生长室。种子泥炭颗粒应保存在23至25摄氏度的生长室，照片周期为16小时，相对湿度为60%。一周后，从颗粒中去除额外的植物，让每个泥炭托盘只剩下一个幼苗。当植物有两到三周大时，将每个泥炭颗粒转移到一个含有水分控制的土壤的单独锅中。继续每天用每升一克肥料给幼苗浇水，绝不让土壤完全干燥。植物在五到六周大时已经做好了渗透的准备。必须在 Bunsen 燃烧器旁边执行以下步骤，并且应应用基本的无菌技术以避免污染。您将需要一个 Lb 卡纳霉素板。每毫升卡纳霉素浓度1微克。严格与两个突变EHA105窝藏你期望的卡那霉素抗性结构，并在一夜之间生长。EHA105是两种突变中最常用的菌株之一。为了开始培养，用10毫升的磅介质填充锥形管，接下来，在10微升，每毫升卡纳霉素100微克，您还可以添加10微升2.5微克每毫升利福霉素，以防止大肠杆菌污染。从盘子里，您将使用 PCR 验证的单一孤立殖民地来发展您的新文化。选择你孤立的殖民地，并接种到磅。将接种放在摇床上。在30摄氏度和120至150 RPM过夜孵育。第二天，如果将农业细菌培养被吸引到等于0.6至0.9的OD600，则可用于渗透。如果过度生长的OD600高于一到两毫升，应转移到一个新鲜的磅抗生素，并成长为所需的OD600。一旦在适当的OD600将培养物放在离心机中，确保离心机是平衡的。在室温下以4，500G离心，将细菌中离心20分钟。他们不能从两个样本中超生。然后重新暂停每个颗粒和一个 X 渗透缓冲液，使最终的 OD 为 0.4。将每个IgG融合构造的相等体积与光链构造相结合，获得每个管中每个构造0.2的最终OD。采取回形针和五到六周大和半面植物从第一步。使用回形针的锋利边缘展开，在叶子的第一个表皮层中形成一个小穿刺。避免一直刺穿叶子。填充一毫升注射器，无需用第二步准备的农业细菌溶液连接针头。用注射器的端盖上一步中孔。然后慢慢推动将细菌注入叶子，同时从叶子后面施加温和的反压。尝试渗透大部分叶和戳叶最多三到四次，过量的叶子损害可能会阻碍蛋白质的产生。在注射溶液时，注意叶变暗，而不会对注射器施加太大的压力。从底部的视图中，渗透的植物叶将大多显示为深色。请注意，这种细菌溶液应该足够至少三到四个植物每个构造。在丢弃之前，请先将任何剩余的细菌溶液中解。完成无针渗透后，将植物放回生长室，继续每天浇水。观察叶的叶为氯化，坏死以及GP荧光，冬季长和短波紫外线灯。通常第四天和第五天离开，显示最高的GP荧光。在渗透后四到五天收获所有叶子，并权衡叶料总量。您可以立即将叶料用于下游加工，也可以在负 80 摄氏度中冷冻，直到它准备好将渗透的植物放回生长室，每天继续浇水。观察渗透区叶叶、坏死、颜色变化和叶组织死亡。GFP 荧光的观察植物。如果 GFP 存在于长波和短波紫外灯下。蛋白质表达随时间而增加，两个GP构造的最高荧光通常发生在第4天和5天之间。在渗透后四到五天收获所有叶子，并称量总叶料。立即用于下游工艺，或在负 80 摄氏度下冻结，直到准备好使用。在混合过程中，请确保在使用前将缓冲液和搅拌杯放在冰上或摄氏四度。将植物组织从第四步放入审前搅拌杯中。在冷却萃取缓冲液中，含有相应的PMSF和抗酸钠浓度，以搅拌杯。将搅拌杯放在搅拌机上，拿一张预切的半膜，然后伸展到搅拌杯的顶部。将叶组织与萃取缓冲液混合，以第 22 个间隔想象 80。您需要根据需要在混合循环之间搅拌良好。混合物应看起来同质，没有叶料块。将混合材料转移到烧杯上。在搅拌棒上搅拌4摄氏度30分钟，以提高蛋白质溶解性，并允许固体沉淀。将两层裸布放在干净的烧杯上，然后倒入碎屑中，清除大叶碎屑。毕竟提取物通过镜布倒入后折叠镜布以挤压残留的叶提取物。提取物应显示为深绿色，没有可见的颗粒物。将萃取器转移到离心管。在摄氏4度下，将萃取器在16，000G下离心20分钟。这将颗粒任何剩余的不溶性材料。确保两个管子均平衡，并且转子盖牢固拧紧。离心后，颗粒应该是可见的，说是上一液，并丢弃颗粒。使用 50 毫升注射器和玻璃纤维过滤器过滤上清液。收集 50 微升样品并标记粗提取物，供以后分析。设置一个包含 20 毫升样品的聚丙烯柱。根据目标免疫球蛋白类型及其与树脂的亲和力估计所需的浆量。在此演示中，我们使用三毫升的泥浆。一般三毫升总浆料与1.5毫升床体积是有效的纯化几毫克抗体。小心地将所需数量的重新泵入盖柱中。从柱底部打开柱出口，并允许其排出，直到大部分缓冲区消失。立即将 10 毫升洗涤缓冲液倒在顶部 1 次 PBS。让它排干，重复这个洗涤步骤两次。将筛选的样本从步骤 5 应用到列并收集流式处理。50 微升的流量为等量，供以后分析。保存其余的流经，以防抗体没有结合到树脂中。用 10 毫升 1 倍 PBS 洗涤树脂两次，以减少非特异性结合。如果需要，当缓冲液通过柱排出时，等同 50 微升的洗涤液将排出，以验证目标抗体是否与洗涤缓冲液有关。当洗涤缓冲液通过树脂运行时，设置并标记五个微离心管，其中125微升无菌，一个摩尔三叶-HCL在pH 8用于中和洗脱缓冲液。或者，添加两个摩尔三叶基的 30 微升，以获得更浓缩的水杨酸盐。在洗脱过程中，UV 光可用于可视化。在洗脱期间不需要这样做。如果您正在使用紫外线，请务必穿戴适当的个人防护设备，以避免对眼睛和皮肤造成伤害。在洗脱步骤期间不需要使用紫外线。通过将五毫升洗脱缓冲液涂抹到柱上，并收集一毫升分数，从上一步的每个指定管中，对抗体进行洗脱。立即通过应用 20 毫升，然后应用 10 毫升洗涤缓冲液重新生成柱。确保树脂长时间不留在酸性环境中。洗脱应出现荧光。通常，最高荧光出现在第二洗脱中，但可能因提取而异。对于储存，用10毫升20%乙醇和PBS清洗树脂，让半排空。回顾一下柱子的顶部，然后回顾柱子的底部，并保持在四摄氏度的直立。将每分的 80 摄氏度和 50 微升的 Eluates 储存到单独的管中，以进行进一步分析。一般来说，蛋白质的持续时间可以重复使用多达10次，而不会造成重大的效率损失。有关确定抗体浓度的具体细节，请参阅制造商指南，使用分光光度计测量 280 纳米的吸光度。将每分的 Eluates 储存在零下 80 摄氏度和每馏分的 50 微升中，放入单独的管中，以作进一步分析。Zs页面对纯化蛋白质的分析可以通过遵循标准协议进行。观察到荧光的结果表明克隆、渗透和表达含有GP的构造是成功的。在几天内，荧光在4天和5天随着高荧光而逐渐增加。当蛋白质G使用荧光蛋白结合，随后从列洗脱表明纯化IgG融合包含作为一个稳定的GP。和紫外线暴露凝胶，你可以看到只有25KDa和75KDa带的梯子。您还可以看到，非减少洗脱2样本。非减小洗脱保持其荧光作为相对大小，人们期望从一个完整的IgG作为其稳定的GP融合。在库马西染色凝胶中，同时对减少和非减少的样品进行可视化。所有梯形成分都是可见的，原生蛋白质和IgG融合可以在总提取上清液和流经样品中看到。洗涤包含少量的IgG融合。洗脱一和四含有较少浓度的蛋白质，因为大多数蛋白质通常从第二和第三洗脱步骤中脱去。洗脱 2 非还原也可以看到多个波段存在于所有减少洗脱样品中。75KDa 表示 GFP 的链条保险丝。50KDa 表示仅重链，25KDa 表示仅轻链，10 KDA 可能表示降解，通过添加蛋白酶抑制剂可以预防。该协议可用于纯化任何抗体融合到任何所需的靶蛋白。该过程可以编辑，以适应不同数量的叶材料，也允许蛋白质的存在之前，期间和之后，蛋白质提取和纯化过程的结论的视觉测定。这些方法可以作为控件使用，并且可用于教学技术。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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