Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Nous remercions Maria Pia DiPalma d’avoir édité la vidéo. Nous remercions également le Bureau de la sensibilisation à l’éducation et des services aux étudiants de l’Université d’État de l’Arizona pour leur généreuse aide aux frais de publication. La recherche pour ce protocole a été soutenue par la School of Life Sciences de l’Université d’État de l’Arizona.

1. Cultiver les plantes de N. benthamiana 
<ol><li>Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser les granulés de tourbe préalablement bouillis, encore chauds (~40-45 °C), l’eau sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Une fois les granulés complètement extensés, placez 2-3 graines de benthamiana N. sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.</li>
	<li>Verser environ 0,5 dans l’eau pour couvrir le fon...

Ce protocole peut être utilisé pour la vérification visuelle de tout Ab recombinant ou protéine recombinante produite dans les plantes de N. benthamiana, y compris celles qui nécessitent une exposition temporaire à des environnements acides à des fins de purification descolonnes 42,43,44. En outre, la fusion de l’asGFP à d’autres protéines dans différents systèmes d’expression peut être un outil utile ...

Les rapports de l’industrie indiquent que treize des vingt médicaments les plus riches aux États-Unis étaient des produits biologiques (produits pharmaceutiques à base de protéines), dont neuf étaient des anticorps. En 2019, il y avait plus de 570 anticorps (Ab) thérapeutiques à différentes phasesde développement clinique 1,2,3. Les ventes mondiales actuelles d’Ab dépassent les 100 milliards USD, et le marché thérapeutique monoclonal ab (mAb) devrait générer jusqu’à 300 milliards usd d’ici 20251,4. Avec une demande aussi forte et des augmentations prévues des revenus, les chercheurs ont travaillé à développer des moyens de produire des produits thérapeutiques Ab à une échelle toujours plus grande, avec une meilleure qualité et des coûts inférieurs. Les systèmes d’expression à base de plantes ont plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires mammifères traditionnelles pour la fabrication abordable et à grande échelle d’Ab therapeutics5,6. La production de protéines thérapeutiques dans les plantes (« pharming moléculaire ») ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux ou d’installations de culture cellulaire, tout comme les techniques traditionnelles de culture cellulairedes mammifères 7,8. Les plantes ne peuvent pas contracter d’agents pathogènes humains, ce qui minimise la contaminationpotentielle 9. L’expression transitoire et transgénique des protéines végétales peut être utilisée comme alternative à moindre coût aux systèmes de production de mammifères ou de bactéries10. Bien que les plantes transgéniques soient préférées pour la production agricole, la production de protéines recombinantes à l’aide de cette méthode peut nécessiter des semaines à des mois. Les progrès de l’expression transitoire à l’aide de vecteurs viraux par l’agroinfiltration seringue ou vide permettent la production à petite et à grande échelle, respectivement, de la protéine désirée dansles jours 11,12,13,14. La production de mAbs contre Ebola, dengue et Zika, et de nombreuses autres protéines recombinantes, ont été produites et purifiées rapidement et efficacement en utilisant l’expression transitoire dans les plantes de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Ces circonstances font de l’expression végétale transitoire une option attrayante pour développer plusieurs ab thérapeutiques et les méthodes démontrées dans ce protocole20.
Les mAbs de première génération étaient de dérivation murine, qui a eu comme conséquence l’immunogénicité non spécifique une fois employée dans les essais humains21. Au fil du temps, chimérique, humanisé, et finalement, abs entièrement humains ont été produites pour diminuer l’immunogénicité induite par ab thérapeutique. Malheureusement, certains de ces abs causent encore l’immunogénicité d’hôte due aux différences dans la glycosylation21. Les développements dans l’ingénierie végétale ont permis la modification d’Ab glycans, qui est essentielle puisque la stabilité et la fonction d’un Ab peuvent être sensiblement affectées par son état de glycosylation22. Les progrès ont permis la production dans les systèmes végétaux d’expression de haut niveau de mAbs humanisés, contenant des glycanes humains et, par conséquent, les traits biologiques désirés d’un produit pharmaceutique humainproduit en série 19,21.
En plus des abs recombinants, les molécules de fusion Ab (Fusions Ab) ont été explorées à diverses fins au cours des dernières décennies. Ab fusions se composent souvent d’un ab ou ab fragment fusionné à une molécule ou une protéine et sont conçus pour obtenir des réponses des cellules effectrices immunitaires23. Ces molécules ont été créées comme interventions thérapeutiques potentielles pour traiter diverses pathologies telles que le cancer et les maladies auto-immunes24,25,26,27. Les complexes immunitaires recombinants (CCI) sont une autre classe de fusions Ab qui ont été utilisées comme candidats vaccins28. Les CCI profitent de la capacité du système immunitaire à reconnaître les régions fc des fusions Ab et ont été trouvés pour améliorer l’immunogénicité lorsqu’ils sont combinés avec d’autresplates-formes vaccinales 29,30,31.
La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine bioluminescente dérivée de la méduse Aequorea Victoria, qui émet de la lumière verte lorsqu’elle est excitée par la lumièreultraviolette 32,33. Au fil des ans, l’utilisation de GFP comme marqueur visuel de l’expression des gènes est passé de l’expression chez Escherichia coli à de nombreux systèmes d’expression protéique, y compris les plantes N. benthamiana 34,35,36,37,38. Les marqueurs visibles, tels que le GFP, ont des implications abondantes dans l’enseignement et l’apprentissage des concepts scientifiques. De nombreux étudiants d’entrée de gamme décrivent des difficultés à saisir des concepts scientifiques lorsque l’idée enseignée n’est pas visible à l’œil nu, comme les concepts de biologie moléculaire et les domainesconnexes 39. Les marqueurs visuels, comme le GFP, peuvent ainsi contribuer au traitement de l’information liée aux processus scientifiques et pourraient aider à atténuer les difficultés que les élèves signalent dans l’apprentissage de nombreux concepts scientifiques.
Bien que le GFP soit souvent utilisé comme marqueur pour indiquer le gène et l’expression in vivo,il est difficile de le visualiser dans les processus en aval si l’on utilise des conditions acides. Cette circonstance est principalement parce que GFP ne maintient pas sa structure et la fluorescence qui en résulte à un faible pH40. Des environnements acides temporaires sont souvent nécessaires dans divers processus de purification, tels que la protéine G, la protéine A et la chromatographie L protéique, souvent utilisée pour la purification ab41,42,43,44. Mutants GFP ont été utilisés pour retenir la fluorescence dans des conditions acides45,46.
Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification des protéines de fusion IgG recombinantes dans les plantes de N. benthamiana. Nous avons produit le GFP traditionnel fusionné au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion GFP-IgG. Simultanément, nous avons développé la fusion d’une séquence optimisée par codon végétal pour un GFP acidulé (asGFP) au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion asGFP-IgG. Les avantages de la production de GFP-IgG comprennent la capacité de visualiser la présence d’une protéine cible pendant l’expression, tandis que asGFP-IgG permet de voir la présence de protéines recombinantes non seulement dans les étapes d’expression et d’extraction, mais aussi dans les étapes de purification de la protéine. Ce protocole peut être adapté pour la production, la purification et la visualisation d’une gamme de protéines de fusion GFP produites en N. benthamiana et purifiées à l’aide de techniques de chromatographie qui nécessitent un faible pH. Le processus peut également être adapté à diverses quantités de matériaux foliiques. Bien que les abs et les protéines de fusion étiquetées avec GFP ou asGFP ne soient pas destinés à être utilisés pour des thérapies, ces méthodes peuvent être utiles comme témoins pendant les expériences et peuvent également être utilisées comme un outil d’enseignement pour la biologie moléculaire et cellulaire et la biotechnologie, en personne et virtuellement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

La forte demande d’anticorps en tant qu’interventions thérapeutiques pour diverses maladies infectieuses, métaboliques, auto-immunes, néoplastiques et autres crée un besoin croissant de développer des méthodes efficaces pour la production d’anticorps recombinants. En 2019, il y avait plus de 70 anticorps monoclonaux approuvés par la FDA, et il y a un potentiel de croissance exponentiel. Malgré leur promesse, les coûts de fabrication et la complexité sont des facteurs limitants pour une utilisation généralisée. Potentiellement, les usines offrent des stratégies de fabrication de protéines peu rentables, sûres et facilement évolutives. Des plantes comme Nicotiana benthamiana peuvent non seulement plier et assembler correctement des protéines mammifères complexes, mais aussi ajouter des modifications post-translationnelles critiques semblables à celles offertes par les cultures cellulaires mammifères. Dans ce travail, en utilisant le GFP indigène et une variante acide-stable de protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée aux anticorps monoclonaux humains, nous avons pu visualiser l’ensemble du processus transitoire d’expression et de purification d’anticorps des usines de N. benthamiana. Selon le but de l’expérience, la fusion GFP native peut assurer une visualisation plus facile pendant la phase d’expression dans les plantes, tandis que la fusion GFP acidulée permet une visualisation pendant le traitement en aval. Cette procédure évolutive et simple peut être effectuée par un seul chercheur pour produire des quantités milligrammes de protéines de fusion d’anticorps ou d’anticorps très pures en quelques jours en utilisant seulement quelques petites plantes. Une telle technique peut être étendue à la visualisation de tout type de processus de purification des anticorps et potentiellement de nombreuses autres protéines, à la fois dans les systèmes végétaux et d’autres systèmes d’expression. En outre, ces techniques peuvent bénéficier d’instructions virtuelles et être exécutées dans un laboratoire d’enseignement par des étudiants de premier cycle possédant une expérience minimale préalable avec les techniques de biologie moléculaire, fournissant une base pour l’exploration basée sur des projets avec des applications réelles.

Cette étude démontre une méthode facile et rapide pour produire des protéines recombinantes et les visualiser tout au long des processus en aval. En utilisant N. benthamiana et en suivant le protocole fourni, la production de protéines recombinantes décrite ici peut être réalisée en moins d’une semaine. Le flux de travail global de l’expression, de l’extraction et de la purification des plantes est indiqué à la figure 1. Les stades de croissance des plantes à parti...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction, et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans Nicotiana benthamiana. Ce protocole peut être étendu à la purification et à la visualisation de nombreuses protéines qui utilisent la chromatographie des colonnes. De plus, le protocole s’adapte au laboratoire d’enseignement collégial virtuel et en personne, offrant une exploration axée sur des projets.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Il s’agit d’une démonstration d’une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans les plantes nicotiana benthamiana liées au tabac. Ce protocole peut être utilisé pour la purification et la visualisation des anticorps produits par les plantes, des fusions d’anticorps et de la plupart des protéines qui peuvent être purifiées par chromatographie des colonnes. Ce protocole permet aux chercheurs et aux étudiants des laboratoires de travail universitaires de visualiser les protéines étiquetées GFP à la plupart des étapes du processus de production de protéines.Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser de l’eau préalablement bouillie et encore chaude sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Les granulés ront quelques minutes pour se développer complètement. Une fois les palettes complètement élargies, placez deux à trois graines de nicotiana benthamiana sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.Une fois cela fait, vous aurez besoin de verser environ 0,5 pouces d’eau pour couvrir le fond du plateau. N’oubliez pas d’étiqueter le plateau avec la date d’ensemencement. Continuer à arroser les semis tous les jours avec des quantités appropriées d’engrais.Le plateau doit être recouvert d’un dessus humidome et placer dans une chambre de croissance. La pastille de tourbe ensemencée doit être conservée dans la chambre de croissance à 23 à 25 degrés Celsius avec une période photo de 16 heures et une humidité relative de 60 %. Après une semaine, retirer une plante supplémentaire de la pastille en laissant chaque palette de tourbe avec un seul semis.Lorsque les plantes ont de deux à trois semaines, transférer chaque granule de tourbe dans un pot individuel contenant un sol contrôlé par l’humidité. Continuer à arroser les semis tous les jours avec un gramme par litre d’engrais, ne jamais laisser le sol complètement sec. Les plantes sont prêtes pour l’infiltration quand elles ont cinq à six semaines.Les étapes suivantes doivent être effectuées à côté d’un brûleur Bunsen et des techniques aseptiques de base doivent être appliquées pour éviter la contamination. Vous aurez besoin d’une plaque de kanamycine Lb. Un microgramme par concentration millilitres de kanamycine.strict avec deux mutations EHA105 hébergeant votre construction désirée résistante à la kanamycine et cultivé du jour au lendemain. EHA105 est l’une des souches les plus couramment utilisées d’Agrobacterium deux mutations. Pour commencer la culture, remplissez le tube conique avec 10 millilitres de lb de médias, ensuite, à 10 microlitres de 100 microgrammes par kanamycine millilitre, vous pouvez également ajouter 10 microlitres de 2,5 microgrammes par millilitre de rifampicine pour prévenir la contamination par e-coli.À partir de la plaque, vous utiliserez une seule colonie isolée vérifiée par PCR pour développer votre nouvelle culture. Choisissez votre colonie isolée et inoculer dans le lb. Placer l’inoculation sur le shaker.incuber à 30 degrés Celsius et 120 à 150 RPM pendant la nuit. Le lendemain, si la culture Agrobacterium est attirée par OD600 égalant 0,6 à 0,9, elle peut être utilisée pour l’infiltration. S’il est envahi OD600 au-dessus d’un à deux millilitres devrait être transféré à un lb frais avec des antibiotiques et cultivé à l’OD600 requis.Une fois à od600 approprié placer les cultures dans une centrifugeuse, en s’assurant que la centrifugeuse est équilibrée. Peler les bactéries par centrifugation à 4500G pendant 20 minutes à température ambiante. Ils ne peuvent pas se superposer des deux échantillons.Puis résuspendez chaque granulé et un tampon d’infiltration X pour porter l’OD final à 0,4. Combinez des volumes égaux de chaque construction de fusion IgG avec la construction de la chaîne de lumière, pour obtenir l’OD final de 0,2 par construction dans chaque tube. Prenez un trombones et une plante benthamiana de cinq à six semaines dès la première étape.En utilisant le bord tranchant du trombone déplié faire une petite crevaison dans la première couche épidermique de la feuille. Évitez de percer la feuille jusqu’au bout. Remplissez une seringue millilitre sans aiguille fixée avec la solution Agrobacterium préparée dès la deuxième étape.Couvrez le trou fait dans l’étape précédente avec l’extrémité de la seringue. Et poussez lentement pour injecter les bactéries dans la feuille tout en appliquant la contre-pression douce de derrière la feuille. Essayez d’infiltrer la majeure partie de la feuille et de piquer la feuille un maximum de trois à quatre fois, l’excès de dommages causés par les feuilles peut nuire au rendement en protéines.Regardez la feuille s’assombrir au fur et à mesure que la solution est injectée sans appliquer trop de pression sur la seringue. La feuille de plante infiltrée apparaîtra la plupart du temps foncée de la vue du bas. Notez que cette solution bactérienne devrait suffire pour au moins trois à quatre plantes par construction.Autoclave toute solution bactérienne restante avant de jeter. Après avoir terminé l’infiltration sans aiguille, remettre les plantes dans la chambre de croissance et continuer à arroser quotidiennement. Observé les feuilles pour la chlorose, la nécrose ainsi que pour la fluorescence GFP, hiver longue et courte vague lampe UV.Habituellement, les feuilles les jours quatre et cinq montrent la fluorescence GFP la plus élevée. Récoltez toutes les feuilles à quatre à cinq jours après l’infiltration et pesez la quantité totale de matière folio. Vous pouvez utiliser le matériau folio immédiatement pour le traitement en aval, ou vous pouvez le congeler en négatif 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à utiliser Placez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance et continuer à arroser tous les jours.observé les feuilles pour la chlorose, la nécrose, les changements de couleur et la mort des tissus foliaire dans les zones infiltrées. Plantes observées pour la fluorescence GFP. Si GFP est présent sous une lampe UV à ondes longues et courtes.L’expression des protéines augmente au fil du temps, la fluorescence la plus élevée des deux constructions de GFP se produisant généralement entre les jours quatre et cinq. Récoltez toutes les feuilles à quatre à cinq jours après l’infiltration et pesez la matière totale des feuilles. Utilisez-le immédiatement pour les processus en aval ou congelez à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.Pendant le processus de mélange, assurez-vous de garder les tampons et les tasses de mélangeur sur la glace ou à quatre degrés Celsius avant utilisation. Placer le tissu végétaux de la quatrième étape dans la tasse du mélangeur pré-procès. À tampon d’extraction réfrigéré contenant des concentrations respectives de PMSF et d’ascorbate de sodium à la tasse de mélangeur.Déposer la tasse du mélangeur sur le mélangeur, prendre une feuille pré-coupée de para film et l’étirer sur le dessus de la tasse du mélangeur. Mélanger le tissu folio avec le tampon d’extraction pour imaginer 80 avec 22e intervalles. Vous devrez bien mélanger entre les cycles de mélange au besoin.Le mélange doit sembler homogène sans morceaux de matériau folio. Transférer le matériel mélangé dans un bécher. À une barre d’agitation et remuer pendant quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour améliorer la solubilité des protéines et permettre la précipitation des solides.Placez deux couches de tissu nu sur un bécher propre sur la glace et versez l’extrait à travers elle pour enlever les gros débris de feuilles. Après tout l’extrait est versé à travers le tissu miroir plier le tissu miroir pour presser l’extrait de feuille résiduelle. L’extrait doit apparaître vert foncé sans particules visibles.Transférer l’extrait dans des tubes de centrifugeuse. Centrifugeuse l’extrait à 16 000 G pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Ceci granulera n’importe quel matériel insoluble restant.Assurez-vous que les deux tubes sont équilibrés et que le couvercle du rotor est solidement serré. Après centrifugation, la pastille doit être visible, par exemple supernatant et jeter la pastille. Filtrer le supernatant à l’aide d’une seringue de 50 millilitres et d’un filtre à fibres de verre.Recueillir 50 microlitres d’un échantillon et étiqueter l’extrait brut pour une analyse ultérieure. Installez une colonne de polypropylène qui contient 20 millilitres d’échantillon. Estimer la quantité de boue nécessaire en fonction du type d’immunoglobuline cible et de son affinité avec la résine.Dans cette démonstration, nous utilisons trois millilitres de boue. Généralement trois millilitres de boue totale avec 1,5 millilitres de volume de lit est efficace pour la purification de plusieurs milligrammes d’anticorps. Pipette soigneusement la quantité requise de boue résuspendée dans la colonne plafonnée.Ouvrez la sortie de colonne à partir du bas de la colonne et laissez-la s’écouler jusqu’à ce que la majeure partie du tampon soit partie. Versez immédiatement 10 millilitres de tampon de lavage une fois PBS sur le dessus. Laissez-le s’écouler et répétez cette étape de lavage deux fois.Appliquez l’échantillon filtré de l’étape cinq à la colonne et recueillez le flow-through. Aliquot 50 microlitres de flow-through pour une analyse ultérieure. Enregistrez le reste de l’écoulement au cas où l’anticorps ne se lierait pas à la résine.Lavez la résine deux fois avec 10 millilitres d’une fois PBS pour réduire la liaison non spécifique. Si désiré, aliquot 50 microlitres de lavage que le tampon draine à travers la colonne pour vérifier que l’anticorps cible n’est pas fait allusion avec un tampon de lavage. Alors que le tampon de lavage est en cours d’exécution à travers la résine, la configuration et l’étiquette de cinq tubes de centrifugeuse micro avec 125 microlitres de stérile, un tris-HCL molaire au pH huit pour neutraliser le tampon d’élitution.Sinon, ajoutez 30 microlitres de deux tris molaires de base pour obtenir plus concentré eluate. Pendant l’élitution, la lumière UV peut être utilisée pour la visualisation. Cela n’a pas besoin d’être fait pour la durée de l’élitution.Si vous avez des UV, assurez-vous de porter l’équipement de protection individuelle approprié pour éviter les dommages aux yeux et à la peau. Une lumière UV n’a pas besoin d’être utilisée pendant l’étape d’élitution. Elute les anticorps en appliquant cinq millilitres de tampon d’élitution à la colonne et de recueillir une fraction millilitre, à chaque tube désigné de l’étape précédente.Régénérez immédiatement la colonne en appliquant 20 millilitres suivis de 10 millilitres de tampon de lavage. Assurez-vous que la résine n’est pas laissée dans un environnement acide pendant une période prolongée. L’élitution doit apparaître fluorescente.Souvent, la fluorescence la plus élevée est observée dans la deuxième élitution, mais peut varier d’une extraction à l’autre. Pour le stockage, laver la résine avec 10 millilitres de 20% d’éthanol et de PBS et laisser égoutter à mi-chemin. Récapitulez le haut, puis le bas de la colonne et maintenez la verticale à quatre degrés C.Déterminez la concentration d’anticorps à l’aide d’un spectromètre photo en mesurant l’absorption à 280 nanomètres.Stockez les évasifs dans des températures négatives de 80 degrés Celsius et aliquot 50 microlitres de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie. En général, les durées protéiques peuvent être réutilisées jusqu’à 10 fois sans perte significative d’efficacité. Consultez les lignes directrices du fabricant pour plus de détails déterminer la concentration d’anticorps, à l’aide d’un spectrophotomètre en mesurant l’absorption à 280 nanomètres.Stockez les évasifs en moins 80 degrés Celsius et aliquot 50 microlitres de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie. L’analyse des protéines purifiées par page Zs peut être effectuée en suivant les protocoles standard. Fluorescence observée en conséquence indiquant le succès du clonage, de l’infiltration et de l’expression d’une construction contenant du GFP.Au cours de quelques jours, les fluorescents devraient augmenter progressivement avec une fluorescence élevée les jours quatre et cinq. Lorsque la protéine G est utilisée, la liaison protéique fluorescente et l’élitution subséquente de la colonne indiquent la purification d’une fusion IgG contenant comme GFP stable. Et le gel exposé aux UV, vous pouvez voir seulement les bandes 25KDa et 75KDa de l’échelle.Vous pouvez également voir, l’échantillon d’elution 2 non réduite. L’elution non réduite conserve sa fluorescence comme la taille relative que l’on pourrait attendre d’un IgG intact comme sa fusion GFP stable. Dans le gel de tache de coomassie les échantillons réduits et non réduits sont visualisés.Tous les composants de l’échelle sont visibles, les protéines indigènes et les fusions IgG peuvent être observées dans l’extrait total supernatant et couler à travers les échantillons. Le lavage contient une petite quantité de fusion IgG. Elution un et quatre contenaient moins de protéines concentrées comme on s’y attend car la plupart des protéines ont généralement échappé aux deuxième et troisième étapes d’élitution.Elution 2 non réduction peut également être vu plusieurs bandes existent dans tous les échantillons d’élitution de réduction. 75KDa indique un fusible à chaîne lourde à GFP. 50KDa indique une chaîne lourde seule, 25KDa indique une chaîne légère seule, et 10 KDA indique probablement la dégradation qui peut être empêchée par l’ajout d’inhibiteurs de protéase.Ce protocole peut être utilisé pour la purification de n’importe quel anticorps fusionné à n’importe quelle protéine cible désirée. Le processus peut être modifié pour accueillir diverses quantités de matériau foliique, et permet également la détermination visuelle de la présence de protéines avant, pendant et après la conclusion des processus d’extraction et de purification des protéines. Ces méthodes peuvent être utiles en tant que contrôles et peuvent être utiles pour les techniques d’enseignement.

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