Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Wir danken Maria Pia DiPalma für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch dem Office of Educational Outreach and Student Services an der Arizona State University für die großzügige Unterstützung der Publikationsgebühren. Die Forschung für dieses Protokoll wurde von der School of Life Sciences, Arizona State University, unterstützt.

1. Kultivieren N. benthamiana Pflanzen
<ol><li>Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um sie vollständig auszupflanzen. Nachdem Pellets vollständig erweitert sind, legen Sie 2-3 N. Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit Pinzette.</li>
	<li>Gießen Sie etwa 0,5 in Wasser, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Beschriften Sie das Fach mit dem Aussaatdatum. Die Sämlinge täglich mit entsprech...

Dieses Protokoll kann für die visuelle Überprüfung von rekombinanten Ab oder rekombinanten Protein enduden in N. benthamiana Pflanzen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die vorübergehende Exposition gegenüber sauren Umgebungen für Säulenreinigung Zwecke42,43,44. Darüber hinaus kann die Fusion von asGFP mit anderen Proteinen in verschiedenen Expressionssystemen ein nützliches Werkzeug für experimente...

Branchenberichten zufolge handelte es sich bei dreizehn der zwanzig am höchsten einumsatzreichsten Arzneimittel in den Vereinigten Staaten um Biologika (Protein-basierte Arzneimittel), von denen neun Antikörper waren. Im Jahr 2019 gab es über 570 Antikörper (Ab) Therapeutika in verschiedenen klinischen Entwicklungsphasen1,2,3. Der aktuelle weltweite Ab-Umsatz übersteigt 100 Milliarden US-Dollar, und der monoklonale Ab (mAb) therapeutische Markt wird bis 2025 voraussichtlich bis zu 300 Milliarden US-Dollar generieren1,4. Angesichts der hohen Nachfrage und der prognostizierten Umsatzsteigerungen haben forscher daran gearbeitet, Wege zu entwickeln, Ab-Therapeutika in immer größerem Maßstab zu produzieren, mit höherer Qualität und niedrigeren Kosten. Pflanzenbasierte Expressionssysteme haben mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Säugetierzelllinien für die erschwingliche und großflächige Herstellung von Ab-Therapeutika5,6. Die Herstellung von Proteintherapeutika in Pflanzen ("molekulares Pharming") erfordert keine teuren Bioreaktoren oder Zellkulturanlagen wie die traditionellen Säugetierzellkulturtechniken7,8. Pflanzen können sich keine menschlichen Krankheitserreger anstecken, wodurch eine mögliche Kontamination minimiert wird9. Sowohl die transiente als auch die transgene pflanzliche Proteinexpression können als kostengünstigere Alternativen zu Säugetier- oder Bakterienproduktionssystemen verwendet werden10. Obwohl transgene Pflanzen für die Pflanzenproduktion bevorzugt werden, kann die rekombinante Proteinproduktion mit dieser Methode Wochen bis Monate in Anspruch erfordern. Fortschritte in der transienten Expression mit viralen Vektoren durch Spritze oder Vakuum-Agroinfiltration ermöglichen eine kleine bzw. großflächige Produktion des gewünschten Proteins in Tagen11,12,13,14. Die Produktion von mAbs gegen Ebola, Dengue und, Zika und zahlreiche andere rekombinante Proteine wurden schnell und effizient mit transienter Expression in N. benthamiana Pflanzen15,16,17,18,19hergestellt und gereinigt. Diese Umstände machen vorübergehende pflanzenbasierte Expression zu einer attraktiven Option für die Entwicklung mehrerer Ab-Therapeutika und der in diesem Protokoll20demonstrierten Methoden.
MAbs der ersten Generation waren von muriner Ableitung, was zu einer unspezifischen Immunogenität führte, wenn sie in Studien am Menschen verwendet wurde21. Im Laufe der Zeit wurden chimäre, humanisierte und schließlich vollständig menschliche Abs produziert, um die durch Ab-Therapeutika induzierte Immunogenität zu mindern. Leider verursachen einige dieser Abs immer noch Wirtsimmunogenität aufgrund von Unterschieden in der Glykosylierung21. Entwicklungen im Anlagenbau haben die Modifikation von Abglycanen ermöglicht, was unerlässlich ist, da die Stabilität und Funktion eines Ab durch seinen Glykosylierungszustand erheblich beeinträchtigt werden kann22. Fortschritte haben die Produktion von hochgradig erdtämmigen Humangups, die menschliche Glykane und daraus resultierend die gewünschten biologischen Merkmale eines massenproduzierten Humanarzneimittels enthalten, in Pflanzensystemen ermöglicht19,21.
Neben rekombinanten Abs wurden in den letzten Jahrzehnten auch Ab-Fusionsmoleküle (Ab-Fusionen) für verschiedene Zwecke erforscht. Ab-Fusionen bestehen oft aus einem Ab- oder Ab-Fragment, das mit einem Molekül oder Protein verschmolzen ist, und sind so konzipiert, dass sie Reaktionen aus Immuneffektorzellen entlocken23. Diese Moleküle wurden als mögliche therapeutische Interventionen zur Behandlung verschiedener Pathologien wie Krebs und Autoimmunerkrankungen24,25,26,27geschaffen. Rekombinante Immunkomplexe (RICs) sind eine weitere Klasse von Ab-Fusionen, die als Impfstoffkandidaten eingesetzt wurden28. RICs nutzen die Fähigkeit des Immunsystems, Fc-Regionen von Ab-Fusionen zu erkennen und haben festgestellt, dass sie die Immunogenität verbessern, wenn sie mit anderen Impfstoffplattformen kombiniert werden29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein biolumineszierendes Protein aus der Qualle Aequorea Victoria, die grünes Licht aussendet, wenn sie von ultraviolettem Licht angeregt wird32,33. Im Laufe der Jahre hat sich die Verwendung von GFP als visueller Marker der Genexpression von der Expression in Escherichia coli auf zahlreiche Proteinexpressionssysteme ausgeweitet, darunter N. Benthamiana-Pflanzen 34,35,36,37,38. Sichtbare Marker wie GFP haben reichlich Auswirkungen auf das Lehren und Erlernen wissenschaftlicher Konzepte. Zahlreiche Einsteiger beschreiben Schwierigkeiten beim Verständnis wissenschaftlicher Konzepte, wenn die gelehrte Idee mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wie die Konzepte der Molekularbiologie und verwandter Felder39. Visuelle Marker, wie GFP, können somit zur Verarbeitung von Informationen im Zusammenhang mit den wissenschaftlichen Prozessen beitragen und dazu beitragen, die Schwierigkeiten zu lindern, die Studenten beim Erlernen zahlreicher wissenschaftlicher Konzepte melden.
Obwohl GFP oft als Marker verwendet wird, um Gen und Expression in vivoanzuzeigen, ist es schwierig, es in den nachgelagerten Prozessen zu visualisieren, wenn saure Bedingungen verwendet werden. Dieser Umstand liegt in erster Linie daran, dass das GFP seine Struktur und die resultierende Fluoreszenz bei einem niedrigenpH-Wert von 40nicht aufrechterhält. Vorübergehende saure Umgebungen sind oft in verschiedenen Reinigungsprozessen erforderlich, wie Protein G, Protein A und Protein L Chromatographie, oft für Ab-Reinigung41,42,43,44verwendet. GFP-Mutanten wurden verwendet, um Fluoreszenz unter sauren Bedingungen zu behalten45,46.
Hierin beschreiben wir eine einfache Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung rekombinanter IgG-Fusionsproteine in N. benthamiana-Pflanzen. Wir produzierten traditionelle GFP, die mit dem N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerenkette verschmolzen wurde, wodurch eine GFP-IgG-Fusion entstand. Gleichzeitig entwickelten wir die Verschmelzung einer pflanzenkodonoptimierten Sequenz für ein säurestabiles GFP (asGFP) zum N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerkette, wodurch eine asGFP-IgG-Fusion entsteht. Zu den Vorteilen der Herstellung von GFP-IgG gehört die Möglichkeit, das Vorhandensein eines Zielproteins während der Expression zu visualisieren, während als GFP-IgG das Vorhandensein von rekombinantem Protein nicht nur in den Expressions- und Extraktionsschritten, sondern auch in den Reinigungsschritten des Proteins sieht. Dieses Protokoll kann für die Herstellung, Reinigung und Visualisierung einer Reihe von GFP-Fusionsproteinen angepasst werden, die in N. benthamiana hergestellt und mit Chromatographie-Techniken gereinigt werden, die einen niedrigen pH-Wert erfordern. Der Prozess kann auch auf verschiedene Mengen an Blattmaterial zugeschnitten werden. Während Abs und Fusionsproteine, die mit GFP oder asGFP markiert sind, nicht für Therapien verwendet werden sollen, können diese Methoden als Kontrollen während der Experimente nützlich sein und können auch als Lehrmittel für molekulare und zelluläre Biologie und Biotechnologie weiter genutzt werden, sowohl persönlich als auch virtuell.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

Die hohe Nachfrage nach Antikörpern als therapeutische Interventionen für verschiedene infektiöse, metabolische, autoimmune, neoplastische und andere Krankheiten erzeugt einen wachsenden Bedarf an der Entwicklung effizienter Methoden für die rekombinante Antikörperproduktion. Im Jahr 2019 gab es mehr als 70 FDA-zugelassene monoklonale Antikörper, und es gibt exponentielles Wachstumspotenzial. Trotz ihres Versprechens sind die Herstellungskosten und die Komplexität die Produktionskosten und die Komplexität begrenzend. Potenziell bieten Anlagen kostengünstige, sichere und leicht skalierbare Proteinherstellungsstrategien. Pflanzen wie Nicotiana benthamiana können nicht nur komplexe Säugetierproteine richtig falten und zusammenfügen, sondern auch kritische posttranslationale Modifikationen hinzufügen, die denen von Säugetierzellkulturen ähneln. In dieser Arbeit konnten wir mit nativem GFP und einer säurestabilen Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), die mit menschlichen monoklonalen Antikörpern verschmolzen ist, den gesamten transienten Antikörperexpression und -reinigungsprozess aus N. benthamiana-Pflanzen visualisieren. Je nach Zweck des Experiments kann die native GFP-Fusion eine einfachere Visualisierung während der Expressionsphase in den Pflanzen gewährleisten, während die säurestabile GFP-Fusion eine Visualisierung während der Nachverarbeitung ermöglicht. Dieses skalierbare und unkomplizierte Verfahren kann von einem einzelnen Forscher durchgeführt werden, um Milligramm-Mengen an hochreinen Antikörper- oder Antikörperfusionsproteinen innerhalb weniger Tage mit nur wenigen kleinen Pflanzen herzustellen. Eine solche Technik kann auf die Visualisierung jeder Art von Antikörper-Reinigungsprozess und potenziell viele andere Proteine erweitert werden, sowohl in pflanzlichen als auch in anderen Expressionssystemen. Darüber hinaus können diese Techniken virtuellen Anweisungen zugute kommen und in einem Lehrlabor von Studenten durchgeführt werden, die über minimale Vorkenntnisse mit molekularbiologischen Techniken verfügen und eine Grundlage für projektbasierte Sonnungen mit realen Anwendungen bieten.

Diese Studie zeigt eine einfache und schnelle Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine und deren Visualisierung in allen nachgelagerten Prozessen. Mit N. benthamiana und nach dem bereitgestellten Protokoll kann die hier beschriebene rekombinante Proteinproduktion in weniger als einer Woche erreicht werden. Der gesamte Arbeitsablauf von Pflanzenexpression, Extraktion und Reinigung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Stadien des Pflanzenwachstums von 2 Wochen alten Sämlingen, 4 ...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Wir beschreiben hier eine einfache Methode für die Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das mit GFP in Nicotiana benthamianaverschmolzen wird. Dieses Protokoll kann auf die Reinigung und Visualisierung zahlreicher Proteine erweitert werden, die die Säulenchromatographie nutzen. Darüber hinaus ist das Protokoll an das persönlich und virtuelle College-Lehrlabor anpassbar und bietet projektbasierte Erkundungen.

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Dies ist eine Demonstration einer einfachen Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das in tabakbezogenen Nicotiana Benthamiana-Pflanzen mit GFP verschmolzen ist. Dieses Protokoll kann zur Reinigung und Visualisierung von pflanzenproduzierten Antikörpern, Antikörperfusionen und den meisten Proteinen verwendet werden, die durch Säulenchromatographie gereinigt werden können. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern und Studenten in universitären Arbeitslabors, GFP-markierte Proteine bei den meisten Schritten des Proteinproduktionsprozesses zu visualisieren.Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um die volle Ausdehnung zu beschaffen. Pellets wird ein paar Minuten dauern, um vollständig zu erweitern. Nachdem die Paletten vollständig erweitert sind, legen Sie zwei bis drei Nicotiana Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit einer Pinzette.Nachdem dies geschehen ist, müssen Sie etwa 0,5 Zoll Wasser gießen, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Vergessen Sie nicht, das Tablett mit dem Aussaatdatum zu beschriften. Die Sämlinge täglich mit entsprechenden Mengen Dünger weiter gießen.Das Tablett sollte mit einem Humidome-Oberteil bedeckt und in eine Wachstumskammer gelegt werden. Das gesäte Torfpellet sollte in der Wachstumskammer bei 23 bis 25 Grad Celsius mit einer Fotoperiode von 16 Stunden und 60% relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden. Nach einer Woche eine zusätzliche Pflanze aus dem Pellet entfernen und jede Torfpalette mit nur einem Sämling verlassen.Wenn die Pflanzen zwei bis drei Wochen alt sind, übertragen Sie jedes Torfpellet in einen einzelnen Topf, der feuchtigkeitsgeregelten Boden enthält. Weiter zu wässern Sämlinge täglich mit einem Gramm pro Liter Dünger, nie den Boden vollständig trocken lassen. Pflanzen sind bereit für die Infiltration, wenn sie fünf bis sechs Wochen alt sind.Die folgenden Schritte müssen neben einem Bunsenbrenner durchgeführt werden, und es sollten grundlegende aseptische Techniken angewendet werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Sie benötigen eine Lb Kanamycin Platte. Ein Mikrogramm pro Milliliter Kanamycinkonzentration.streng mit zwei Mutationen EHA105, die Ihr gewünschtes Kanamycin-resistentes Konstrukt beherbergen und über Nacht wachsen. EHA105 ist eine der am häufigsten verwendeten Stämme von Agrobacterium zwei Mutationen. Um die Kultur zu beginnen, füllen Konische Röhre mit 10 Milliliter lb Medien, als nächstes, bei 10 Mikroliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, können Sie auch 10 Mikroliter von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin hinzufügen, um E-coli-Kontamination zu verhindern.Von der Platte aus verwenden Sie eine einzelne isolierte Kolonie, die von PCR verifiziert wurde, um Ihre neue Kultur zu erweitern. Wählen Sie Ihre isolierte Kolonie und impfen Sie sie in die LB. Legen Sie die Impfung auf den Shaker.bei 30 Grad Celsius und 120 bis 150 Umdrehungen von 150 RPM über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag, wenn die Agrobacterium-Kultur auf OD600 in Höhe von 0,6 bis 0,9 gezogen wird, kann sie für die Infiltration verwendet werden. Wenn es überwuchert IST, sollte OD600 über ein bis zwei Milliliter auf eine frische LB mit Antibiotika übertragen und auf den erforderlichen OD600 angebaut werden.Einmal bei entsprechendem OD600 die Kulturen in eine Zentrifuge geben, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausbalanciert ist. Die Bakterien durch Zentrifugieren bei 4, 500G 20 Minuten bei Raumtemperatur anbringen. Sie können nicht aus beiden Proben übernonen.Setzen Sie dann jedes Pellet und einen X-Infiltrationspuffer wieder aus, um die endgültige OD auf 0,4 zu bringen. Kombinieren Sie die gleichen Volumina jedes IgG-Fusionskonstrukts mit dem Lichtkettenkonstrukt, um die endgültige OD von 0,2 pro Konstrukt in jedem Rohr zu erhalten. Nehmen Sie eine Büroklammer und eine fünf bis sechs Wochen alte und benthamiana Pflanze von Schritt eins.Mit der scharfen Kante der Büroklammer entfaltet machen eine kleine Punktion in der ersten epidermalen Schicht des Blattes. Vermeiden Sie es, das Blatt den ganzen Weg durch zu punktieren. Füllen Sie eine Milliliterspritze ohne Nadel, die mit der vorbereiteten Agrobacterium-Lösung aus Schritt zwei befestigt ist.Bedecken Sie das im vorherigen Schritt gemachte Loch mit dem Ende der Spritze. Und schieben Sie langsam, um die Bakterien in das Blatt zu injizieren, während Sie sanften Gegendruck von hinter dem Blatt. Versuchen Sie, den größten Teil des Blattes zu infiltrieren und das Blatt maximal drei- bis viermal zu stechen, übermäßige Blattschäden können die Proteinausbeute behindern.Beobachten Sie, wie sich das Blatt verdunkelt, während die Lösung injiziert wird, ohne zu viel Druck auf die Spritze auszuüben. Das infiltrierte Pflanzenblatt erscheint von der unteren Ansicht meist dunkel. Beachten Sie, dass diese bakterielle Lösung für mindestens drei bis vier Pflanzen pro Konstrukt ausreichen sollte.Autoklavjede verbleibende bakterielle Lösung vor dem Verwerfen. Nachdem Sie die nadellose Infiltration beendet haben, legen Sie die Pflanzen wieder in die Wachstumskammer und wässern Sie täglich weiter. Beobachtet die Blätter für Chlorose, Nekrose sowie für GFP Fluoreszenz, Winter lang und Kurzwelle UV-Lampe.Normalerweise zeigen Blätter an den Tagen vier und fünf die höchste GFP-Fluoreszenz. Ernten Sie alle Blätter nach der Infiltration vier bis fünf Tage und wiegen Sie die Gesamtmenge des Blattmaterials. Sie können das Blattmaterial sofort für die Nachverarbeitung verwenden, oder Sie können es in negativen 80 Grad Celsius einfrieren, bis es bereit ist, die infiltrierten Pflanzen wieder in die Wachstumskammer zu stellen und täglich weiter zu wässern.beobachtet enden die Blätter für Chlorose, Nekrose, Veränderungen der Farbe und BlattgewebeTod in infiltrierten Bereichen. Beobachtete Pflanzen zur GFP-Fluoreszenz. Wenn GFP unter einer Lang- und Kurzwellen-UV-Lampe vorhanden ist.Die Proteinexpression nimmt im Laufe der Zeit zu, wobei die höchste Fluoreszenz beider GFP-Konstrukte im Allgemeinen zwischen den Tagen vier und fünf auftritt. Ernten Sie alle Blätter nach der Infiltration vier bis fünf Tage und wiegen Sie das gesamte Blattmaterial. Verwenden Sie es sofort für nachgeschaltete Prozesse oder frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius ein, bis sie einsatzbereit sind.Achten Sie während des Mischvorgangs darauf, Puffer und Mixerbecher vor dem Gebrauch auf Eis oder bei vier Grad Celsius zu halten. Pflanzengewebe aus Schritt vier in den vorgerichtlichen Mixerbecher legen. Bei gekühltem Extraktionspuffer, der die jeweiligen PMSF- und Natriumascorbatkonzentrationen zum Mixerbecher enthält.Legen Sie den Mixerbecher auf den Mixer, nehmen Sie ein vorgeschnittenes Blatt Parafolie und dehnen Sie ihn über die Oberseite des Mixerbechers. Mischen Sie das Blattgewebe mit Extraktionspuffer, um sich 80 mit 22. Intervallen vorzustellen. Sie müssen gut zwischen Mischungszyklen nach Bedarf rühren.Die Mischung sollte homogen erscheinen, ohne Blattstücke. Übertragen Sie Mischmaterial auf einen Becher. An einer Rührstange rühren und für vier Grad Celsius für 30 Minuten rühren, um die Proteinlöslichkeit zu verbessern und die Ausfällung von Feststoffen zu ermöglichen.Legen Sie zwei Schichten von nacktem Tuch über einen sauberen Becher auf Eis und gießen Sie den Extrakt durch sie, um große Blattablagerungen zu entfernen. Schließlich wird der Extrakt durch das Spiegeltuch gegossen falten Sie das Spiegeltuch, um den Restblattextrakt zu drücken. Der Extrakt sollte dunkelgrün ohne sichtbare Partikel erscheinen.Übertragen Sie den Extrakt in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 16.000G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dadurch wird das verbleibende unlösliche Material in die Pellet.Stellen Sie sicher, dass beide Rohre ausbalanciert sind und dass der Rotordeckel sicher angezogen ist. Nach der Zentrifugation sollte das Pellet sichtbar sein, sagen wir überstand und das Pellet entsorgen. Filtern Sie den Überstand mit einer 50-Milliliter-Spritze und einem Glasfaserfilter.Sammeln Sie 50 Mikroliter einer Probe und etikettieren Sie Rohextrakt für die spätere Analyse. Richten Sie eine Polypropylensäule ein, die 20 Milliliter Probe fasst. Schätzen Sie die benötigte Güllemenge in Abhängigkeit vom Zielimmunglobulintyp und seiner Affinität zum Harz.In dieser Demonstration verwenden wir drei Milliliter Gülle. In der Regel sind drei Milliliter Gesamtgülle mit 1,5 Milliliter Bettvolumen effizient für die Reinigung von mehreren Milligramm Antikörper. Die erforderliche Menge an resuspendierter Gülle vorsichtig in die gekappte Säule einfließen lassen.Öffnen Sie den Spaltenausgang vom unteren Rand der Spalte, und lassen Sie ihn abfließen, bis der größte Teil des Puffers weg ist. Sofort 10 Milliliter Waschpuffer ein Mal PBS auf die Oberseite gießen. Lassen Sie es abtropfen und wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.Wenden Sie das gefilterte Beispiel aus Schritt 5 auf die Spalte an, und erfassen Sie den Durchfluss. Aliquot 50 Mikroliter Durchfluss für spätere Analysen. Speichern Sie den Rest des Durchflusses, falls sich der Antikörper nicht in das Harz bindet.Waschen Sie das Harz zweimal mit 10 Millilitern von einem Mal PBS, um unspezifische Bindung zu reduzieren. Wenn gewünscht, aliquot 50 Mikroliter Waschen, wenn der Puffer durch die Säule abfließt, um sicherzustellen, dass der Zielantikörper nicht mit einem Waschpuffer angespielt wird. Während der Waschpuffer durch das Harz läuft, richten Sie fünf Mikrozentrifugenrohre mit 125 Mikrolitersteril, einem Molarentris-HCL bei pH-Wert acht zur Neutralisierung des Elutionspuffers ein und beschriften Sie sie.Alternativ fügen Sie 30 Mikroliter von zwei Molaren Tris Basis, um mehr konzentriertee Eluat zu erhalten. Während der Elution kann UV-Licht zur Visualisierung verwendet werden. Dies muss nicht für die Dauer der Elution erfolgen.Wenn Sie UV verwendet werden, achten Sie darauf, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen, um Schäden an Augen und Haut zu vermeiden. Ein UV-Licht muss während des Elutionsschritts nicht verwendet werden. Elute die Antikörper, indem sie fünf Milliliter Elutionspuffer auf die Säule auftragen und eine Milliliter-Fraktion auf jedes vorgesehene Rohr aus dem vorherigen Schritt sammeln.Regenerieren Sie die Säule sofort, indem Sie 20 Milliliter gefolgt von 10 Milliliter Waschpuffer aufbringen. Stellen Sie sicher, dass das Harz nicht über einen längeren Zeitraum in einer sauren Umgebung zurückgelassen wird. Elution sollte fluoreszierend erscheinen.Oft ist die höchste Fluoreszenz in der zweiten Elution zu sehen, kann aber von Extraktion zu Extraktion variieren. Zur Lagerung das Harz mit 10 Millilitern 20% Ethanol und PBS waschen und halbabtropfen lassen. Recap the top, then the bottom of the column and keep upright at four degrees C.Bestimmen Sie die Antikörperkonzentration mit einem Fotospektrometer, indem Sie die Absorption bei 280 Nanometern messen.Bewahren Sie die Eluate in negativen 80 Grad Celsius und aliquot 50 Mikroliter jeder Fraktion in einem separaten Rohr für die weitere Analyse auf. In der Regel können Proteindauern bis zu 10 Mal ohne signifikanten Effizienzverlust wiederverwendet werden. Beziehen Sie sich auf die Herstellerrichtlinien für spezifische Details bestimmen Die Antikörperkonzentration, indem sie ein Spektralphotometer verwenden, indem sie die Absorption bei 280 Nanometern messen.Bewahren Sie die Eluate bei minus 80 Grad Celsius und aliquot 50 Mikroliter jeder Fraktion in einem separaten Rohr für die weitere Analyse auf. Die Analyse des gereinigten Proteins durch die Zs-Seite kann durch die folgenden Standardprotokolle erfolgen. Beobachtete Fluoreszenz als Ergebnis, das auf den Erfolg des Klonens, der Infiltration und der Expression eines GFP-haltigen Konstrukts hindeutet.Im Laufe von ein paar Tagen sollten Die Leuchtstoffröhren mit hoher Fluoreszenz an den Tagen vier und fünf schrittweise zunehmen. Wenn Protein G verwendet wird, zeigt die fluoreszierende Proteinbindung und die anschließende Elution aus der Kolonne die Reinigung einer IgG-Fusion an, die als stabiles GFP enthalten ist. Und das UV-exponierte Gel, sie können nur die 25KDa und 75KDa Bänder der Leiter zu sehen.Sie können auch sehen, die nicht reduzierte Elution 2 Probe. Die nicht reduzierte Elution behält ihre Fluoreszenz als relative Größe, die man von einem intakten IgG als stabile GFP-Fusion erwarten würde. In der Coomassie werden sowohl reduzierte als auch nicht reduzierte Proben visualisiert.Alle Leiterkomponenten sind sichtbar, native Proteine und IgG-Fusionen sind im Gesamtextrakt Überstand zu sehen und fließen durch Proben. Die Wäsche enthält eine kleine Menge IgG-Fusion. Elution eins und vier enthielten weniger konzentriertes Protein, wie erwartet wird, da die meisten Proteine im Allgemeinen aus dem zweiten und dritten Elutionsschritt entweicht enden.Elution 2 nicht reduzierend kann auch gesehen werden, dass mehrere Bänder in allen reduzierenden Elutionsproben vorhanden sind. 75KDa zeigt eine schwere Kettensicherung zu GFP an. 50KDa zeigt allein eine schwere Kette an, 25KDa zeigt allein eine leichte Kette an, und 10 KDA deutet wahrscheinlich auf eine Degradation hin, die durch die Zugabe von Proteasehemmern verhindert werden kann.Dieses Protokoll kann zur Reinigung jedes Antikörpers verwendet werden, der mit jedem gewünschten Zielprotein verschmolzen wird. Der Prozess kann so bearbeitet werden, dass es verschiedene Mengen an Blattmaterial aufnehmen kann, und ermöglicht auch die visuelle Bestimmung der Proteinpräsenz vor, während und nach Abschluss der Proteinextraktions- und -reinigungsprozesse. Diese Methoden können als Kontrollen nützlich sein und können zweckdienlich für Unterrichtstechniken sein.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

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