Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Vi takker Maria Pia DiPalma for redigering av videoen. Vi takker også Office of Educational Outreach and Student Services ved Arizona State University for deres sjenerøse publikasjonsavgiftshjelp. Forskning for denne protokollen ble støttet av School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Dyrke N. benthamiana planter
<ol><li>Legg jord torvpellets på et brett og hell tidligere kokt, fortsatt varmt (~ 40-45 ° C), vann over torvpellets for full ekspansjon. Etter pellets er fullt utvidet, plasser 2-3 N. benthamiana frø på hver torv pellet ved hjelp av pinsett.</li>
	<li>Hell ca 0,5 i vann for å dekke bunnen av brettet. Merk skuffen med såingsdatoen. Fortsett å vanne plantene daglig med passende mengder gjødsel. Gjødsel (vannløselig all-purpose...

Denne protokollen kan benyttes for visuell verifisering av eventuelle rekombinante Ab eller rekombinant protein produsert i N. benthamiana planter, inkludert de som krever midlertidig eksponering for sure miljøer for kolonnerensing formål42,43,44. Videre kan fusjonen av asGFP til andre proteiner i forskjellige uttrykkssystemer være et nyttig verktøy for eksperimentell visualisering og utdanning. Protokollen heri kan...

Bransjerapporter tyder på at tretten av de tjue mest innbringende stoffene i USA var biologiske (proteinbaserte legemidler), hvorav ni var antistoffer. Per 2019 var det over 570 antistoff (Ab) terapeutiske midler i ulike kliniske utviklingsfaser1,2,3. Nåværende globale Ab salg overstiger 100 milliarder USD, og monoklonale Ab (mAb) terapeutiske markedet forventes å generere opp til 300 milliarder USD innen 20251,4. Med så høy etterspørsel og forventede økninger i inntektene, har forskere jobbet med å utvikle måter å produsere Ab-terapeutiske midler i en stadig større skala, med høyere kvalitet og lavere kostnader. Plantebaserte uttrykkssystemer har flere fordeler fremfor tradisjonelle pattedyrcellelinjer for rimelig og storskala produksjon av Ab therapeutics5,6. Produksjon av proteinterapeutiske midler i planter ("molekylær pharming") krever ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfasiliteter som tradisjonelle pattedyrcellekulturteknikker7,8. Planter kan ikke kontrakt menneskelige patogener, minimere potensiell forurensning9. Både forbigående og transgent plantebasert proteinuttrykk kan benyttes som rimeligere alternativer til pattedyr- eller bakterieproduksjonssystemer10. Selv om transgene planter foretrekkes for avlingsproduksjon, kan rekombinant proteinproduksjon ved hjelp av denne metoden kreve uker til måneder. Fremskritt i forbigående uttrykk ved hjelp av virale vektorer gjennom enten sprøyte eller vakuum agroinfiltrasjon tillater henholdsvis små- og storskala produksjon av ønsket protein i dag11,12,13,14. Produksjon av mAbs mot Ebola, Dengue og Zika, og mange andre rekombinante proteiner, har blitt produsert og renset raskt og effektivt ved hjelp av forbigående uttrykk i N. benthamiana planter 15,16,17,18,19. Disse omstendighetene gjør forbigående plantebasert uttrykk et attraktivt alternativ for å utvikle flere Ab-terapeutiske midler og metodene som er demonstrert i denne protokollen20.
Førstegenerasjons mAbs var av murinavledning, noe som resulterte i ikke-spesifikk immunogenitet når de brukes i humane studier21. Over tid, chimeric, humanisert, og til slutt, fullt menneskelig Abs ble produsert for å redusere immunogenisitet indusert av Ab terapeutiske. Dessverre forårsaker noen av disse Abs fortsatt vertsimmunogenitet på grunn av forskjeller i glykosylering21. Utviklingen i anleggsteknikk har tillatt for modifisering av Ab glycans, noe som er viktig siden en Ab stabilitet og funksjon kan betydelig påvirkes av sin glykosylering tilstand22. Fremskritt har tillatt produksjon i plantesystemer av høyt nivå uttrykk for humaniserte mAbs, som inneholder menneskelige glykomaner og resulterende de ønskede biologiske egenskapene til en masseprodusert menneskelig farmasøytisk19,21.
I tillegg til rekombinante Abs, ab fusjonmolekyler (Ab fusjoner) har blitt utforsket for ulike formål de siste tiårene. Ab fusjoner består ofte av en Ab eller Ab fragment smeltet til et molekyl eller protein og er utformet for å fremkalle svar fra immuneffektorceller23. Disse molekylene har blitt opprettet som potensielle terapeutiske inngrep for å behandle ulike patologier som kreft og autoimmunesykdommer 24,25,26,27. Rekombinante immunkomplekser (IC) er en annen klasse av Ab fusjoner som har blitt ansatt som vaksinekandidater28. RICs dra nytte av immunsystemet evne til å gjenkjenne Fc regioner av Ab fusjoner og har blitt funnet å forbedre immunogenisitet når kombinert med andre vaksine plattformer29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) er et bioluminescerende protein avledet fra manetene Aequorea Victoria, som avgir grønt lys når begeistret av ultrafiolettlys 32,33. Gjennom årene har GFP bruk som en visuell markør for genuttrykk utvidet fra uttrykk i Escherichia coli til mange protein uttrykkssystemer, inkludert N. benthamiana planter 34,35,36,37,38. Synlige markører, som GFP, har rikelig implikasjoner i undervisning og læring av vitenskapelige begreper. Tallrike entry-level studenter beskriver vanskeligheter med å forstå vitenskapelige begreper når ideen blir undervist er ikke synlig for det blotte øye, for eksempel begrepene molekylærbiologi og relaterte felt39. Visuelle markører, som GFP, kan dermed bidra til behandling av informasjon knyttet til de vitenskapelige prosessene og kan bidra til å redusere vanskelighetene studentene rapporterer i å lære mange vitenskapelige konsepter.
Selv om GFP ofte brukes som markør for å indikere gen og uttrykk in vivo, er det vanskelig å visualisere det i nedstrømsprosessene hvis du bruker sure forhold. Denne situasjonen er først og fremst fordi GFP ikke opprettholder sin struktur og resulterende fluorescens ved lav pH40. Midlertidige sure miljøer er ofte nødvendig i ulike renseprosesser, for eksempel protein G, protein A og protein L kromatografi, ofte benyttet for Ab rensing41,42,43,44. GFP mutanter har blitt brukt til å beholde fluorescens under sureforhold 45,46.
Her beskriver vi en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinante IgG-fusjonsproteiner i N. benthamiana-planter. Vi produserte tradisjonell GFP smeltet til N-endestasjonen til en humanisert IgG tung kjede, og skapte en GFP-IgG-fusjon. Samtidig utviklet vi fusjonen av en plantekodonoptimalisert sekvens for en syrestabil GFP (asGFP) til N-endestasjonen til en humanisert IgG-tung kjede, noe som skaper en asGFP-IgG-fusjon. Fordelene ved å produsere GFP-IgG inkluderer evnen til å visualisere tilstedeværelsen av et målprotein under uttrykket, mens asGFP-IgG gjør det mulig å se tilstedeværelsen av rekombinant protein i ikke bare uttrykks- og ekstraksjonstrinnene, men også i proteinets rensetrinn. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon, rensing og visualisering av en rekke GFP fusjonsproteiner produsert i N. benthamiana og renset ved hjelp av kromatografi teknikker som krever lav pH. Prosessen kan også skreddersys til ulike mengder bladmateriale. Mens Abs og fusjonsproteiner merket med GFP eller asGFP ikke er ment å brukes til terapi, kan disse metodene være nyttige som kontroller under eksperimenter og kan også videre benyttes som et undervisningsverktøy for molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både personlig og praktisk talt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

Høy etterspørsel etter antistoffer som terapeutiske intervensjoner for ulike smittsomme, metabolske, autoimmune, neoplastiske og andre sykdommer skaper et økende behov for å utvikle effektive metoder for rekombinant antistoffproduksjon. Per 2019 var det mer enn 70 FDA-godkjente monoklonale antistoffer, og det er eksponentielt vekstpotensial. Til tross for deres løfte, begrensende faktorer for utbredt bruk er produksjonskostnader og kompleksitet. Potensielt tilbyr planter rimelige, trygge og lett skalerbare proteinproduksjonsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana kan ikke bare riktig brette og montere komplekse pattedyrproteiner, men kan også legge til kritiske post-translasjonelle modifikasjoner som ligner på de som tilbys av pattedyrcellekulturer. I dette arbeidet, ved hjelp av innfødte GFP og en syre-stabil variant av grønt fluorescerende protein (GFP) smeltet til humane monoklonale antistoffer, var vi i stand til å visualisere hele forbigående antistoffuttrykk og rensingsprosess fra N. benthamiana planter. Avhengig av eksperimentets formål kan innfødt GFP-fusjon sikre enklere visualisering under uttrykksfasen i plantene, mens syrestabil GFP-fusjon gjør det mulig å visualisere under nedstrøms behandling. Denne skalerbare og enkle prosedyren kan utføres av en enkelt forsker for å produsere mg mengder svært rene antistoff- eller antistofffusjonsproteiner i løpet av få dager ved hjelp av bare noen få små planter. En slik teknikk kan utvides til visualisering av alle typer antistoffrensingsprosesser og potensielt mange andre proteiner, både i plante- og andre uttrykkssystemer. Videre kan disse teknikkene være til nytte for virtuelle instruksjoner og bli utført i et undervisningslaboratorium av lavere studenter som har minimal tidligere erfaring med molekylærbiologiteknikker, og gir grunnlag for prosjektbasert utforskning med virkelige applikasjoner.

Denne studien viser en enkel og rask metode for å produsere rekombinante proteiner og visualisere dem gjennom nedstrøms prosesser. Ved hjelp av N. benthamiana og etter den medfølgende protokollen, kan rekombinant proteinproduksjon beskrevet her oppnås på mindre enn en uke. Den generelle arbeidsflyten for planteuttrykk, ekstraksjon og rensing vises i figur 1. Stadier av plantevekst fra 2-ukers gamle frøplanter, 4-ukers gamle planter og 6-ukers gamle planter vises i <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Vi beskriver her en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinant human IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokollen kan utvides til rensing og visualisering av mange proteiner som benytter kolonnekromatografi. Videre er protokollen tilpasningsdyktig til personlig og virtuell høyskoleundervisningslaboratorium, som gir prosjektbasert utforskning.

Produksjon av IgG Fusion Proteiner Forbigående Uttrykt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Dette er en demonstrasjon av en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinant menneskelig IgG smeltet til GFP i tobakksrelaterte Nicotiana benthamiana planter. Denne protokollen kan benyttes for rensing og visualisering av planteproduserte antistoffer, antistofffusjoner og de fleste proteiner som kan renses gjennom kolonnekromatografi. Denne protokollen gjør det mulig for forskere og studenter ved universitetet arbeidslaboratorier å visualisere GFP-merkede proteiner på de fleste trinn i proteinproduksjonsprosessen.Plasser jord torvpellets på et brett og hell tidligere kokt, fortsatt varmt vann over torvpellets for full ekspansjon. Pellets vil ta noen minutter å utvide fullt ut. Etter at paller er fullstendig utvidet, plasser to til tre Nicotiana benthamiana frø på hver torvpellet ved hjelp av pinsett.Etter at dette er gjort, må du helle ca 0,5 inches av vann for å dekke bunnen av skuffen. Ikke glem å merke skuffen med såingsdatoen. Fortsett å vanne plantene daglig med passende mengder gjødsel.Brettet skal dekkes med en humidom topp og plasseres i et vekstkammer. Den seedede torvpelleten bør holdes i vekstkammeret ved 23 til 25 grader Celsius med en 16 timers fotoperiode og 60% relativ fuktighet. Etter en uke, fjern en ekstra plante fra pelleten forlater hver torv pall med bare en frøplante.Når plantene er to til tre uker gamle, overfør hver torvpellet til en individuell gryte som inneholder fuktighetsstyrt jord. Fortsett å vanne frøplanter daglig med ett gram per liter gjødsel, aldri la jorda være helt tørr. Planter er klare for infiltrasjon når de er fem til seks uker gamle.Følgende trinn må gjøres ved siden av en Bunsen brenner og grunnleggende aseptiske teknikker bør brukes for å unngå forurensning. Du trenger en Lb kanamycin plate. Ett mikrogram per milliliter kanamycinkonsentrasjon.med to mutasjoner EHA105 som huser ønsket kanamycinresistent konstruksjon og dyrkes over natten. EHA105 er en av de mest brukte stammene av Agrobacterium to mutasjoner. For å begynne kulturen, fyll konisk rør med 10 milliliter lb media, neste, ved 10 mikroliter på 100 mikrogram per milliliter kanamycin, kan du også legge til 10 mikroliter på 2,5 mikrogram per milliliter rifampicin for å forhindre e-coli-forurensning.Fra platen bruker du en enkelt isolert koloni verifisert av PCR for å vokse din nye kultur. Velg din isolerte koloni og inokuler den inn i lb. Plasser inokulasjonen på shakeren.inkuber ved 30 grader Celsius og 120 til 150 rpm over natten. Neste dag, hvis Agrobacterium kulturen trekkes til OD600 tilsvarende 0,6 til 0,9 den kan brukes til infiltrasjon. Hvis det er overgrodd OD600 over en til to milliliter bør overføres til en frisk lb med antibiotika og dyrkes til den nødvendige OD600.Når od600 er riktig, plasserer du kulturene i en sentrifuge, og sørger for at sentrifugen er balansert. Pelt bakteriene ved sentrifugering ved 4, 500G i 20 minutter ved romtemperatur. De kan ikke overnate fra begge prøvene.Deretter bruker du hver pellet og en X-infiltrasjonsbuffer for å bringe den endelige OD til 0,4. Kombiner like store volumer av hver IgG-fusjonskonstruksjon med lyskjedekonstruksjonen, for å få den endelige OD-en på 0,2 per konstruksjon i hvert rør. Ta en binders og en fem til seks uker gammel og benthamiana plante fra trinn en.Ved hjelp av binders skarpe kant utfoldet gjør en liten punktering i det første epidermale laget av bladet. Unngå å punktere bladet hele veien gjennom. Fyll en milliliter sprøyte uten en nål festet med den tilberedte Agrobacterium-løsningen fra trinn to.Dekk hullet som er laget i forrige trinn med enden av sprøyten. Og sakte presse for å injisere bakteriene inn i bladet mens du bruker mildt mottrykk fra bak bladet. Prøv å infiltrere det meste av bladet og poke bladet maksimalt tre til fire ganger, overflødig bladskade kan hindre proteinutbytte.Se bladet mørkere når oppløsningen injiseres uten å legge for mye press på sprøyten. Det infiltrerte plantebladet vil for det meste virke mørkt fra bunnen. Legg merke til at denne bakterielle løsningen skal være nok for minst tre til fire planter per konstruksjon.Autoklav eventuell gjenværende bakteriell oppløsning før kassering. Etter å ha fullført nål-mindre infiltrasjon, plasser planter tilbake i vekstkammeret og fortsett å vanne daglig. Observert bladene for klorose, nekrose samt for GFP fluorescens, vinter lang og kortbølge UV-lampe.Vanligvis blader på dag fire og fem viser den høyeste GFP fluorescens. Høst alle bladene på fire til fem dager etter infiltrasjon og veie den totale mengden bladmateriale. Du kan bruke bladmaterialet umiddelbart for nedstrøms behandling, eller du kan fryse det i negativ 80 grader Celsius til det er klart til bruk Plasser de infiltrerte plantene tilbake i vekstkammeret og fortsett å vanne daglig.observert bladene for klorose, nekrose, endringer i farge og bladvevdød i infiltrerte områder. Observerte planter for GFP fluorescens. Hvis GFP er til stede under en lang og kortbølge UV-lampe.Proteinuttrykket øker over tid, med den høyeste fluorescensen av begge GFP-konstruksjonene som vanligvis forekommer mellom dag fire og fem. Høst alle bladene på fire til fem dager etter infiltrasjon og veie det totale bladmaterialet. Bruk den umiddelbart for nedstrøms prosesser eller fryse ved negative 80 grader Celsius til klar til bruk.Under blandingsprosessen må du sørge for å holde buffere og blenderkopper på is eller ved fire grader Celsius før bruk. Plasser plantevev fra trinn fire inn i den pretriale blenderkoppen. Ved kjølt ekstraksjonsbuffer som inneholder henholdsvis PMSF og natriumaskorbatkonsentrasjoner til blenderkoppen.Plasser blenderkoppen på blenderen, ta et forhåndskuttet parafilmark og strekk den over toppen av blenderkoppen. Bland bladvevet med ekstraksjonsbuffer for å forestille seg 80 med 22. Du må røre godt mellom blandingssykluser etter behov.Blandingen skal virke homogen uten biter av bladmateriale. Overfør blandet materiale til et beger. På en røre bar og rør den i fire grader Celsius i 30 minutter for å forbedre protein løselighet og for å tillate nedbør av faste stoffer.Legg to lag med bar klut over et rent beger på is og hell ekstraktet gjennom det for å fjerne store bladrester. Etter at alt ekstraktet helles gjennom speilkluten, bretter du speilkluten for å klemme restbladekstraktet. Ekstraktet skal virke mørkegrønt uten synlige partikler.Overfør ekstraktet til sentrifugerør. Sentrifuger ekstraktet ved 16 000Gs i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dette vil pellet eventuelle gjenværende uoppløselige materiale.Kontroller at begge rørene er balansert og at rotorlokket er godt strammet. Etter sentrifugering skal pelleten være synlig, si supernatant og kast pelleten. Filtrer supernatanten ved hjelp av en 50 ml sprøyte og glassfiberfilter.Samle 50 mikroliter av en prøve og merke råolje ekstrakt for senere analyse. Sett opp en polypropylenkolonne som inneholder 20 milliliter prøve. Anslå mengden slurry som trengs avhengig av målet immunoglobulin type og dens affinitet til harpiks.I denne demonstrasjonen bruker vi tre milliliter slurry. Vanligvis tre milliliter av total slurry med 1,5 milliliter seng volum er effektiv for rensing av flere milligram antistoff. Pipette forsiktig den nødvendige mengden av resuspended slurry inn i den avgrensede kolonnen.Åpne kolonneuttaket fra bunnen av kolonnen og la den tømmes til det meste av bufferen er borte. Hell umiddelbart 10 milliliter vaskebuffer en gang PBS på toppen. La det renne og gjenta dette vasketrinnet to ganger.Bruk det filtrerte eksemplet fra trinn fem til kolonnen, og samle inn gjennomflyten. Aliquot 50 mikroliter av flow-through for senere analyse. Lagre resten av gjennomstrømningen i tilfelle antistoffet ikke binder seg til harpiksen.Vask harpiksen to ganger med 10 milliliter av en gang PBS for å redusere ikke-spesifikk binding. Hvis ønskelig, aliquot 50 mikroliter vask som bufferen drenerer gjennom kolonnen for å kontrollere at målet antistoffet ikke er hentydet med en vaskebuffer. Mens vaskebufferen går gjennom harpiksen, oppsettet og etiketten fem mikro sentrifuge rør med 125 mikroliter sterile, en molar tris-HCL på pH åtte for nøytralisering av elution buffer.Alternativt kan du legge til 30 mikroliter med to molartris base for å få mer konsentrert eluate. Under elution kan UV-lys brukes til visualisering. Dette trenger ikke å gjøres i løpet av elution.Hvis UV brukes, må du ha på deg egnet personlig verneutstyr for å unngå øye- og hudskader. Et UV-lys trenger ikke å brukes under elution trinn. Elute antistoffene ved å bruke fem milliliter elution buffer til kolonnen og samle en milliliter fraksjoner, til hvert utpekt rør fra forrige trinn.Generer kolonnen umiddelbart ved å bruke 20 milliliter etterfulgt av 10 milliliter vaskebuffer. Sørg for at harpiksen ikke er igjen i et surt miljø over lengre tid. Elution skal virke fluorescerende.Ofte er den høyeste fluorescens sett i den andre elution, men kan variere fra utvinning til utvinning. For lagring, vask harpiksen med 10 milliliter på 20% etanol og PBS og la avløp halvveis. Recap toppen, deretter bunnen av kolonnen og holde oppreist på fire grader C.Bestem antistoffkonsentrasjonen ved hjelp av et fotospektrometer ved å måle absorbans ved 280 nanometer.Oppbevar eluatene i negative 80 grader Celsius og aliquot 50 mikroliter av hver brøkdel til et eget rør for videre analyse. Vanligvis protein varigheter kan gjenbrukes opptil 10 ganger uten betydelig tap av effektivitet. Se produsentens retningslinjer for spesifikke detaljer bestemme antistoffkonsentrasjon, ved hjelp av et spektrofotometer ved å måle absorbans ved 280 nanometer.Oppbevar eluatene i minus 80 grader Celsius og aliquot 50 mikroliter av hver brøkdel i et eget rør for videre analyse. Analyse av renset protein av Zs-siden kan gjøres ved å følge standardprotokoller. Observert fluorescens som et resultat som indikerer suksess for kloning, infiltrasjon og uttrykk for en konstruksjon som inneholder GFP.I løpet av noen få dager bør fluorescerende gradvis øke med høy fluorescens på dag fire og fem. Når protein G brukes fluorescerende proteinbinding og påfølgende elitasjon fra kolonnen indikerer rensing av en IgG-fusjon som inneholder som en stabil GFP. Og UV eksponert gel, kan du se bare 25KDa og 75KDa band av stigen.Du kan også se, den ikke reduserte elution 2 prøven. Den ikke reduserte elution beholder sin fluorescens som den relative størrelsen man forventer fra en intakt IgG som sin stabile GFP fusjon. I coomassie flekken gel både redusert og ikke reduserte prøver visualiseres.Alle stigekomponenter er synlige, innfødte proteiner og IgG-fusjoner kan ses i det totale ekstraktet supernatant og strømme gjennom prøver. Vasken inneholder en liten mengde IgG-fusjon. Elution ett og fire inneholdt mindre konsentrert protein som forventet som det meste protein har generelt unnsluppet fra andre og tredje elution trinn.Elution 2 ikke-reduksjon kan også ses flere bånd finnes i alle redusere elution prøver. 75KDa indikerer en tung kjedesikring til GFP. 50KDa indikerer en tung kjede alene, 25KDa indikerer en lett kjede alene, og 10 KDA indikerer sannsynligvis nedbrytning som kan forebygges ved tilsetning av proteasehemmere.Denne protokollen kan brukes til rensing av ethvert antistoff smeltet til ethvert ønsket målprotein. Prosessen kan redigeres for å imøtekomme ulike mengder bladmateriale, og gir også mulighet for visuell bestemmelse av proteintilstedeværelse før, under og etter avslutningen av proteinutvinnings- og renseprosessene. Disse metodene kan være nyttige som kontroller og kan være formål med undervisningsteknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasjon og PVX Agroinfection i Potet og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging analysen i Nicotiana benthamiana blader for Transiently bestemme Protein-protein samhandling Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...