Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Wij danken Maria Pia DiPalma voor het bewerken van de video. We danken ook het Office of Educational Outreach and Student Services aan de Arizona State University voor hun genereuze publicatie vergoeding bijstand. Onderzoek voor dit protocol werd ondersteund door de School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Cultiveren N. benthamiana planten
<ol><li>Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog warm (~ 40-45 °C), water over de turf pellets voor volledige expansie. Na pellets zijn volledig uitgebreid, plaats 2-3 N. benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.</li>
	<li>Giet ongeveer 0,5 in water om de bodem van de lade te bedekken. Label de lade met de opzaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeve...

Dit protocol kan worden gebruikt voor de visuele verificatie van alle recombinant Ab of recombinant eiwit geproduceerd in N. benthamiana planten, met inbegrip van die vereisen tijdelijke blootstelling aan zure omgevingen voor kolom zuivering doeleinden42,43,44. Bovendien kan de fusie van asGFP naar andere eiwitten in verschillende expressiesystemen een nuttig hulpmiddel zijn voor experimentele visualisatie en onderwijs....

Industrie rapporten geven aan dat dertien van de twintig meest brutowinst drugs in de Verenigde Staten waren biologische (eiwit-gebaseerde geneesmiddelen), waarvan negen waren antilichamen. Vanaf 2019 waren er meer dan 570 antilichaam (Ab) therapieën in verschillende klinische ontwikkelingsfasen1,2,3. De huidige wereldwijde ab-omzet bedraagt meer dan 100 miljard USD en de monoklonale ab (mAb) therapeutische markt zal naar verwachting tot 300 miljard USD genereren in 20251,4. Met zo'n hoge vraag en verwachte stijgingen van de inkomsten, onderzoekers hebben gewerkt aan manieren om Ab therapeutics te produceren op een steeds grotere schaal, met een hogere kwaliteit en lagere kosten te ontwikkelen. Plantaardige expressiesystemen hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele zoogdiercellijnen voor de betaalbare en grootschalige productie van Ab therapeutics5,6. Voor de productie van eiwittherapeutisch in planten ("moleculair pharming") zijn geen dure bioreactoren of celkweekfaciliteiten nodig, net als traditionele zoogdiercelkweektechnieken7,8. Planten kunnen geen menselijke ziekteverwekkers oplopen, waardoor potentiële besmetting tot een minimalisering wordtgeminimaliseerd 9. Zowel voorbijgaande als transgene plantaardige eiwitexpressie kan worden gebruikt als goedkopere alternatieven voor zoogdier- of bacteriële productiesystemen10. Hoewel transgene planten de voorkeur hebben voor de productie van gewassen, kan recombinante eiwitproductie met behulp van deze methode weken tot maanden duren. Vooruitgang in tijdelijke expressie met behulp van virale vectoren door middel van spuit of vacuüm agroinfiltratie zorgen voor een kleine en grootschalige productie, respectievelijk, van het gewenste eiwit in de dagen11,12,13,14. De productie van mAbs tegen ebola, Dengue en Zika, en tal van andere recombinante eiwitten, zijn snel en efficiënt geproduceerd en gezuiverd met behulp van tijdelijke expressie in N. benthamiana planten15,16,17,18,19. Deze omstandigheden maken tijdelijke plantaardige expressie een aantrekkelijke optie voor het ontwikkelen van meerdere Ab therapeutica en de methoden die in dit protocol20 wordenaangetoond .
MAb's van de eerste generatie waren van murineafscheiding, wat resulteerde in niet-specifieke immunogeniciteit bij gebruik in menselijke proeven21. Na verloop van tijd, chimeric, gehumaniseerd, en uiteindelijk, volledig menselijke Abs werden geproduceerd om immunogeniciteit veroorzaakt door Ab therapeutica te verminderen. Helaas veroorzaken sommige van deze Abs nog steeds gastheer immunogeniciteit als gevolg van verschillen in glycosylation21. Ontwikkelingen in de installatietechniek hebben gezorgd voor de wijziging van Ab glycans, wat essentieel is omdat de stabiliteit en functie van een Ab aanzienlijk kunnen worden beïnvloed door zijn glycosylation staat22. De vooruitgang heeft de productie in plantaardige systemen van hoog-niveauuitdrukking van gehumaniseerde mAbs mogelijk gemaakt, die menselijke glycanen en resulterend de gewenste biologische eigenschappen van een massa-geproduceerde menselijk farmaceutisch19,21bevatten .
Naast recombinant Abs, Ab fusie moleculen (Ab fusies) zijn onderzocht voor verschillende doeleinden in de afgelopen decennia. Ab fusies bestaan vaak uit een Ab of Ab fragment gefuseerd tot een molecuul of eiwit en zijn ontworpen om reacties uit te lokken van immuun effector cellen23. Deze moleculen zijn gemaakt als potentiële therapeutische interventies voor de behandeling van verschillende pathologieën zoals kanker en auto-immuunziekten24,25,26,27. Recombinant immune complexs (RICs) zijn een andere klasse van Ab fusies die zijn gebruikt als vaccin kandidaten28. RICs maken gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om de Fc-regio's van Ab-fusies te herkennen en blijken de immunogeniciteit te verbeteren in combinatie met andere vaccinplatforms29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) is een bioluminescent eiwit afkomstig van de kwal Aequorea Victoria, die groen licht uitzendt wanneer opgewonden door ultraviolet licht32,33. In de loop der jaren is het gebruik van GFP als visuele marker van genexpressie uitgebreid van expressie in Escherichia coli tot tal van eiwitexpressiesystemen, waaronder N. benthamiana-planten 34,35,36,37,38. Zichtbare markers, zoals GFP, hebben overvloedige implicaties in het onderwijzen en leren van wetenschappelijke concepten. Tal van instapstudenten beschrijven moeilijkheden bij het begrijpen van wetenschappelijke concepten wanneer het idee dat wordt onderwezen niet met het blote oog zichtbaar is, zoals de concepten van moleculaire biologie en aanverwante gebieden39. Visuele markers, zoals GFP, kunnen zo bijdragen aan de verwerking van informatie met betrekking tot de wetenschappelijke processen en kunnen helpen de moeilijkheden te verminderen die studenten rapporteren bij het leren van tal van wetenschappelijke concepten.
Hoewel GFP vaak wordt gebruikt als een marker om gen en expressie in vivoaan te geven, is het moeilijk om het te visualiseren in de downstream processen bij het gebruik van zure omstandigheden. Deze omstandigheid is voornamelijk omdat GFP zijn structuur en resulterende fluorescentie niet behoudt bij een lage pH40. Tijdelijke zure omgevingen zijn vaak nodig in verschillende zuiveringsprocessen, zoals eiwit G, eiwit A, en eiwit L chromatografie, vaak gebruikt voor Ab zuivering41,42,43,44. GFP-mutanten zijn gebruikt om fluorescentie onder zure omstandigheden45,46te behouden .
Hierin beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinante IgG fusie-eiwitten in N. benthamiana planten. We produceerden traditionele GFP gefuseerd naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een GFP-IgG fusie. Tegelijkertijd ontwikkelden we de fusie van een plant codon-geoptimaliseerde sequentie voor een zuur-stabiele GFP (asGFP) naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een asGFP-IgG fusie. De voordelen van het produceren van GFP-IgG omvatten de mogelijkheid om de aanwezigheid van een doeleiwit tijdens expressie te visualiseren, terwijl asGFP-IgG het mogelijk maakt om de aanwezigheid van recombinant eiwit te zien in niet alleen de expressie- en extractiestappen, maar ook in de zuiveringsstappen van het eiwit. Dit protocol kan worden aangepast voor de productie, zuivering en visualisatie van een reeks GFP-fusie-eiwitten geproduceerd in N. benthamiana en gezuiverd met behulp van chromatografietechnieken die een lage pH vereisen. Het proces kan ook worden afgestemd op verschillende hoeveelheden bladmateriaal. Terwijl Abs en fusie-eiwitten gelabeld met GFP of asGFP zijn niet bedoeld om te worden gebruikt voor therapieën, deze methoden kunnen nuttig zijn als controles tijdens experimenten en kan ook verder worden gebruikt als een leermiddel voor moleculaire en cellulaire biologie en biotechnologie, zowel in-persoon en vrijwel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

De grote vraag naar antilichamen als therapeutische interventies voor verschillende infectieuze, metabole, auto-immuun-, neoplastische en andere ziekten creëert een groeiende behoefte aan het ontwikkelen van efficiënte methoden voor recombinante antilichaamproductie. Vanaf 2019 waren er meer dan 70 door de FDA goedgekeurde monoklonale antilichamen en is er een exponentieel groeipotentieel. Ondanks hun belofte, beperkende factoren voor wijdverbreid gebruik zijn productiekosten en complexiteit. Mogelijk bieden fabrieken goedkope, veilige en gemakkelijk schaalbare eiwitproductiestrategieën. Planten zoals Nicotiana benthamiana kunnen niet alleen complexe zoogdiereiwitten correct vouwen en assembleren, maar kunnen ook kritische post-translationele wijzigingen toevoegen die vergelijkbaar zijn met die van celculturen van zoogdieren. In dit werk, met behulp van native GFP en een zuur-stabiele variant van groene fluorescerende eiwitten (GFP) versmolten met menselijke monoklonale antilichamen, waren we in staat om de gehele voorbijgaande antilichaam expressie en zuivering proces van N. benthamiana planten visualiseren. Afhankelijk van het doel van het experiment kan native GFP-fusie zorgen voor een eenvoudigere visualisatie tijdens de expressiefase in de planten, terwijl zuur-stabiele GFP-fusie visualisatie mogelijk maakt tijdens downstreamverwerking. Deze schaalbare en eenvoudige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker om milligram hoeveelheden zeer zuivere antilichaam of antilichaam fusie eiwitten te produceren in een kwestie van dagen met behulp van slechts een paar kleine planten. Een dergelijke techniek kan worden uitgebreid tot de visualisatie van elk type antilichaam zuiveringsproces en mogelijk vele andere eiwitten, zowel in plantaardige als andere expressiesystemen. Bovendien kunnen deze technieken profiteren van virtuele instructies en worden uitgevoerd in een academisch laboratorium door undergraduate studenten met minimale eerdere ervaring met moleculaire biologie technieken, het verstrekken van een basis voor project-based exploratie met real-world toepassingen.

Deze studie toont een eenvoudige en snelle methode aan om recombinante eiwitten te produceren en te visualiseren in downstream processen. Met behulp van N. benthamiana en volgens het meegeleverde protocol, recombinante eiwitproductie hier beschreven kan worden bereikt in minder dan een week. De algemene workflow van plantenexpressie, extractie en zuivering wordt weergegeven in figuur 1. De stadia van plantengroei van 2 weken oude zaailingen, 4 weken oude planten en 6 weken oude plan...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Dit is een demonstratie van een eenvoudige methode voor expressie, extractie, en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in tabak gerelateerde Nicotiana benthamiana planten. Dit protocol kan worden gebruikt voor zuivering en visualisatie van door planten geproduceerde antilichamen, antilichaamfusies en de meeste eiwitten die kunnen worden gezuiverd door middel van kolomchromatografie. Dit protocol stelt onderzoekers en studenten van universitaire werklaboratoria in staat om GFP-gelabelde eiwitten te visualiseren in de meeste stappen van het eiwitproductieproces.Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog steeds warm water over de turf pellets voor volledige expansie. Pellets zal een paar minuten duren om volledig uit te breiden. Nadat pallets volledig zijn uitgebreid, plaats twee tot drie Nicotiana benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.Nadat dit is gedaan, moet je ongeveer 0,5 centimeter water gieten om de bodem van de lade te bedekken. Vergeet niet om de lade te labelen met de zaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeveelheden kunstmest.De lade moet worden bedekt met een vochtige omtop en plaats in een groeikamer. De ingezaaide turfpellet moet in de groeikamer worden bewaard op 23 tot 25 graden Celsius met een fotoperiode van 16 uur en een relatieve luchtvochtigheid van 60%. Na een week, verwijder een extra plant uit de pellet verlaten elke turf pallet met slechts een zaailing.Wanneer de planten twee tot drie weken oud zijn, breng elke turfpellet over naar een individuele pot met vochtgecontroleerde grond. Blijf water zaailingen dagelijks met een gram per liter meststof, laat nooit de grond volledig droog. Planten zijn klaar voor infiltratie als ze vijf tot zes weken oud zijn.De volgende stappen moeten worden uitgevoerd naast een Bunsen-brander en basisaseptische technieken moeten worden toegepast om besmetting te voorkomen. Je hebt een Lb kanamycine plaat nodig. Een microgram per milliliter kanamycine concentratie.strikt met een twee mutaties EHA105 herbergen van uw gewenste kanamycine resistente constructie en 's nachts geteeld. EHA105 is een van de meest gebruikte stammen van Agrobacterium twee mutaties. Om te beginnen met de cultuur, vul conische buis met 10 milliliter van lb media, vervolgens, bij 10 microliter van 100 microgram per milliliter kanamycine, u ook 10 microliter van 2,5 microgram per milliliter rifampicine toevoegen om e-coli besmetting te voorkomen.Vanaf de plaat gebruik je een geïsoleerde kolonie geverifieerd door PCR om je nieuwe cultuur te laten groeien. Kies uw geïsoleerde kolonie en inenting in de lb. Plaats de inenting op de shaker.incubeer bij 30 graden Celsius en 120 tot 150 RPM 's nachts. De volgende dag, als de Agrobacterium cultuur wordt aangetrokken tot OD600 gelijk aan 0,6 tot 0,9 kan worden gebruikt voor infiltratie. Als het is overwoekerd OD600 boven een tot twee milliliter moet worden overgebracht naar een verse lb met antibiotica en gegroeid tot de vereiste OD600.Eenmaal op de juiste OD600 plaats de culturen in een centrifuge, ervoor te zorgen dat de centrifuge in evenwicht is. Pel de bacteriën door centrifugatie op 4, 500G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Ze kunnen niet supernate van beide monsters.Dan resuspend elke pellet en een X infiltratie buffer om de uiteindelijke OD te brengen tot 0,4. Combineer gelijke volumes van elke IgG fusion construct met de lichtkettingconstructie, om de uiteindelijke OD van 0,2 per constructie in elke buis te krijgen. Neem een paperclip en een vijf tot zes weken oude en benthamiana plant van stap een.Met behulp van de scherpe rand van de paperclip ontvouwd maken een kleine punctie in de eerste epidermale laag van het blad. Vermijd het doorboren van het blad helemaal door. Vul een milliliter spuit zonder een naald bevestigd met de voorbereide Agrobacterium oplossing van stap twee.Bedek het gat gemaakt in de vorige stap met het einde van de spuit. En langzaam duwen om de bacteriën te injecteren in het blad, terwijl het toepassen van zachte tegendruk van achter het blad. Probeer het grootste deel van het blad te infiltreren en por het blad maximaal drie tot vier keer, overtollige bladschade kan de eiwitopbrengst belemmeren.Let op het blad donkerder als de oplossing wordt geïnjecteerd zonder het toepassen van te veel druk op de spuit. Het geïnfiltreerde plantenblad zal meestal donker lijken vanuit het onderste zicht. Merk op dat deze bacteriële oplossing moet genoeg zijn voor ten minste drie tot vier planten per constructie.Autoclave eventuele resterende bacteriële oplossing voor het weggooien. Na de naald-minder infiltratie, plaats planten terug in de groeikamer en blijven dagelijks water. Waargenomen de bladeren voor chlorose, necrose evenals voor GFP fluorescentie, winter lange en korte golf UV-lamp.Meestal bladeren op dag vier en vijf tonen de hoogste GFP fluorescentie. Oogst alle bladeren op vier tot vijf dagen na infiltratie en weeg de totale hoeveelheid bladmateriaal. U het bladmateriaal onmiddellijk gebruiken voor downstream verwerking, of u het bevriezen in negatieve 80 graden Celsius totdat het klaar is om te gebruiken Plaats de geïnfiltreerde planten terug in de groeikamer en blijf dagelijks water geven.waargenomen de bladeren voor chlorose, necrose, veranderingen in kleur en bladweefsel dood in geïnfiltreerde gebieden. Waargenomen planten voor GFP fluorescentie. Als GFP aanwezig is onder een lange en korte golf UV-lamp.Eiwitexpressie neemt na verloop van tijd toe, met de hoogste fluorescentie van beide GFP-constructies die over het algemeen tussen dag vier en vijf voorkomen. Oogst alle bladeren op vier tot vijf dagen na infiltratie en weeg het totale bladmateriaal. Gebruik het onmiddellijk voor downstream processen of bevriezen bij negatieve 80 graden Celsius tot klaar voor gebruik.Houd tijdens het mengproces voor gebruik buffers en blenderbekers op ijs of op vier graden Celsius. Plaats plantaardig weefsel van stap vier in de pretrial blender cup. Bij gekoelde extractiebuffer met respectievelijke PMSF- en natriumascorbaatconcentraties aan de blenderbeker.Leg de blenderbeker op de blender, neem een voorgesneden vel parafilm en strek deze over de bovenkant van de blenderbeker. Meng het bladweefsel met extractiebuffer om 80 met 22e intervallen voor te stellen. Je moet goed roeren tussen de mengcycli als dat nodig is.Het mengsel moet homogeen lijken zonder stukjes bladmateriaal. Breng gemengd materiaal over naar een beker. Op een roerbar en roer het gedurende 30 minuten vier graden Celsius om de eiwitoplosbaarheid te verbeteren en neerslag van vaste stoffen toe te staan.Plaats twee lagen kale doek over een schone beker op ijs en giet het extract erdoorheen om grote bladresten te verwijderen. Immers het extract wordt gegoten door de spiegel doek vouw de spiegel doek om het resterende blad extract knijpen. Het extract moet donkergroen lijken zonder zichtbare deeltjes.Breng het extract over in centrifugebuizen. Centrifuge het extract op 16.000G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Dit zal pellet alle resterende onoplosbare materiaal.Zorg ervoor dat beide buizen in balans zijn en dat het rotordeksel stevig wordt aangedraaid. Na centrifugatie moet de pellet zichtbaar zijn, zeg maar supernatant en gooi de pellet weg. Filter de supernatant met behulp van een 50 milliliter spuit en glasvezel filter.Verzamel 50 microliter van een monster en label ruw extract voor latere analyse. Stel een polypropyleenkolom in met 20 milliliter monster. Schat de hoeveelheid drijfmest die nodig is, afhankelijk van het doelimmunlinetype en de affiniteit met de hars.In deze demonstratie gebruiken we drie milliliter drijfmest. Over het algemeen drie milliliter van totale drijfmest met 1,5 milliliter bed volume is efficiënt voor de zuivering van verschillende milligram antilichaam. Voorzichtig pipette de vereiste hoeveelheid opgesuspend drijfmest in de afgetopte kolom.Open de kolomuitlaat vanaf de onderkant van de kolom en laat deze leeglopen totdat het grootste deel van de buffer is verdwenen. Giet onmiddellijk 10 milliliter wasbuffer een keer PBS op de top. Laat het uitlekken en herhaal deze wasstap twee keer.Pas het gefilterde monster van stap vijf op de kolom aan en verzamel de doorstroom. Aliquot 50 microliters van flow-through voor latere analyse. Bewaar de rest van de doorstroom voor het geval het antilichaam zich niet in de hars bindt.Was de hars twee keer met 10 milliliter van één keer PBS om niet-specifieke binding te verminderen. Indien gewenst, aliquot 50 microliters van wassen als de buffer afvoeren door de kolom om te controleren of het doel antilichaam niet wordt gezinspeeld met een wasbuffer. Terwijl de wasbuffer door de hars loopt, setup en label vijf micro centrifugebuizen met 125 microliters steriel, een molar tris-HCL bij pH acht voor het neutraliseren van de elutie buffer.U ook 30 microliter van twee molaire tris basis toevoegen om meer geconcentreerd eluaat te krijgen. Tijdens elutie kan UV-licht worden gebruikt voor visualisatie. Dit hoeft niet te worden gedaan voor de duur van de elutie.Als u UV wordt gebruikt, moet u passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen om schade aan ogen en huid te voorkomen. Een UV-licht hoeft niet te worden gebruikt tijdens de elutiestap. Elute de antilichamen door het toepassen van vijf milliliter elutie buffer op de kolom en verzamel een milliliter fracties, op elke aangewezen buis van de vorige stap.Onmiddellijk regenereren van de kolom door het toepassen van 20 milliliter, gevolgd door 10 milliliter wasbuffer. Zorg ervoor dat de hars niet voor langere tijd in een zure omgeving wordt achtergelaten. Elutie moet fluorescerend lijken.Vaak wordt de hoogste fluorescentie gezien in de tweede elutie, maar kan variëren van extractie tot extractie. Voor opslag, was de hars met 10 milliliter van 20% ethanol en PBS en laat halverwege uitlekken. Recapituleren de top, dan de onderkant van de kolom en rechtop te houden op vier graden C.Bepaal de concentratie van het antilichaam met behulp van een fotospectrometer door het meten van absorptie op 280 nanometer.Bewaar de eluates in negatieve 80 graden Celsius en aliquot 50 microliter van elke fractie op een aparte buis voor verdere analyse. Over het algemeen eiwitduur kan worden hergebruikt tot 10 keer zonder aanzienlijk verlies van efficiëntie. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor specifieke details bepalen de concentratie van antilichamen, met behulp van een spectrofotometer door absorptie op 280 nanometer te meten.Bewaar de eluates in min 80 graden Celsius en aliquot 50 microliter van elke fractie in een aparte buis voor verdere analyse. Analyse van gezuiverd eiwit door Zs pagina kan worden gedaan door het volgen van standaard protocollen. Waargenomen fluorescentie als gevolg van het succes van klonen, infiltratie en expressie van een constructie die GFP bevat.In de loop van een paar dagen, fluorescerende moet geleidelijk toenemen met hoge fluorescentie op dag vier en vijf. Wanneer eiwit G wordt gebruikt fluorescerende eiwitbinding en de daaropvolgende elutie uit de kolom geeft zuivering van een IgG fusie met als een stabiele GFP. En de UV-blootgestelde gel, zie je alleen de 25KDa en 75KDa banden van de ladder.U ook zien, de niet-verminderde elutie 2 monster. De niet-verminderde elutie behoudt zijn fluorescentie als de relatieve grootte die men zou verwachten van een intacte IgG als zijn stabiele GFP-fusie. In de coomassie vlek gel zowel verminderd als niet verminderd monsters worden gevisualiseerd.Alle laddercomponenten zijn zichtbaar, inheemse eiwitten en IgG-fusies zijn te zien in het totale extract supernatant en stromen door monsters. De was bevat een kleine hoeveelheid IgG fusie. Elution een en vier bevatte minder geconcentreerd eiwit zoals wordt verwacht als de meeste eiwitten is over het algemeen ontgaan uit de tweede en derde elutie stappen.Elution 2 niet-reducerend kan ook worden gezien meerdere banden bestaan in alle vermindering elution monsters. 75KDa geeft een zware kettingzekering aan GFP. 50KDa duidt op een zware ketting alleen, 25KDa geeft alleen al een lichtketen aan en 10 KDA duidt waarschijnlijk op afbraak die kan worden voorkomen door de toevoeging van proteaseremmers.Dit protocol kan worden gebruikt voor de zuivering van elk antilichaam gesmolten tot elk gewenst doeleiwit. Het proces kan worden bewerkt om verschillende hoeveelheden bladmateriaal aan te passen, en maakt het ook mogelijk om de aanwezigheid van eiwitten visueel te bepalen vóór, tijdens en na de sluiting van de eiwitextractie- en zuiveringsprocessen. Deze methoden kunnen nuttig zijn als controles en kan het doel zijn voor het onderwijs technieken.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...