Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

אנו מודים למריה פיה דיפאלמה על עריכת הסרטון. אנו מודים גם למשרד לסיוע חינוכי ושירותי סטודנטים באוניברסיטת אריזונה על הסיוע הנדיב שלהם בדמי פרסום. מחקר עבור פרוטוקול זה נתמך על ידי בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה.

1. לטפח נ. צמחים benthamiana 
<ol><li>מניחים כדורי כבול אדמה על מגש ויוצקים מבושלים קודם לכן, עדיין חמים (כ-40-45 מעלות צלזיוס), מים מעל כדורי כבול להתרחבות מלאה. לאחר כדורי מורחבים באופן מלא, מניחים 2-3 N. זרעי benthamiana על כל כדור כבול באמצעות פינצטה.</li>
	<li>יוצקים כ-0.5 לתוך מים כדי ?...

פרוטוקול זה יכול לשמש לאימות חזותי של כל Ab רקומביננטי או חלבון רקומביננטי המיוצר בצמחים N. benthamiana, כולל אלה הדורשים חשיפה זמנית לסביבות חומציות למטרותטיהור עמודה 42,43,44. יתר על כן, ההיתוך של asGFP לחלבונים אחרים במערכות ביטוי שונות יכול ל?...

דו"חות התעשייה מצביעים על כך ש-13 מתוך 20 התרופות המרוויחות ביותר בארה"ב היו ביולוגיות (תרופות מבוססות חלבון), מבין תשע מהן היו נוגדנים. נכון ל-2019, היו יותר מ-570 נוגדנים (Ab)טיפוליים בשלבי פיתוח קליניים שונים 1,2,3. המכירות הגלובליות הנוכחיות של Ab עולות על 100 מיליארד דולר, והשוק הטיפולי המונוקלונלי Ab (mAb) צפוי להניב עד 300 מיליארד דולר עד 20251,4. עם ביקוש גבוה כזה ותוססות צפויות בהכנסות, חוקרים כבר עובדים כדי לפתח דרכים לייצר Ab therapeutics בקנה מידה גדול יותר, עם איכות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר. מערכות ביטוי המבוססות על צמחים כוללות מספר יתרונות על פני קווי תאים מסורתיים של יונקים לייצור במחיר סביר ובהיקף גדול של Ab therapeutics5,6. ייצור של טיפולים חלבונים בצמחים ("pharming מולקולרי") אינו דורש ביו-כורים יקרים או מתקני תרבות תאים כמו טכניקות מסורתיות של תרבותתאים יונקים 7,8. צמחים לא יכולים לנדבק בפתוגנים אנושיים, מזעור זיהום פוטנציאלי9. ביטוי חלבון ארעי וטרנסגני המבוסס על צמחים יכול להיות מנוצל כחלופות בעלות נמוכה יותר למערכות ייצור יונקים אוחיידקים 10. למרות צמחים טרנסגניים מועדפים לייצור יבול, ייצור חלבון רקומביננטי באמצעות שיטה זו יכול לדרוש שבועות עד חודשים. התקדמות בביטוי ארעי באמצעות וקטורים ויראליים באמצעות מזרק או ואקום אגרו-סינון מאפשרת ייצור בקנה מידה קטן וגדול, בהתאמה, של החלבון הרצויבימים 11,12,13,14. ייצור mAbs נגד אבולה, דנגה, זיקה, וחלבונים רקומביננטיים רבים אחרים, יוצרו וטוהרו במהירות וביעילות באמצעות ביטוי ארעי בצמחים N. benthamiana 15,16,17,18,19. נסיבות אלה הופכות ביטוי ארעי המבוסס על צמחים לאפשרות אטרקטיבית לפיתוח טיפולי Ab מרובים והשיטות שהוצגו בפרוטוקולזה 20.
הדור הראשון mAbs היו של נגזרת מורין, אשר הביא אימונוגנים לא ספציפיים כאשר נעשה שימוש בניסויים בבניאדם 21. לאורך זמן, כימרית, הומנית, ובסופו של דבר, שרירי בטן אנושיים לחלוטין יוצרו כדי להפחית את החיסונים המושרה על ידי Ab therapeutics. למרבה הצער, חלק Abs אלה עדיין לגרום immunogenicity המארח בשל הבדלים גליקוסילציה21. התפתחויות בהנדסת צמחים אפשרו שינוי של גליקנים Ab, וזה חיוני מאז היציבות והפונקציה של Ab יכול להיות מושפע באופן משמעותי על ידי מצב גליקוסילציהשלה 22. ההתקדמות אפשרה ייצור במערכות צמחים של ביטוי ברמה גבוהה של mAbs הומני, המכיל גליקנים אנושיים וכתוצאה מכך את התכונות הביולוגיות הרצויות של תרופות אדם בייצורהמוני 19,21.
בנוסף שרירי בטן רקומביננטי, מולקולות היתוך Ab (היתוך Ab) נחקרו למטרות שונות בעשורים האחרונים. היתוך Ab מורכב לעתים קרובות שבר Ab או Ab התמזגו מולקולה או חלבון נועדו לעורר תגובות מתאי השפעה חיסונית23. מולקולות אלה נוצרו כהתערבויות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בפתולוגיות שונות כגוןסרטן ומחלות אוטואימוניות 24,25,26,27. תסביך חיסוני רקומביננטי (RICs) הם סוג נוסף של היתוך Ab שהועסקו כמועמדים לחיסון28. RICs לנצל את היכולת של המערכת החיסונית לזהות אזורי Fc של היתוך Ab נמצאו כדי לשפר את immunogenicity בשילוב עםפלטפורמות חיסון אחרות 29,30,31.
חלבון פלורסנט ירוק (GFP) הוא חלבון ביולומיין המופק מדוזה אקוורה ויקטוריה, אשר פולט אור ירוק כאשר מתרגש אור אולטרהסגול 32,33. במהלך השנים, השימוש של GFP כסמן חזותי של ביטוי גנים התרחב מביטוי בEscherichia קולי למערכות ביטוי חלבון רבות, כולל נ. benthamiana צמחים 34,35,36,37,38. סמנים גלויים, כגון GFP, יש השלכות בשפע בהוראה ולמידה של מושגים מדעיים. סטודנטים רבים ברמה ההדרגתי מתארים קשיים בתפיסת מושגים מדעיים כאשר הרעיון הנלמד אינו גלוי לעין בלתי, כגון המושגים של ביולוגיה מולקולרית ותחומיםקשורים 39. סמנים חזותיים, כמו GFP, יכולים לתרום לעיבוד מידע הקשור לתהליכים המדעיים, יכולים לעזור להפחית את הקשיים שהתלמידים מדווחים עליהם בלימוד מושגים מדעיים רבים.
למרות GFP משמש לעתים קרובות כסמן כדי לציין גן וביטוי vivo, קשה לדמיין את זה בתהליכים במורד הזרם אם באמצעות תנאים חומציים. נסיבות אלה נובעות בעיקר מכך ש-GFP אינו שומר על המבנה שלו ועל הפלואורסץ הנובע מכך ב-pH40 נמוך. סביבות חומציות זמניות נדרשות לעתים קרובות בתהליכי טיהור שונים, כגון חלבון G, חלבון A, וחלבון L כרומטוגרפיה, לעתים קרובותמנוצל עבור Ab טיהור 41,42,43,44. מוטנטים GFP שימשו כדי לשמור על פלואורסצינטי בתנאים חומציים45,46.
בכאן אנו מתארים שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של חלבוני היתוך IgG רקומביננטי בצמחים N. benthamiana. יצרנו GFP מסורתי התמזגו N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך GFP-IgG. במקביל, פיתחנו את ההיתוך של רצף ממוטב codon צמח עבור GFP חומצה יציבה (asGFP) כדי N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך asGFP-IgG. היתרונות של ייצור GFP-IgG כוללים את היכולת לדמיין את הנוכחות של חלבון היעד במהלך הביטוי, בעוד asGFP-IgG מאפשר לראות את הנוכחות של חלבון רקומביננטי לא רק שלבי הביטוי והחילוץ אלא גם בשלבי הטיהור של החלבון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור, טיהור, והדמיה חזותית של מגוון של חלבוני היתוך GFP המיוצר N. benthamiana ומטוהר באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה הדורשות pH נמוך. התהליך יכול להיות מותאם גם לכמויות שונות של חומר עלה. בעוד Abs וחלבונים היתוך מתויגים GFP או asGFP אינם מיועדים לשימוש עבור טיפולים, שיטות אלה יכול להיות שימושי כמו פקדים במהלך ניסויים, ניתן גם להשתמש ככלי הוראה לביולוגיה מולקולרית ותאי וביוטכנולוגיה, הן פנים אל פנים וכמעט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

ביקוש גבוה לנוגדנים כהתערבויות טיפוליות למחלות זיהומיות, מטבוליות, אוטואימוניות, ניאופלסטיות ומחלות אחרות יוצר צורך הולך וגדל בפיתוח שיטות יעילות לייצור נוגדנים רקומביננטיים. נכון ל-2019, היו יותר מ-70 נוגדנים חד-קלונליים שאושרו על ידי ה-FDA, ויש פוטנציאל צמיחה אקספוננציאלי. למרות הבטחתם, הגבלת הגורמים לשימוש נרחב הם עלויות ייצור ומורכבות. בפוטנציה, צמחים מציעים אסטרטגיות ייצור חלבון בעלות נמוכה, בטוחה ומדרגית בקלות. צמחים כמו Nicotiana benthamiana לא רק יכול לקפל כראוי להרכיב חלבונים יונקים מורכבים, אלא גם יכול להוסיף שינויים קריטיים לאחר תרגום דומה לאלה המוצעים על ידי תרבויות תאים יונקים. בעבודה זו, באמצעות GFP מקורי וגרסה חומצית יציבה של חלבון פלורסנט ירוק (GFP) התמזגו לנוגדנים חד-שבטיים אנושיים, הצלחנו לדמיין את כל תהליך ההבעה והטיהור של נוגדנים ארעיים מצמחי N. benthamiana. בהתאם למטרת הניסוי, היתוך GFP מקורי יכול להבטיח הדמיה קלה יותר במהלך שלב הביטוי בצמחים, בעוד היתוך GFP יציב חומצה מאפשר הדמיה במהלך עיבוד במורד הזרם. הליך מדרגי וישיר זה יכול להתבצע על ידי חוקר יחיד לייצר כמויות מיליגרם של נוגדנים טהורים מאוד או חלבוני היתוך נוגדנים בעניין של ימים באמצעות רק כמה צמחים קטנים. טכניקה כזו יכולה להיות מורחבת להדמיה של כל סוג של תהליך טיהור נוגדנים ופוטנציאל חלבונים רבים אחרים, הן במערכות צמחים והן במערכות ביטוי אחרות. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להפיק תועלת מהוראות וירטואליות ולהיצא לפועל במעבדת הוראה על ידי סטודנטים לתואר ראשון בעלי ניסיון קודם מינימלי עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מתן בסיס למחקר מבוסס פרוייקט עם יישומים בעולם האמיתי.

מחקר זה מדגים שיטה קלה ומהירה לייצר חלבונים רקומביננטיים ולדמיין אותם לאורך תהליכים במורד הזרם. באמצעות N. benthamiana ובעקבות הפרוטוקול שסופק, ייצור חלבון רקומביננטי המתואר כאן ניתן להשיג בתוך פחות משבוע. זרימת העבודה הכוללת של ביטוי צמח, חילוץ וטיהור מוצגת באות 1. השלבים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

זוהי הדגמה של שיטה פשוטה לביטוי, מיצוי וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בצמחים הקשורים טבק Nicotiana benthamiana. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל לטיהור והדמיה של נוגדנים המיוצרים על ידי צמחים, היתוך נוגדנים, ורוב החלבונים שניתן לטהר באמצעות כרומטוגרפיה של עמודה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ולסטודנטים במעבדות עבודה באוניברסיטה לדמיין חלבונים מתויגים GFP ברוב השלבים של תהליך ייצור החלבון.מניחים כדורי כבול אדמה על מגש ויוצקים בעבר מבושל, עדיין מים חמים על כדורי כבול להרחבה מלאה. כדורים ייקח כמה דקות כדי להרחיב באופן מלא. לאחר משטחים מורחבים לחלוטין, מקום שניים עד שלושה זרעי Nicotiana benthamiana על כל גלולת כבול באמצעות פינצטה.לאחר שזה נעשה, תצטרך לשפוך על 0.5 סנטימטרים של מים כדי לכסות את החלק התחתון של המגש. אל תשכח לתייג את המגש עם תאריך הזריעה. ממשיכים להשקות את השתילים מדי יום עם כמויות מתאימות של דשן.המגש צריך להיות מכוסה בחלק עליון לח ומקום בתא צמיחה. גלולת כבול זרע צריך להישמר בתא הצמיחה ב 23 עד 25 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ו 60% לחות יחסית. לאחר שבוע, להסיר צמח נוסף מן גלולה עוזב כל משטח כבול עם שתיל אחד בלבד.כאשר הצמחים בני שבועיים עד שלושה שבועות, מעבירים כל גלולת כבול לסיר בודד המכיל אדמה מבוקרת לחות. ממשיכים להשקות שתילים מדי יום עם גרם אחד לדשן ליטר, אף פעם לא משאירים את האדמה יבשה לחלוטין. צמחים מוכנים להסתננות כשהם בני חמישה עד שישה שבועות.השלבים הבאים חייבים להיעשות ליד מבער Bunsen וטכניקות aseptic בסיסיות צריך להיות מיושם כדי למנוע זיהום. תצטרך צלחת קנאמיצין Lb. מיקרוגרם אחד לריכוז קנאמיצין מיליליטר.הקפד עם שתי מוטציות EHA105 מחסה המבנה הרצוי שלך kanamycin עמיד וגדל בן לילה. EHA105 הוא אחד הזנים הנפוצים ביותר של אגרובקטריום שתי מוטציות. כדי להתחיל את התרבות, למלא צינור חרוט עם 10 מיליליטר של מדיה ליברות, הבא, ב 10 microliters של 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin, אתה יכול גם להוסיף 10 microliters של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של ריפאמפיצין כדי למנוע זיהום e-coli.מהצלחת, תשתמש במושבה מבודדת אחת שאומתה על ידי PCR כדי להגדיל את התרבות החדשה שלך. בחר את המושבה המבודדת שלך וחסן אותה לתוך ה-lb. שים את החיסון על השייקר.דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ו 120 עד 150 סל"ד לילה. למחרת, אם תרבות האגרובקטריום נמשכת OD600 שווה 0.6 כדי 0.9 זה יכול לשמש להסתננות. אם הוא מגודל OD600 מעל אחד עד שני מיליליטר צריך להיות מועבר ק"ג טרי עם אנטיביוטיקה וגדל OD600 הנדרש.פעם אחת ב OD600 המתאים למקם את התרבויות בצנטריפוגה, לוודא כי הצנטריפוגה מאוזנת. פלט את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4, 500G במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הם לא יכולים להתגונן משתי הדגימות.לאחר מכן בצע שימוש חוזר בכל גלולה ומאגר חדירת X אחד כדי להביא את ה- OD הסופי ל- 0.4. שלב כמויות שוות של כל מבנה היתוך IgG עם מבנה שרשרת האור, כדי לקבל את OD הסופי של 0.2 לכל מבנה בכל צינור. קח מהדק וצמח בן חמישה עד שישה שבועות ובנת'אניאנה מהשיל הראשון.באמצעות הקצה החד של מהדק נפרש לעשות לנקב קטן בשכבה האפידרמיס הראשונה של העלה. הימנע מנקב את העלה לאורך כל הדרך. מלא מזרק מיליליטר אחד ללא מחט המחוברת עם פתרון האגרובקטריום המוכן מהשנה השניה.מכסים את החור שנעשה בשלב הקודם עם סוף המזרק. ולאט לאט לדחוף להזריק את החיידקים לתוך העלה תוך הפעלת לחץ נגדי עדין מאחורי העלה. נסו לחדור את רוב העלה ולתקוע את העלה עד שלוש עד ארבע פעמים, נזק עודף עלים עלול לעכב את תפוקת החלבון.צפה עלה להכהות כמו הפתרון מוזרק מבלי להפעיל יותר מדי לחץ על המזרק. עלה הצמח הסתנן יופיע כהה בעיקר מהנוף התחתון. שים לב כי פתרון חיידקי זה צריך להיות מספיק לפחות שלושה עד ארבעה צמחים לכל מבנה.יש לבודד באופן אוטומטי כל פתרון חיידקי שנותר לפני ההשלכה. לאחר סיום חדירה ללא מחט, למקם צמחים בחזרה בתא הצמיחה ולהמשיך להשקות מדי יום. נצפה העלים עבור כלורוזיס, נמק, כמו גם עבור פלואורסצנטיות GFP, מנורת UV גל ארוך וקצר בחורף.בדרך כלל עוזב בימים 4 ו -5 להראות את הפלואורסצנטיות GFP הגבוהה ביותר. לקצור את כל העלים בארבעה עד חמישה ימים לאחר הסתננות ולשקול את הכמות הכוללת של חומר עלה. אתה יכול להשתמש בחומר עלה מיד לעיבוד במורד הזרם, או שאתה יכול להקפיא אותו שלילי 80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להשתמש במקום הצמחים הסתננו בחזרה בתא הצמיחה ולהמשיך להשקות מדי יום.הבחין בעלים עבור כלורוזיס, נמק, שינויים בצבע ומוות רקמת עלה באזורים הסתננו. צמחים שנצפו עבור פלואורסצנטיות GFP. אם GFP קיים תחת מנורת UV גל ארוך וקצר.ביטוי החלבון עולה עם הזמן, עם הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר של שני מבני GFP המתרחשים בדרך כלל בין ימים 4 ו -5. לקצור את כל העלים בארבעה עד חמישה ימים לאחר הסתננות ולשקול את החומר עלה הכולל. השתמש בו מיד לתהליכים במורד הזרם או להקפיא ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש.במהלך תהליך המיזוג, הקפד לשמור חוצצים ו כוסות בלנדר על קרח או בארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. מניחים רקמת צמח משלב 4 לתוך בלנדר לפני המשפט. במאגר מיצוי מצונן המכיל ריכוזי PMSF ונתרן אסקורבאט בהתאמה לגביע הבלנדר.מניחים את הבלנדר על הבלנדר, לוקחים גיליון חתוך מראש של סרט פרה ומותחים אותו על החלק העליון של הבלנדר. ערבבו את רקמת העלה עם חיץ מיצוי כדי לדמיין 80 עם מרווחים 22. יהיה עליך לערבב היטב בין מחזורי תערובת לפי הצורך.התערובת צריכה להיראות הומוגנית ללא גושים של חומר עלה. מעבירים חומר מעורבב לסק. בבר מערבבים ומערבבים אותו במשך ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לשפר את מובילות החלבון ולאפשר משקעים של מוצקים.מניחים שתי שכבות של בד חשוף על מקור נקי על קרח ויוצקים את התמצית דרכו כדי להסיר פסולת עלים גדולה. אחרי הכל התמצית נשפכת דרך בד המראה לקפל את בד המראה כדי לסחוט את תמצית עלה שיורית. התמצית אמורה להופיע ירוק כהה ללא חלקיקים גלויים.מעבירים את התמצית לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה התמצית ב 16, 000Gs במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. זה יהיה גלולה כל חומר מסיס שנותר.ודא כי שני הצינורות מאוזנים כי מכסה הרוטור הוא הידק היטב. לאחר צנטריפוגה, גלולה צריך להיות גלוי, אומר על טבעי להשליך את גלולה. סנן את העל-טבעי באמצעות מזרק 50 מיליליטר ומסנן סיבי זכוכית.לאסוף 50 microliters של מדגם ולתייג תמצית גולמית לניתוח מאוחר יותר. הגדר עמוד פוליפרופילן המכיל 20 מיליליטר של דגימה. להעריך את כמות תרחיף הדרושים בהתאם לסוג האימונוגלובולין היעד ואת הזיקה שלה שרף.בהדגמה זו, אנו משתמשים בשלושה מיליליטר של תרחיף. בדרך כלל שלושה מיליליטר של תרחיף הכולל עם 1.5 מיליליטר נפח המיטה יעיל לטיהור של כמה מיליגרם של נוגדנים. בזהירות pipette את הכמות הנדרשת של תרחיף resuspended לתוך העמודה כתרים.פתח את שקע העמודה מתחתית העמודה ואפשר לו להתנקז עד שרוב המאגר יתרוקן. מיד לשפוך 10 מיליליטר של חיץ לשטוף פעם אחת PBS על גבי. תן לו לנקז ולחזור על שלב שטיפה זה פעמיים.החל את הדוגמה המסוננת מהשנה החמישית על העמודה ואסוף את הזרימה. Aliquot 50 מיקרוליטרים של זרימה דרך לניתוח מאוחר יותר. שמור את שאר הזרימה דרך במקרה הנוגדן לא להיקשר לתוךשרף.לשטוף את שהף פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS פעם אחת כדי להפחית כריכה לא ספציפית. אם תרצה, aliquot 50 microliters של לשטוף כמו המאגר מתנקז דרך העמודה כדי לוודא כי נוגדן היעד אינו רמז עם חיץ לשטוף. בעוד חיץ לשטוף פועל דרך שרף, התקנה תווית חמישה צינורות מיקרו צנטריפוגה עם 125 microliters של סטרילי, אחד טוחנת טוחנת tris-HCL ב pH שמונה לנטרול מאגר אלוטיון.לחלופין, להוסיף 30 microliters של שני בסיס טריס טוחן כדי לקבל יותר מרוכז eluate. במהלך האלוטיון, אור UV עשוי לשמש להדמיה. זה לא צריך להיעשות למשך תקופת האלוטיון.אם אתה UV נמצא בשימוש, הקפד ללבוש ציוד מגן אישי המתאים, כדי למנוע נזק לעיניים ולעור. אין צורך להשתמש באור UV במהלך שלב האלוטיון. להניף את הנוגדנים על ידי החלת חמישה מיליליטר של חיץ אלוט על העמוד ולאסוף שבר אחד מיליליטר, על כל צינור המיועד מהשל הקודם.מיד ליצור מחדש את העמודה על ידי החלת 20 מיליליטר ואחריו 10 מיליליטר של חיץ לשטוף. ודא השרף לא נשאר בסביבה חומצית לתקופה ממושכת של זמן. אלוטיון אמור להופיע פלואורסצנטי.לעתים קרובות הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נראית באלוטיון השני, אך יכולה להשתנות מחילוץ לחילוץ. לאחסון, לשטוף את הגוף עם 10 מיליליטר של 20%אתנול ו PBS ולתת ניקוז באמצע הדרך. סכם את החלק העליון, ואז את החלק התחתון של העמוד ולשמור זקוף בארבע מעלות C. לקבוע את ריכוז הנוגדנים באמצעות ספקטרומטר צילום על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר.לאחסן את eluates שלילי 80 מעלות צלזיוס ו aliquot 50 microliters של כל שבר לצינור נפרד לניתוח נוסף. בדרך כלל ניתן לעשות שימוש חוזר בחלבון עד פי 10 ללא אובדן משמעותי של יעילות. עיין בהנחיות היצרן לפרטים ספציפיים לקבוע ריכוז נוגדנים, באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר.לאחסן את eluates במינוס 80 מעלות צלזיוס ו aliquot 50 microliters של כל שבר לתוך צינור נפרד לניתוח נוסף. ניתוח של חלבון מטוהר על ידי דף Zs יכול להיעשות על ידי ביצוע פרוטוקולים סטנדרטיים. נצפתה פלואורסצנטיות כתוצאה מכך מצביעה על הצלחה של שיבוט, חדירה וביטוי של מבנה המכיל GFP.במהלך כמה ימים, פלואורסצנטים צריכים להגדיל בהדרגה עם פלואורסצנטיות גבוהה בימים 4 ו -5. כאשר חלבון G משמש חלבון פלואורסצנטי מחייב ואלוטיון הבאים מהטור מציין טיהור של היתוך IgG המכיל GFP יציב. ואת הג'ל UV חשוף, אתה יכול לראות רק את 25KDa ו 75KDa להקות של הסולם.אתה יכול גם לראות, את הדוגמה אלוטיון מופחת 2. האלוטציה הלא מופחתת שומרת על הפלואורסצנטיות שלה כגודל היחסי אפשר היה לצפות מ- IgG שלם כהיתוך GFP היציב שלו. בג'ל הכתמים קומאסי הן דגימות מופחתות ולא מופחתות הם דמיינו.כל רכיבי הסולם גלויים, חלבונים מקומיים והיתוך IgG ניתן לראות תמצית הכוללת על טבעי לזרום דרך דגימות. הכביסה מכילה כמות קטנה של היתוך IgG. Elution 1 ו-4 הכילו חלבון פחות מרוכז כצפוי, מכיוון שרוב החלבון חמק בדרך כלל מהצעד השני והשלישי.אלוטיון 2 ללא צמצום ניתן לראות גם להקות מרובות קיימות בכל דגימות אלוטיון הפחתת. 75KDa מציין פתיל שרשרת כבד לGFP. 50KDa מציין שרשרת כבדה בלבד, 25KDa מציין שרשרת אור לבד, ו 10 KDA סביר מצביע על השפלה אשר ניתן למנוע על ידי תוספת של מעכבי פרוטאז.פרוטוקול זה יכול לשמש לטיהור של כל נוגדן מותך לכל חלבון היעד הרצוי. ניתן לערוך את התהליך כך שיכיל כמויות שונות של חומר עלים, ומאפשר גם קביעה ויזואלית של נוכחות חלבונים לפני, במהלך ואחרי סיום תהליכי מיצוי וטיהור החלבון. שיטות אלה יכולות להיות שימושיות כפקדים יכולות להיות מטרה לטכניקות הוראה.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...