Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Vi takker Maria Pia DiPalma for at redigere videoen. Vi takker også Office of Educational Outreach og Student Services på Arizona State University for deres generøse offentliggørelse gebyr bistand. Forskning for denne protokol blev støttet af School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Dyrk N. benthamiana planter
<ol><li>Placer jord tørv pellets på en bakke og hæld tidligere kogt, stadig varm (~ 40-45 °C), vand over tørv pellets for fuld ekspansion. Efter pellets er fuldt udvidet, sted 2-3 N. benthamiana frø på hver tørv pellet ved hjælp af pincet.</li>
	<li>Hæld omkring 0,5 i vand til at dække bunden af bakken. Mærkning af bakken med såningsdatoen. Fortsæt med at vande planterne dagligt med passende mængder gødning. Gødning (van...

Denne protokol kan anvendes til visuel verifikation af ethvert rekombinant Ab- eller rekombinant protein, der produceres i N. benthamiana-planter, herunder dem, der kræver midlertidig eksponering for sure miljøer tilkolonnerensning 42,43,44. Desuden kan fusion af asGFP til andre proteiner i forskellige udtrykssystemer være et nyttigt redskab til eksperimentel visualisering og uddannelse. Protokollen heri kan yderlige...

Industri rapporter viser, at tretten ud af de tyve mest ekstrapolationsfaktoren narkotika i USA var biologi (protein-baserede lægemidler), hvoraf ni var antistoffer. Fra og med 2019 var der over 570 antistof (Ab) terapeutiske lægemidler i forskellige kliniskeudviklingsfaser 1,2,3. Det nuværende globale Ab-salg overstiger 100mia. Med så stor efterspørgsel og forventede stigninger i indtægterne, forskere har arbejdet på at udvikle måder at producere Ab terapeutiske på en stadig større skala, med højere kvalitet og lavere omkostninger. Plantebaserede ekspressionssystemer har flere fordele i forhold til traditionelle pattedyrcellelinjer til økonomisk overkommelig og storstilet fremstilling af Ab therapeutics5,6. Produktion af proteinterapeuter i planter ("molekylær pharming") kræver ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfaciliteter som traditionelle pattedyrcellekulturteknikker7,8. Planter kan ikke indgå kontrakter med humane patogener, hvilket minimerer potentielforurening 9. Både forbigående og forbigående plantebaseret proteinudtryk kan anvendes som billigere alternativer til pattedyr eller bakterieproduktionssystemer10. Selvom transgene planter foretrækkes til afgrødeproduktion, kan rekombinant proteinproduktion ved hjælp af denne metode kræve uger til måneder. Fremskridt i forbigående udtryk ved hjælp af virale vektorer gennem enten sprøjte eller vakuumagroinfiltrering giver mulighed for henholdsvis små og store produktioner af det ønskede protein idag 11,12,13,14. Produktion af mAbs mod ebola, Dengue og, Zika, og mange andre rekombinant proteiner, er blevet produceret og renset hurtigt og effektivt ved hjælp af forbigående udtryk i N. benthamiana planter15,16,17,18,19. Disse omstændigheder gør forbigående plantebaseret udtryk til en attraktiv mulighed for at udvikle flere Ab-behandlingsformer og de metoder , der er demonstreret i denneprotokol 20.
Første generations mAbs var af murinafledning, hvilket resulterede i ikke-specifik immunogenicitet, når de blev anvendt i forsøg medmennesker 21. Over tid, kimære, humaniseret, og i sidste ende, fuldt menneskelige Abs blev produceret for at mindske immunogenicitet induceret af Ab terapeutiske. Desværre, nogle af disse Abs stadig forårsage vært immunogenicitet på grund af forskelle i glycosylering21. Udviklingen inden for anlægsteknik har gjort det muligt at ændre Ab glycans, hvilket er afgørende, da ab's stabilitet og funktion i væsentlig grad kan påvirkes af dens glycosylationstilstand22. Fremskridt har gjort det muligt at producere i plantesystemer af højt niveau udtryk for humaniserede mAbs, der indeholder menneskelige glycaner og deraf følgende de ønskede biologiske træk af en masseproduceret humanfarmaceutisk 19,21.
Ud over rekombinant Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) er blevet undersøgt til forskellige formål i de seneste årtier. Ab fusioner består ofte af et Ab- eller Ab-fragment, der smeltes sammen med et molekyle eller protein, og er designet til at fremkalde reaktioner fra immuneffektorceller23. Disse molekyler er blevet skabt som potentielle terapeutiske indgreb til behandling af forskellige patologier såsom kræft og autoimmune sygdomme24,25,26,27. Rekombinant immunkomplekser (FC) er en anden klasse af Ab fusioner, der har været ansat som vaccine kandidater28. RIA'er udnytter immunsystemets evne til at genkende Fc-regioner ab fusioner og har vist sig at forbedre immunogeniciteten, når det kombineres med andre vaccineplatforme29,30,31.
Green Fluorescerende Protein (GFP) er et bioluminescerende protein fra vandmænd Aequorea Victoria, som udsender grønt lys, når ophidset af ultraviolet lys32,33. I årenes løb har GFP's brug som en visuel markør for genekspression udvidet fra udtryk i Escherichia coli til talrige proteinudsetrykssystemer, herunder N. benthamiana planter34,35,36,37,38. Synlige markører, såsom GFP, har rigelige konsekvenser i undervisningen og læring af videnskabelige begreber. Talrige entry-level studerende beskriver vanskeligheder gribe videnskabelige begreber, når den idé, der undervises ikke er synlig for det blotte øje, såsom begreberne molekylærbiologi ogbeslægtede områder 39. Visuelle markører, som GFP, kan således bidrage til behandlingen af oplysninger i forbindelse med de videnskabelige processer og kan bidrage til at mindske de vanskeligheder, de studerende rapporterer i at lære en lang række videnskabelige begreber.
Selvom GFP ofte bruges som markør til at angive gene og ekspression in vivo, er det vanskeligt at visualisere det i downstream-processerne, hvis der anvendes sure tilstande. Denne omstændighed skyldes primært , at GFP ikke bevarer sin struktur og deraf følgende fluorescens ved en lav pH40. Midlertidige sure miljøer er ofte påkrævet i forskellige rensningsprocesser, såsom protein G, protein A, og protein L kromatografi, ofte udnyttet til Abrensning 41,42,43,44. GFP-mutanter er blevet anvendt til at bevare fluorescens under sure forhold45,46.
Heri beskriver vi en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant IgG fusion proteiner i N. benthamiana planter. Vi producerede traditionelle GFP smeltet til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en GFP-IgG fusion. Samtidig udviklede vi sammensmeltning af en fabriks codon-optimeret sekvens for en syre-stabil GFP (asGFP) til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en asGFP-IgG fusion. Fordelene ved at producere GFP-IgG omfatter evnen til at visualisere tilstedeværelsen af et målprotein under ekspression, mens asGFP-IgG tillader at se tilstedeværelsen af rekombinant protein i ikke kun udtrykket og ekstraktionstrinene, men også i rensningstrinnene af proteinet. Denne protokol kan tilpasses til produktion, rensning og visualisering af en række GFP fusionsproteiner produceret i N. benthamiana og renses ved hjælp af kromatografiteknikker, der kræver lav pH. Processen kan også skræddersys til forskellige mængder bladmateriale. Mens Abs og fusion proteiner mærket med GFP eller asGFP ikke er beregnet til at blive brugt til behandlinger, disse metoder kan være nyttige som kontrol under eksperimenter og kan også yderligere udnyttes som et pædagogisk redskab til molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både in-person og næsten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

Stor efterspørgsel efter antistoffer som terapeutiske indgreb for forskellige smitsomme, metaboliske, autoimmune, neoplastiske og andre sygdomme skaber et stigende behov for at udvikle effektive metoder til rekombinant antistofproduktion. Fra 2019 var der mere end 70 FDA-godkendte monoklonale antistoffer, og der er eksponentielt vækstpotentiale. På trods af deres løfte, begrænsende faktorer for udbredt brug er produktionsomkostninger og kompleksitet. Potentielt tilbyder planter billige, sikre og let skalerbare proteinfremstillingsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana ikke kun kan korrekt folde og samle komplekse pattedyr proteiner, men også kan tilføje kritiske post-translationelle ændringer svarende til dem, der tilbydes af pattedyr cellekulturer. I dette arbejde, ved hjælp af indfødte GFP og en syre-stabil variant af grønne fluorescerende protein (GFP) smeltet til menneskelige monoklonale antistoffer, vi var i stand til at visualisere hele forbigående antistof udtryk og rensning proces fra N. benthamiana planter. Afhængigt af eksperimentets formål kan oprindelig GFP-fusion sikre lettere visualisering i ekspressionsfasen i planterne, mens syresabil GFP-fusion giver mulighed for visualisering under downstream-behandling. Denne skalerbare og enkle procedure kan udføres af en enkelt forsker til at producere milligram mængder af meget rent antistof eller antistof fusion proteiner i løbet af få dage ved hjælp af kun et par små planter. En sådan teknik kan udvides til visualisering af enhver form for antistofrensningsproces og potentielt mange andre proteiner, både i plante- og andre ekspressionssystemer. Desuden kan disse teknikker gavne virtuelle instruktioner og blive udført i et undervisningslaboratorium af bachelorstuderende, der besidder minimal forudgående erfaring med molekylærbiologiske teknikker, hvilket giver et fundament for projektbaseret udforskning med applikationer fra den virkelige verden.

Denne undersøgelse viser en nem og hurtig metode til at producere rekombinant proteiner og visualisere dem i hele downstream processer. Ved hjælp af N. benthamiana og efter den medfølgende protokol kan rekombinant proteinproduktion, der er beskrevet her, opnås på mindre end en uge. Den overordnede arbejdsgang for planteudtryk, udvinding og rensning er vist i figur 1. Stadierne af plantevækst fra 2 uger gamle planter, 4 uger gamle planter og 6 uger gamle planter vises i <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Vi beskriver her en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant menneskelige IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokol kan udvides til rensning og visualisering af mange proteiner, der udnytter kolonnekromatografi. Desuden er protokollen kan tilpasses til in-person og virtuelle college undervisning laboratorium, der giver projektbaseret udforskning.

Produktion af IgG Fusion Proteiner Transiently Udtrykt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Dette er en demonstration af en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant humane IgG smeltet til GFP i tobak relaterede Nicotiana benthamiana planter. Denne protokol kan anvendes til rensning og visualisering af planteproducerede antistoffer, antistoffusioner og de fleste proteiner, der kan renses gennem kolonnekromatografi. Denne protokol giver forskere og studerende på universitetsarbejdslaboratorier mulighed for at visualisere GFP-mærkede proteiner på de fleste trin i proteinproduktionsprocessen.Placer jord tørv pellets på en bakke og hæld tidligere kogt, stadig varmt vand over tørv pellets for fuld ekspansion. Pellets vil tage et par minutter at udvide fuldt ud. Når pallerne er fuldt udbygget, skal du placere to til tre Nicotiana benthamiana-frø på hver tørvepellet ved hjælp af pincet.Når dette er gjort, skal du hælde omkring 0,5 inches af vand til at dække bunden af bakken. Glem ikke at mærke bakken med såning dato. Fortsæt med at vande planterne dagligt med passende mængder gødning.Bakken skal dækkes med en humidome top og sted i et vækstkammer. Den seedede tørv pellet bør holdes i vækstkammeret ved 23 til 25 grader Celsius med en 16 timers foto periode og 60% relativ luftfugtighed. Efter en uge skal du fjerne et ekstra anlæg fra pelletsen og forlade hver tørvepalle med kun én sætteplante.Når planterne er to til tre uger gamle, overføre hver tørv pellet til en individuel gryde, der indeholder fugt kontrolleret jord. Fortsæt med at vandplanter dagligt med et gram per liter gødning, aldrig forlade jorden helt tør. Planter er klar til infiltration, når de er fem til seks uger gamle.Følgende trin skal udføres ved siden af en Bunsen-brænder, og der bør anvendes grundlæggende aseptiske teknikker for at undgå kontaminering. Du skal bruge en Lb kanamycin plade. Et mikrogram pr. milliliter kanamycinkoncentration.streng med en to mutationer EHA105 huser din ønskede kanamycin resistente konstruere og dyrkes natten over. EHA105 er en af de mest almindeligt anvendte stammer af Agrobacterium to mutationer. For at begynde kulturen, fylde koniske rør med 10 milliliter lb medier, næste, ved 10 mikroliter af 100 mikrogram pr. milliliter kanamycin, kan du også tilføje 10 mikroliter af 2,5 mikrogram pr. milliliter rifampicin for at forhindre e-coli forurening.Fra pladen skal du bruge en enkelt isoleret koloni, der er verificeret af PCR, til at udvikle din nye kultur. Vælg din isolerede koloni og inokuler det i lb. Angær vaccinationen på shakeren.inkuberes ved 30 grader Celsius og 120 til 150 omdr./min. natten over. Den næste dag, hvis Agrobacterium kultur er tiltrukket af OD600 svarende til 0,6 til 0,9 det kan bruges til infiltration. Hvis det er tilgroet OD600 over en en til to milliliter bør overføres til en frisk lb med antibiotika og dyrkes til den krævede OD600.Når på passende OD600 placere kulturer i en centrifuge, og sørg for, at centrifugen er afbalanceret. Pelt bakterierne ved centrifugering ved 4, 500G i 20 minutter ved stuetemperatur. De kan ikke overdrere fra begge prøver.Derefter resuspendere hver pellet og en X infiltration buffer til at bringe den endelige OD til 0,4. Kombiner lige store mængder af hver IgG fusion konstruktion med lyskæde konstruktion, for at få den endelige OD på 0,2 pr konstruk i hvert rør. Tag en papirclips og en fem til seks uger gammel og benthamiana plante fra trin et.Brug af papirclips skarpe kant udfoldet gøre en lille punktering i den første epidermal lag af bladet. Undgå at punktere bladet hele vejen igennem. Fyld en millilitersprøjte uden en nål fastgjort med den forberedte Agrobacterium-opløsning fra trin to.Dæk hullet i det forrige trin med enden af sprøjten. Og langsomt skubbe til at injicere bakterier i bladet, mens der anvendes blid modtryk bag bladet. Prøv at infiltrere det meste af bladet og stikke bladet højst tre til fire gange, overskydende bladskader kan hindre protein udbytte.Se bladet blive mørkere, da opløsningen injiceres uden at lægge for meget pres på sprøjten. Det infiltrerede planteblad vises for det meste mørkt fra bundvisning. Bemærk, at denne bakterielle opløsning bør være nok til mindst tre til fire planter pr konstruktion.Autoklave eventuelle resterende bakterielle opløsning før kasséring. Efter at have afsluttet nål-mindre infiltration, placere planter tilbage i vækstkammer og fortsætte med at vand dagligt. Observerede bladene til chlorose, nekrose samt for GFP fluorescens, vinter lang og kort bølge UV-lampe.Normalt blade på dag fire og fem viser den højeste GFP fluorescens. Høst alle bladene på fire til fem dage efter infiltration og afveje den samlede mængde bladmateriale. Du kan bruge bladmaterialet straks til downstream-behandling, eller du kan fryse det i negative 80 grader Celsius, indtil det er klar til brug Placer de infiltrerede planter tilbage i vækstkammeret og fortsætte med at vande dagligt.observerede bladene til chlorose, nekrose, ændringer i farve og bladvæv død i infiltrerede områder. Observerede planter for GFP fluorescens. Hvis GFP er til stede under en lang og kortbølget UV-lampe.Proteinudtryk stiger over tid, med den højeste fluorescens af begge GFP konstruktioner generelt forekommer mellem dag fire og fem. Høst alle bladene på fire til fem dage efter infiltration og afveje det samlede bladmateriale. Brug det straks til downstream processer eller fryse ved negative 80 grader Celsius indtil klar til brug.Under blandingsprocessen skal du sørge for at holde buffere og blenderkopper på is eller ved fire grader Celsius før brug. Placer plantevæv fra trin fire i pretrial blender kop. Ved kølet ekstraktionsbuffer, der indeholder respektive PMSF- og natrium ascorbatkoncentrationer til blenderkoppen.Placer blenderkoppen på blenderen, tag et forskåret ark parafilm og stræk den over toppen af blenderkoppen. Blend bladvævet med ekstraktionsbuffer for at forestille sig 80 med 22. Du bliver nødt til at røre godt mellem blanding cykler efter behov.Blandingen skal forekomme homogen uden stykker af bladmateriale. Overfør blandet materiale til et bægerglas. På en røre bar og rør det i fire grader Celsius i 30 minutter for at forbedre protein opløselighed og tillade udfældning af faste stoffer.Placer to lag af nøgne klud over et rent bægerglas på is og hæld ekstraktet gennem det for at fjerne store bladrester. Efter alt ekstraktet hældes gennem spejlet klud fold spejlet klud til at presse den resterende blad ekstrakt. Ekstraktet skal fremstå mørkegrønt uden synlige partikler.Ekstraktet overføres til centrifugerør. Centrifuge ekstraktet på 16, 000Gs i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dette vil pellet eventuelle resterende uopløselige materiale.Sørg for, at begge rør er afbalancerede, og at rotorlåget er forsvarligt strammet. Efter centrifugering skal pellet være synlig, siger supernatant og kassér pellet. Supernatanten filtreres med en 50 millilitersprøjte og glasfiberfilter.Der udtages 50 mikroliter af en prøve og mærke råekstrakt til senere analyse. Opret en polypropylen kolonne, der indeholder 20 milliliter prøve. Anslå mængden af gylle, der er nødvendig, afhængigt af målimmunglobulintypen og dens affinitet til harpiksen.I denne demonstration bruger vi tre milliliter gylle. Generelt tre milliliter total gylle med 1,5 milliliter seng volumen er effektiv til rensning af flere milligram antistof. Pipetter forsigtigt den nødvendige mængde resuspenderet gylle i den udjævnede kolonne.Åbn kolonneudtaget fra bunden af kolonnen, og lad den løbe ud, indtil det meste af bufferen er væk. Hæld straks 10 milliliter vaskepude en gange PBS på toppen. Lad det dræne og gentag dette vask trin to gange.Anvend det filtrerede prøve fra trin fem til kolonnen, og opsaml gennemstrømningen. Aliquot 50 mikroliter af flow-through til senere analyse. Gem resten af flow-through, hvis antistoffet ikke binder sig til harpiksen.Harpiksen vaskes to gange med 10 milliliter på én gange PBS for at reducere ikke-specifik binding. Hvis det ønskes, aliquot 50 mikroliter af vask som bufferen afløb gennem kolonnen for at kontrollere, at målet antistof ikke er hentydet med en vask buffer. Mens vaskebufferen løber gennem harpiksen, opsættes og mærke fem mikrocentrifugerør med 125 mikroliter sterile, en molar tris-HCL ved pH otte for at neutralisere elueringsbufferen.Alternativt tilsættes 30 mikroliter af to molar tris base for at få mere koncentreret eluat. Under elution kan UV-lys anvendes til visualisering. Dette behøver ikke at ske under hele elueringen.Hvis du UV bliver brugt, skal du sørge for at bære passende personlige værnemidler for at undgå skader på øjne og hud. Det er ikke nødvendigt at bruge et UV-lys under elueringstrinnet. Antistofferne fremkaldes ved at påføre fem milliliter elution-buffer på kolonnen og opsaml en milliliterfraktion på hvert udpeget rør fra det foregående trin.Kolonnen regenereres straks ved at påføre 20 milliliter efterfulgt af 10 ml vaskepude. Sørg for, at harpiksen ikke efterlades i et surt miljø i længere tid. Elution skal fremstå fluorescerende.Ofte ses den højeste fluorescens i den anden elution, men kan variere fra ekstraktion til ekstraktion. Til opbevaring vaskes harpiksen med 10 milliliter 20% ethanol og PBS, og afløb halvvejs. Resumé toppen, derefter bunden af kolonnen og holde oprejst ved fire grader C.Bestem antistofkoncentrationen ved hjælp af et fotospektrometer ved at måle absorbans ved 280 nanometer.Eluaterne opbevares i negative 80 grader Celsius og aliquot 50 mikroliter af hver fraktion til et separat rør til yderligere analyse. Generelt protein varigheder kan genbruges op til 10 gange uden betydelige tab af effektivitet. Se producentens retningslinjer for specifikke detaljer bestemme antistofkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer ved måling af absorbans ved 280 nanometer.Eluaterne opbevares i minus 80 grader Celsius og aliquot 50 mikroliter af hver fraktion i et separat rør til yderligere analyse. Analyse af renset protein ved Zs side kan gøres ved at følge standard protokoller. Observeret fluorescens som følge heraf indikerer succes kloning, infiltration og udtryk for en konstruktion, der indeholder GFP.I løbet af et par dage, fluorescerende bør gradvist stige med høj fluorescens på dag fire og fem. Når protein G anvendes fluorescerende proteinbinding og efterfølgende elution fra kolonnen indikerer rensning af en IgG fusion, der indeholder som en stabil GFP. Og den UV-eksponerede gel, kan du kun se 25KDa og 75KDa bands af stigen.Du kan også se, den ikke reducerede elution 2 prøve. Den ikke-reducerede eluering bevarer sin fluorescens som den relative størrelse man ville forvente fra en intakt IgG som sin stabile GFP fusion. I coomassie pletgel både reduceret og ikke reduceret prøver visualiseres.Alle stigen komponenter er synlige, indfødte proteiner og IgG fusioner kan ses i den samlede ekstrakt supernatant og flyde gennem prøver. Vasken indeholder en lille mængde IgG fusion. Elution et og fire indeholdt mindre koncentreret protein som forventet, da de fleste protein generelt har unddraget sig fra det andet og tredje elution trin.Elution 2 ikke-reduktion kan også ses flere bånd findes i alle reducere elution prøver. 75KDa angiver en tung kædesikring til GFP. 50KDa angiver en tung kæde alene, 25KDa indikerer en lyskæde alene, og 10 KDA indikerer sandsynligvis nedbrydning, som kan forebygges ved tilsætning af proteasehæmmere.Denne protokol kan bruges til rensning af ethvert antistof smeltet til enhver ønsket mål protein. Processen kan redigeres for at imødekomme forskellige mængder af bladmateriale, og giver også mulighed for visuel bestemmelse af protein tilstedeværelse før, under og efter afslutningen af protein ekstraktion og rensning processer. Disse metoder kan være nyttige som kontrol og kan være formål med undervisningsteknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse af SNARE-medieret membranfusion anvendelse af en enzymatisk Cellefusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration og PVX Agroinfection i kartoffel og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering og udnyttelse af<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medieret Forbigående Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase komplementering Imaging Assay i Nicotiana benthamiana blade for forbigående bestemmelse af Protein-protein interaktion Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...