Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

私たちは、ビデオを編集するためのマリアピアディパルマに感謝します.また、アリゾナ州立大学の教育アウトリーチと学生サービス局の寛大な出版料援助に感謝します。このプロトコルの研究は、生命科学の学校によってサポートされました, アリゾナ州立大学.

1. N.ベンタミアナ植物の 栽培
<ol><li>トレイに土壌泥炭ペレットを置き、完全に膨張するために泥炭ペレットの上に熱い(〜40〜45°C)、以前に沸騰した水を注ぎます。ペレットを完全に拡張した後、ピンセットを使用して各泥炭ペレットに2-3 N.ベンタミアナ 種子を置きます。</li>
	<li>トレイの底を覆うために約0.5を水に注ぎます。トレイにシード日を付け...

このプロトコルは、N.ベンタミアナ植物で産生される任意の組換えAbまたは組換えタンパク質の視覚的検証に利用することができ、カラム精製目的で酸性環境への一時的な暴露を必要とするものである42、43、44。さらに、異なる発現系における他のタンパク質へのasGFPの融合は、実験的な可視化および教育のための有...

業界の報告によると、米国で最も高く評価されている20種類の医薬品のうち13種類が生物学的製剤(タンパク質ベースの医薬品)であり、そのうち9薬が抗体であった。2019年時点で、様々な臨床開発段階で570以上の抗体(Ab)治療薬が1、2、3であった。現在の世界のAbの売上高は1,000億米ドルを超え、モノクローナルAb(mAb)治療市場は2025年1、4.4年までに最大3,000億米ドルを生み出す見込みです。このような高い需要と収益の増加が見込まれる中、研究者は、より高品質で低コストで、これまで以上に大きな規模でAb治療薬を生産する方法の開発に取り組んできました。植物ベースの発現系は、Ab治療薬5,6の手頃な価格で大規模な製造のための伝統的な哺乳類細胞株に対していくつかの利点がある。植物におけるタンパク質治療の生産(「分子ファーミング」)は、伝統的な哺乳類細胞培養技術7,8のように高価なバイオリアクターまたは細胞培養施設を必要としない。植物は人間の病原体を収縮させることはできず、潜在的な汚染を最小限に抑える9.一過性およびトランスジェニック植物ベースのタンパク質発現はいずれも、哺乳動物または細菌産生系10に対する低コストの代替として利用することができる。トランスジェニック植物は作物の生産に好ましいが、この方法を用いた組換えタンパク質の生産には数週間から数カ月が必要となる。シリンジまたは真空アグロインフィルを介したウイルスベクターを用いた過渡発現の進歩により、それぞれ、11日目、12日、13日、14日目に所望のタンパク質の小規模および大規模な産生が可能になる。エボラ出血熱に対するmAbsの産生は、デング熱および、ジカ、および他の多くの組換えタンパク質が、N.ベンタミアナ植物15、16、17、18、19において一過性発現を用いて迅速かつ効率的に産生および精製された。これらの状況は、一過性植物ベースの発現を複数のAb治療薬を開発するための魅力的な選択肢と、このプロトコル20で示された方法を作る。
第1世代mAbsはマウス誘導であり、ヒト試験21で使用すると非特異的な免疫原性をもたらした。時間が経つにつれて、キメラ、ヒト化、そして最終的には、アブ療法によって誘発される免疫原性を低下させるために完全にヒト腹筋が産生された。残念ながら、これらの腹筋のいくつかは、グリコシル化21の違いのために宿主免疫原性を引き起こす。植物工学の発展は、Abの安定性と機能がそのグリコシル化状態22によって著しく影響を受ける可能性があるため不可欠であるAbグリカンの修飾を可能にした。進歩により、ヒト化mAbsの高レベル発現の植物系での生産が可能となり、ヒトグリカンを含み、結果的に大量生産されたヒト医薬19,21の所望の生物学的形質を含む。
組み換えAbsに加えて、Ab融合分子(Ab融合)は、ここ数十年で様々な目的のために探求されてきた。Ab融合は、しばしば分子またはタンパク質に融合したAbまたはAb断片から構成され、免疫エフェクター細胞23からの応答を引き出すために設計されている。これらの分子は、癌や自己免疫疾患24、25、26、27などの様々な病理を治療するための潜在的な治療介入として作成されています。組換え免疫複合体(IC)は、ワクチン候補28として採用されているAb融合の別のクラスである。ICは、Ab融合のFc領域を認識する免疫系の能力を利用し、他のワクチンプラットフォーム29、30、31と組み合わせると免疫原性を改善することが分かった。
緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲエーコレアビクトリアに由来する生物発光タンパク質であり、紫外線32、33で励起すると緑色の光を発する。長年にわたり、GFPの遺伝子発現の視覚マーカーとしての使用は、大腸菌の発現から、N.ベンタミアナ植物34、35、36、37、38を含む多数のタンパク質発現系へと拡大してきた。GFPのような目に見えるマーカーは、科学的概念の教えと学習に豊富な意味を持っています。多くのエントリーレベルの学生は、分子生物学の概念や関連分野39など、教えられている考えが肉眼では見えない場合に科学的概念を把握することの難しさを説明する。GFPのような視覚マーカーは、科学的プロセスに関連する情報の処理に貢献することができ、学生が多くの科学的概念を学ぶ上で報告する困難を軽減するのに役立ちます。
GFPは生体内で遺伝子や発現を示すマーカーとしてよく用いられますが、酸性条件を使用する場合は下流工程で可視化することは困難です。この状況は主に、GFPが低pH40でその構造および結果蛍光を維持しないためである。一時的な酸性環境は、タンパク質G、プロテインA、およびプロテインLクロマトグラフィーなどの様々な精製プロセスにおいてしばしば必要とされ、Ab精製41、42、43、44にしばしば利用される。GFP変異体は、酸性条件下で蛍光を保持するために用いられてきた45,46.
ここで 、N.ベンタミアナ 植物における組換えIgG融合タンパク質の発現、抽出、精製のための簡単な方法について述べている。ヒト化IgG重鎖のN末流に融合した伝統的なGFPを製造し、GFP-IgG融合を生み出しました。同時に、酸安定性GFP(asGFP)の植物コドン最適化配列をヒト化IgG重鎖のN末流に融合させ、asGFP-IgG融合を生み出しました。GFP-IgGを製造する利点は、発現中に標的タンパク質の存在を可視化する能力を含むが、asGFP-IgGは、発現および抽出ステップだけでなく、タンパク質の精製ステップにおいても組換えタンパク質の存在を見ることができる。このプロトコルは 、N.ベンタミナ で産生されるGFP融合タンパク質の生産、精製、可視化に適応し、低pHを必要とするクロマトグラフィー技術を使用して精製することができます。プロセスはまた葉材料の様々な量に合わせることができる。GFPまたはasGFPでタグ付けされた腹筋および融合タンパク質は、治療に使用することを意図していませんが、これらの方法は実験中のコントロールとして有用であり、また、分子細胞生物学とバイオテクノロジーの教育ツールとしても、対人的にも仮想的にも利用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

様々な感染性、代謝、自己免疫、新生物、および他の疾患の治療介入として抗体の需要が高く、組換え抗体産生のための効率的な方法を開発する必要性が高まっています。2019年現在、FDA承認モノクローナル抗体は70種類を超えており、指数関数的な成長の可能性があります。彼らの約束にもかかわらず、広範囲にわたる使用のための制限要因は、製造コストと複雑さです。潜在的に、植物は低コストで安全で、容易に拡張可能なタンパク質製造戦略を提供します。 ニコティアナベンタミアナ のような植物は、複雑な哺乳類タンパク質を正しく折りたたんで組み立てることができるだけでなく、哺乳類の細胞培養物と同様の重要な翻訳後修飾を追加することができます。本研究では、ヒトモノクローナル抗体に融合した天然GFPと酸性安定型の緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いることで 、N.ベンタミアナ 植物からの一過性抗体の発現および精製プロセス全体を可視化することができた。実験の目的に応じて、ネイティブGFP融合は植物の発現段階での可視化を容易にし、酸安定性のGFP融合は下流処理中の視覚化を可能にする。このスケーラブルで簡単な手順は、わずか数個の小さな植物を使用して数日のうちに非常に純粋な抗体または抗体融合タンパク質のミリグラム量を生成するために、単一の研究者によって行うことができます。このような技術は、植物および他の発現系の両方で、あらゆる種類の抗体精製プロセスおよび潜在的に他の多くのタンパク質の可視化に拡張することができる。さらに、これらの技術は、仮想命令に利益をもたらし、分子生物学技術の経験を最小限に抑えた学部生によって教育研究室で実行され、実際のアプリケーションでプロジェクトベースの探査の基盤を提供します。

本研究は、組み換えタンパク質を作製し、下流プロセス全体にわたってそれらを可視化する簡単かつ迅速な方法を実証しています。N.ベンタミアナを用いて、規定されたプロトコルに従って、ここで説明する組換えタンパク質の産生は1週間以内に達成できる。植物の発現、抽出、精製の全体的なワークフローを図1に示します。2週齢の苗、4週齢の植物、および6週...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

ここでは、 ニコティアナベンタミアナでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法について説明します。このプロトコルはカラムクロマトグラフィーを利用する多数のタンパク質の精製および可視化に拡張することができる。さらに、このプロトコルは対人および仮想大学の教育研究所に適応可能であり、プロジェクトベースの探査を提供する。

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

これは、ニコチアナ・ベンタミアナ植物に関連するタバコでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法のデモンストレーションである。このプロトコルは、植物産生抗体、抗体融合、およびカラムクロマトグラフィーを通じて精製できるほとんどのタンパク質の精製と可視化に利用できます。このプロトコルは、大学の研究ラボの研究者や学生がタンパク質の生産プロセスのほとんどのステップでGFPタグ付きタンパク質を視覚化することを可能にします。トレイに土壌泥炭ペレットを置き、完全に拡張するために泥炭ペレットの上に沸騰した、まだお湯を注ぎます。ペレットは完全に拡大するのに数分かかります。パレットを完全に拡張した後、ピンセットを使用して各泥炭ペレットに2〜3ニコチアナベンタミアナシードを置きます。これが完了したら、トレイの底部を覆うために約0.5インチの水を注ぐ必要があります。シーディング日にトレイにラベルを付けることを忘れないでください。適切な量の肥料で毎日苗に水を与え続けます。トレイはフミドームの上で覆われ、成長室に置く必要があります。シード泥炭ペレットは、16時間の写真期間と60%の相対湿度で23〜25°Cの成長室に保管する必要があります。1週間後、1つの苗だけで各ピートパレットを残してペレットから余分な植物を取り除きます。植物が2〜3週間生きている場合は、各泥炭ペレットを水分制御土壌を含む個々のポットに移します。1リットルの肥料で毎日水の苗を続け、完全に乾燥した土壌を残すことはありません。植物は生後5~6週間で浸潤する準備ができています。次の手順は、ブンゼンバーナーの隣に行う必要があり、基本的な無菌技術は、汚染を避けるために適用する必要があります。Lb カナマイシン プレートが必要です。1ミリリットルカナマイシン濃度あたり1マイクログラム。あなたの望むカナマイシン耐性構造を収容し、一晩成長する2つの突然変異EHA105と厳格。EHA105は、アグロバクテリウム2突然変異の最も一般的に使用される株の1つである。培養を開始するには、10ミリリットルのlb培地で円錐管を充填し、次に、1ミリリットルカナマイシンあたり100マイクログラムの10マイクロリットルで、リファンピシン1ミリリットル当たり10マイクロリットルの10マイクロリットルを加えて大腸菌汚染を防ぐこともできます。プレートから、PCR によって検証された単一の分離コロニーを使用して、新しい文化を成長させます。あなたの孤立したコロニーを選択し、lbにそれを接種します。シェーカーに接種を置きます。摂氏30度、120~150RPMで一晩インキュベートする。翌日、アグロバクテリウム培養物が0.6〜0.9に等しいOD600に引き寄せられた場合、浸潤に使用することができる。それは1〜2ミリリットル以上の成長したOD600は、抗生物質で新鮮なlbに移され、必要なOD600に成長する必要があります。適切なOD600に一度遠心分離機に培養物を配置し、遠心分離機のバランスを取っていることを確認します。4,500Gで常温で20分間遠心分離して菌をペルトする。彼らは両方のサンプルから上華することはできません。次に、各ペレットと 1 つの X 浸潤バッファーを再中断して、最終 OD を 0.4 にします。各IgG融合構造の等しい体積を軽鎖構造と組み合わせて、各チューブ内の構築ごとに0.2の最終ODを得る。ステップ1からペーパークリップと生後5〜6週間とベンタミアナ植物を取ります。クリップの鋭いエッジを展開して、葉の最初の表皮層に小さな穿刺を行います。葉をずっと穿刺しないようにしてください。ステップ2から調製されたアグロバクテリウム溶液で取り付けられた針なしで1ミリリットルの注射器を充填する。前のステップで作成した穴を、スポイトの端で覆います。そして、葉の後ろから穏やかなカウンター圧力を加えながら、葉に細菌を注入するためにゆっくりとプッシュします。葉の大部分に浸透し、葉を最大3〜4回突くようにすると、余分な葉の損傷がタンパク質の収率を妨げる可能性があります。注射器にあまり圧力をかけることなく溶液を注入するので、葉が暗くなります。浸潤した植物の葉は、下のビューからほとんど暗く表示されます。この細菌溶液は、1つの構成体につき少なくとも3〜4つの植物に十分であるべきであることに注意してください。廃棄する前に残りの細菌溶液をオートクレーブする。針なしの浸潤を終えた後、植物を成長室に戻し、毎日水を続けます。クロロシス、壊死、GFP蛍光、冬の長く短波UVランプの葉を観察しました。通常、4日目と5日目に出発すると、最高のGFP蛍光を示します。浸潤後4~5日で全ての葉を収穫し、葉材の総量を量る。葉材は、下流の処理にすぐに使用することも、浸入した植物を成長室に戻して毎日水を続ける準備ができるまで、マイナス80°Cで凍結することもできます。浸潤領域でクロロシス、壊死、色や葉組織死の変化のための葉を観察しました。GFP蛍光の観察植物。GFPが長くて短い波のUVランプの下に存在する場合。タンパク質発現は時間の経過とともに増加し、両方のGFP構築物の蛍光が最も高く、一般的に4日目から5日目の間に起こる。浸潤後4~5日ですべての葉を収穫し、葉材の総重量を量る。下流のプロセスにすぐに使用するか、使用する準備ができるまでマイナス80°Cで凍結します。ブレンドプロセス中は、使用前にバッファーとブレンダーカップを氷の上または摂氏4度に保つようにしてください。ステップ4から植物組織を公判前ブレンダーカップに入れる。各PMSF及びアスコルビン酸ナトリウムを含む冷蔵抽出緩衝液をブレンダーカップに含む。ブレンダーカップをブレンダーに置き、パラフィルムのプレカットシートを取り、ブレンダーカップの上に伸ばします。葉の組織を抽出バッファーとブレンドして、80 を 22 区間で想像します。必要に応じてブレンドサイクルの間によくかき混ぜる必要があります。混合物は、葉材料の塊なしで均質に見えるはずです。ブレンドされた材料をビーカーに移します。攪拌バーで、タンパク質の溶解性を高め、固体の沈殿を可能にするために30分間摂氏4度をかき混ぜます。氷の上のきれいなビーカーの上に裸の布の2つの層を置き、大きな葉の破片を取り除くためにそれを通して抽出物を注ぎます。すべての抽出物をミラークロスに流し込んだ後、ミラークロスを折り畳んで残りの葉エキスを絞ります。抽出は、目に見える微粒子なしで濃い緑色に表示されるはずです。抽出物を遠心管に移します。16,000Gsで摂氏4度で20分間遠心分離します。これは、任意の残りの不溶性材料をペレットします。両方のチューブがバランスが取れていることを確認し、ローターの蓋がしっかりと締め付けられるようにします。遠心分離後、ペレットは、上清と言って、ペレットを捨てる、目に見える必要があります。50ミリリットルのシリンジとガラス繊維フィルターを使用して上清をフィルター処理します。サンプルを50マイクロリットル回収し、後で分析するために粗抽出物をラベル付けします。20ミリリットルのサンプルを保持するポリプロピレンカラムを設置します。ターゲット免疫グロブリンの種類と樹脂に対する親和性に応じて必要なスラリーの量を推定します。このデモでは、3ミリリットルのスラリーを使用します。一般に、1.5ミリリットルのベッド体積を有する総スラリーの3ミリリットルは、数ミリグラムの抗体の精製に有効である。キャップされたカラムに必要な量の再懸濁ススラリーを慎重にピペットします。列の下部から列の出口を開き、バッファーの大部分がなくなるまでドレインできるようにします。すぐに10ミリリットルの洗浄バッファーを1回PBS上に注ぎます。水気を切り、この洗浄ステップを2回繰り返します。ステップ 5 からフィルター処理されたサンプルを列に適用し、フロースルーを収集します。後で分析するためのフロースルーのアリコート50マイクロリットル。抗体が樹脂に結合しなかった場合に備えて、残りのフロースルーを保存します。樹脂を10ミリリットルのPBSで2回洗浄し、非特異的結合を低減します。所望ならば、アリコート50マイクロリットルの洗浄は、バッファーがカラムを通って流出し、標的抗体が洗浄緩衝液でほのめかされないことを確認する。洗浄バッファーが樹脂を通って実行されている間に、セットアップし、溶出バッファーを中和するためにpH 8で1モルトリスHCL、無菌の125マイクロリットルで5マイクロ遠心管を設定し、ラベルを付けます。あるいは、より濃縮された溶出物を得るために2つの臼歯のベースの30マイクロリットルを加える。溶出の間、UVライトは視覚化のために使用されるかもしれない。これは溶出の間行われる必要はない。UVを使用している場合は、目や皮膚への損傷を避けるために適切な個人用保護具を着用してください。UV ライトは溶出工程で使用する必要はありません。5ミリリットルの溶出バッファーをカラムに塗布し、1ミリリットル分の分を収集して、前のステップから各指定チューブに抗体を溶出させる。すぐに20ミリリットルを塗布し、続いて10ミリリットルの洗浄バッファーを適用することによってカラムを再生します。樹脂が酸性環境に長期間放置されていないことを確認します。溶出は蛍光を現すはずです。蛍光が最も高いのは第2溶出で見られるが、抽出から抽出まで変化する。貯蔵のために、20%エタノールおよびPBSの10ミリリットルで樹脂を洗浄し、途中で水切りさせます。上部を要約し、次にカラムの底部を要約し、4度C.280ナノメートルで吸光度を測定することによって、フォト分光計を使用して抗体濃度を決定します。溶出液をマイナス80°Cで保存し、各分画の50マイクロリットルを別々のチューブにアリコートして、さらなる分析を行います。一般的にタンパク質の持続時間は、効率の大幅な損失なしに10回まで再利用することができます。280ナノメートルでの吸光度を測定して分光光度計を使用して、特定の詳細については、メーカーのガイドラインを参照してください。溶出液をマイナス80°Cで保存し、各分画の50マイクロリットルを別々のチューブにアリコートして、さらなる分析を行います。Zsページによる精製タンパク質の分析は、標準プロトコルに従うことによって行うことができます。GFPを含む構築物のクローニング、浸潤および発現の成功を示す結果として蛍光を観察した。数日の間に、蛍光は4日目と5日目に高い蛍光とともに徐々に増加するはずです。タンパク質Gが使用される場合、カラムからの蛍光タンパク質結合およびそれに続く溶出は、安定なGFPとして含有するIgG融合の精製を示す。UV露出ゲルと、ラダーの25KDaと75KDaのバンドのみを見ることができます。また、非溶出2サンプルも見ることができる。非減少溶出は、その安定したGFP融合として無傷のIgGから期待される相対的なサイズとして、その蛍光を保持します。クマシー染色ゲルでは、還元されたサンプルと非還元サンプルの両方が可視化される。すべてのラダー成分が目に見え、天然タンパク質とIgG融合は、サンプルを通して総抽出物上清および流れで見ることができます。洗浄には少量のIgG融合が含まれています。溶出1および4は、ほとんどのタンパク質が一般的に第2および第3の溶出ステップから排除されるように、予想されるように、より少ない濃縮タンパク質を含んでいた。溶出2非還元は、全ての還元溶出サンプルに複数のバンドが存在することもわかる。75KDaは、GFPに重鎖ヒューズを示す。50KDaは単独で重鎖を示し、25KDaは軽鎖単独を示し、10KDAはプロテアーゼ阻害剤の添加によって防止できる劣化を示す可能性が高い。このプロトコルは、任意の所望の標的タンパク質に融合した任意の抗体の精製に使用することができる。このプロセスは、さまざまな量の葉材料に対応するように編集することができ、また、タンパク質抽出および精製プロセスの前、中、および終了後にタンパク質存在の視覚的決定を可能にする。これらの方法は、コントロールとして有用であり、技術を教えるための目的となり得る。

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

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ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

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We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...