Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agradecemos a Maria Pia DiPalma pela edição do vídeo. Agradecemos também ao Escritório de Divulgação Educacional e Serviços Estudantis da Universidade Estadual do Arizona por sua generosa assistência à taxa de publicação. A pesquisa para este protocolo foi apoiada pela School of Life Sciences da Universidade Estadual do Arizona.

1. Cultivar plantas N. benthamiana 
<ol><li>Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda quente (~40-45 °C), água sobre as pelotas de turfa para expansão total. Depois que as pelotas forem totalmente expandidas, coloque 2-3 sementes de N. benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.</li>
	<li>Despeje cerca de 0,5 em água para cobrir o fundo da bandeja. Rotule a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as m...

Este protocolo pode ser utilizado para a verificação visual de qualquer ab recombinante ou proteína recombinante produzida em plantas N. benthamiana, incluindo aquelas que requerem exposição temporária a ambientes ácidos para fins de purificação decolunas 42,43,44. Além disso, a fusão do asGFP para outras proteínas em diferentes sistemas de expressão pode ser uma ferramenta útil para visualização experim...

Relatórios da indústria indicam que treze dos vinte medicamentos de maior bilheteria nos Estados Unidos eram biológicos (medicamentos à base de proteína), dos quais nove eram anticorpos. Em 2019, foram mais de 570 terapêuticas de anticorpos (Ab) em várias fases de desenvolvimento clínico1,2,3. As vendas globais globais da Ab excedem 100 bilhões de USD, e o mercado terapêutico monoclonal Ab (mAb) deve gerar até 300 bilhões de USD até 20251,4. Com uma demanda tão alta e aumentos projetados na receita, pesquisadores têm trabalhado para desenvolver maneiras de produzir a terapêutica Ab em uma escala cada vez maior, com maior qualidade e custos mais baixos. Os sistemas de expressão à base de plantas têm várias vantagens sobre as linhas tradicionais de células mamíferas para a fabricação acessível e em larga escala da terapêutica Ab5,6. A produção de terapêutica proteica em plantas ("pharming molecular") não requer bioreatores caros ou instalações de cultura celular, assim como as técnicas tradicionais de cultura celular de mamíferos7,8. As plantas não podem contrair patógenos humanos, minimizando a contaminação potencial9. Tanto a expressão proteica transitória quanto transgênica à base de plantas pode ser utilizada como alternativas de menor custo aos sistemas de produção de mamíferos ou bacterianos10. Embora as plantas transgênicas sejam preferidas para a produção de culturas, a produção de proteínas recombinantes usando este método pode exigir de semanas a meses. Os avanços na expressão transitória utilizando vetores virais através da seringa ou da agroinfiltração a vácuo permitem a produção em pequena e grande escala, respectivamente, da proteína desejada nos dias11,12,13,14. A produção de mAbs contra o Ebola, a Dengue e o Zika, e inúmeras outras proteínas recombinantes, foram produzidas e purificadas de forma rápida e eficiente utilizando expressão transitória nas plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Essas circunstâncias tornam a expressão transitória baseada em plantas uma opção atraente para o desenvolvimento de múltiplas terapêuticas Ab e os métodos demonstrados neste protocolo20.
Os mAbs de primeira geração eram de derivação de murina, o que resultou em imunogenicidade não específica quando utilizados em testes em humanos21. Com o tempo, quiméricos, humanizados e, eventualmente, abs totalmente humanos foram produzidos para diminuir a imunogenicidade induzida pela terapêutica ab. Infelizmente, alguns desses Abs ainda causam imunogenicidade hospedeira devido a diferenças na glicossylation21. A evolução da engenharia vegetal permitiu a modificação dos glicos ab, o que é essencial, uma vez que a estabilidade e a função de um Ab podem ser significativamente afetadas pelo seu estado de glicosylation22. Os avanços permitiram a produção em sistemas vegetais de expressão de alto nível de mAbs humanizados, contendo glicanos humanos e, consequentemente, os traços biológicos desejados de um farmacêutico humano produzido em massa19,21.
Além do Abs recombinante, as moléculas de fusão Ab (fusões Ab) têm sido exploradas para vários propósitos nas últimas décadas. As fusões abs geralmente consistem em um fragmento ab ou ab fundido a uma molécula ou proteína e são projetadas para obter respostas de células efeitos imunológicos23. Essas moléculas foram criadas como potenciais intervenções terapêuticas para tratar diversas patologias, como câncer e doenças autoimunes24,25,26,27. Os complexos imunológicos recombinantes (RICs) são outra classe de fusões Ab que têm sido empregadas como candidatos à vacina28. Os RICs aproveitam a capacidade do sistema imunológico de reconhecer regiões de fusões ab e têm sido encontrados para melhorar a imunogenicidade quando combinados com outras plataformas de vacinas29,30,31.
Proteína Fluorescente Verde (GFP) é uma proteína bioluminescente derivada da água-viva Aequorea Victoria, que emite luz verde quando excitada pela luz ultravioleta32,33. Ao longo dos anos, o uso do GFP como marcador visual da expressão genética expandiu-se da expressão em Escherichia coli para numerosos sistemas de expressão proteica, incluindo as plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Marcadores visíveis, como o GFP, têm implicações abundantes no ensino e aprendizagem de conceitos científicos. Inúmeros alunos de nível básico descrevem dificuldades para compreender conceitos científicos quando a ideia que está sendo ensinada não é visível a olho nu, como os conceitos de biologia molecular e campos relacionados39. Marcadores visuais, como o GFP, podem, assim, contribuir para o processamento de informações relacionadas aos processos científicos e podem ajudar a diminuir as dificuldades que os alunos relatam na aprendizagem de inúmeros conceitos científicos.
Embora o GFP seja frequentemente usado como marcador para indicar gene e expressão in vivo,é difícil visualizá-lo nos processos a jusante se usar condições ácidas. Esta circunstância é principalmente porque a GFP não mantém sua estrutura e fluorescência resultante a um pH40baixo . Ambientes ácidos temporários são frequentemente necessários em diversos processos de purificação, como proteína G, proteína A e cromatografia proteica L, muitas vezes utilizada para purificação de Ab41,42,43,44. Mutantes GFP têm sido usados para reter fluorescência sob condições ácidas45,46.
Aqui descrevemos um método simples de expressão, extração e purificação de proteínas de fusão IgG recombinantes em plantas N. benthamiana. Produzimos gfp tradicional fundido ao N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão GFP-IgG. Simultaneamente, desenvolvemos a fusão de uma sequência otimizada por don de plantas para um GFP ácido-estável (asGFP) para o N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão asGFP-IgG. As vantagens da produção de GFP-IgG incluem a capacidade de visualizar a presença de uma proteína alvo durante a expressão, enquanto asgFP-IgG permite ver a presença de proteína recombinante não apenas nas etapas de expressão e extração, mas também nas etapas de purificação da proteína. Este protocolo pode ser adaptado para a produção, purificação e visualização de uma gama de proteínas de fusão GFP produzidas em N. benthamiana e purificadas usando técnicas de cromatografia que requerem baixo pH. O processo também pode ser adaptado a várias quantidades de material de folha. Embora as proteínas abs e de fusão marcadas com GFP ou asGFP não sejam destinadas a ser usadas para terapias, esses métodos podem ser úteis como controles durante experimentos e também podem ser utilizados como uma ferramenta de ensino para biologia molecular e celular e biotecnologia, tanto presencialmente quanto virtualmente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

A alta demanda por anticorpos como intervenções terapêuticas para várias doenças infecciosas, metabólicas, autoimunes, neoplásicas e outras doenças cria uma necessidade crescente de desenvolver métodos eficientes para a produção de anticorpos recombinantes. Em 2019, havia mais de 70 anticorpos monoclonais aprovados pela FDA, e há um potencial de crescimento exponencial. Apesar de sua promessa, fatores limitantes para o uso generalizado são os custos de fabricação e a complexidade. Potencialmente, as plantas oferecem estratégias de fabricação de proteínas de baixo custo, seguras e facilmente escaláveis. Plantas como Nicotiana benthamiana não só podem dobrar e montar proteínas mamíferas complexas, mas também podem adicionar modificações pós-translacionais críticas semelhantes às oferecidas pelas culturas de células mamíferas. Neste trabalho, utilizando GFP nativo e uma variante ácido-estável de proteína fluorescente verde (GFP) fundida a anticorpos monoclonais humanos, pudemos visualizar todo o processo de expressão e purificação de anticorpos transitórios das plantas N. benthamiana. Dependendo do propósito do experimento, a fusão GFP nativa pode garantir uma visualização mais fácil durante a fase de expressão nas plantas, enquanto a fusão GFP ácido-estável permite a visualização durante o processamento a jusante. Este procedimento escalável e simples pode ser realizado por um único pesquisador para produzir quantidades miligramas de proteínas de fusão de anticorpos ou anticorpos altamente puros em questão de dias usando apenas algumas pequenas plantas. Tal técnica pode ser estendida à visualização de qualquer tipo de processo de purificação de anticorpos e potencialmente muitas outras proteínas, tanto em sistemas de vegetação quanto em outros sistemas de expressão. Além disso, essas técnicas podem beneficiar instruções virtuais e serem executadas em um laboratório de ensino por estudantes de graduação que possuem experiência mínima prévia com técnicas de biologia molecular, fornecendo uma base para a exploração baseada em projetos com aplicações reais.

Este estudo demonstra um método fácil e rápido para produzir proteínas recombinantes e visualizá-las em todos os processos a jusante. Usando N. benthamiana e seguindo o protocolo fornecido, a produção de proteína recombinante descrita aqui pode ser alcançada em menos de uma semana. O fluxo de trabalho global da expressão, extração e purificação da planta é mostrado na Figura 1. Os estágios de crescimento vegetal de mudas de 2 semanas, plantas de 4 semanas de idade e ...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Esta é uma demonstração de um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido à GFP em plantas nicotiana benthamiana relacionadas ao tabaco. Este protocolo pode ser utilizado para purificação e visualização de anticorpos produzidos por plantas, fusões de anticorpos e a maioria das proteínas que podem ser purificadas através da cromatografia da coluna. Este protocolo permite que pesquisadores e estudantes de laboratórios de trabalho universitário visualizem proteínas marcadas por GFP na maioria das etapas do processo de produção de proteínas.Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda água quente sobre as pelotas de turfa para expansão total. Pelotas levarão alguns minutos para se expandir totalmente. Depois que as paletes forem totalmente expandidas, coloque de duas a três sementes nicotiana benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.Depois que isso for feito, você precisará derramar cerca de 0,5 polegadas de água para cobrir o fundo da bandeja. Não se esqueça de rotular a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante.A bandeja deve ser coberta com um topo humidome e coloque em uma câmara de crescimento. A pelota de turfa semeada deve ser mantida na câmara de crescimento a 23 a 25 graus Celsius com um período de 16 horas de foto e 60% de umidade relativa. Após uma semana, remova uma planta extra da pelota deixando cada palete de turfa com apenas uma muda.Quando as plantas têm de duas a três semanas, transfira cada pelota de turfa para um pote individual contendo solo controlado pela umidade. Continue a regar mudas diariamente com um grama por litro de fertilizante, nunca deixe o solo completamente seco. As plantas estão prontas para infiltração quando tiverem de cinco a seis semanas.As etapas a seguir devem ser feitas ao lado de um queimador Bunsen e técnicas assépticas básicas devem ser aplicadas para evitar contaminação. Você vai precisar de uma placa de kanamicina lb. Um micrograma por concentração de kanamicina mililitro.rigoroso com duas mutações EHA105 abrigando sua construção resistente à kanamicina desejada e cultivada durante a noite. EHA105 é uma das cepas mais utilizadas do Agrobacterium duas mutações. Para começar a cultura, preencha o tubo cônico com 10 mililitros de mídia lb, em seguida, a 10 microliters de 100 microgramas por mililitro kanamycin, você também pode adicionar 10 microliters de 2,5 microgramas por mililitro de rifampicina para evitar a contaminação por e-coli.A partir da placa, você usará uma única colônia isolada verificada pela PCR para crescer sua nova cultura. Escolha sua colônia isolada e inocula-a na lb. Coloque a inoculação no agitador.incubar a 30 graus Celsius e 120 a 150 RPM durante a noite. No dia seguinte, se a cultura Agrobacterium for atraída para OD600 igualando 0,6 a 0,9, ela pode ser usada para infiltração. Se for overgrown OD600 acima de um a dois mililitros deve ser transferido para um lb fresco com antibióticos e cultivado para o OD600 necessário.Uma vez no OD600 apropriado coloque as culturas em uma centrífuga, certificando-se de que a centrífuga seja equilibrada. Pelt a bactéria por centrifugação a 4.500G por 20 minutos em temperatura ambiente. Eles não podem sobrená-los de ambas as amostras.Em seguida, resuspenda cada pelota e um buffer de infiltração X para trazer o OD final para 0,4. Combine volumes iguais de cada construção de fusão IgG com a construção da cadeia de luz, para obter o OD final de 0,2 por construção em cada tubo. Pegue um clipe de papel e uma planta de cinco a seis semanas de idade e benthamiana a partir do primeiro passo.Usando a borda afiada do clipe de papel desdobrada faça uma pequena punção na primeira camada epidérmica da folha. Evite perfurar a folha o tempo todo. Encha uma seringa mililitro sem uma agulha presa à solução agrobacterium preparada a partir do segundo passo.Cubra o orifício feito na etapa anterior com o fim da seringa. E empurre lentamente para injetar as bactérias na folha enquanto aplica pressão suave contra por trás da folha. Tente se infiltrar na maior parte da folha e cutucar a folha no máximo de três a quatro vezes, danos excessivos na folha podem dificultar o rendimento da proteína.Observe a folha escurecer à medida que a solução é injetada sem aplicar muita pressão sobre a seringa. A folha de plantas infiltrada aparecerá na maior parte escura da vista inferior. Observe que esta solução bacteriana deve ser suficiente para pelo menos três a quatro plantas por construção.Autoclave qualquer solução bacteriana restante antes de descartar. Tendo terminado a infiltração sem agulhas, coloque as plantas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente. Observou-se as folhas para clorose, necrose, bem como para fluorescência GFP, lâmpada UV de ondas longas e curtas de inverno.Geralmente sai nos dias quatro e cinco mostram a maior fluorescência de GFP. Colher todas as folhas em quatro a cinco dias após a infiltração e pesar a quantidade total de material da folha. Você pode usar o material da folha imediatamente para processamento a jusante, ou você pode congelá-lo em 80 graus Celsius negativo até que ele esteja pronto para usar Coloque as plantas infiltradas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente.observaram as folhas para clorose, necrose, alterações de cor e morte de tecido de folhas em áreas infiltradas. Plantas observadas para fluorescência GFP. Se o GFP estiver presente sob uma lâmpada UV de ondas longas e curtas.A expressão proteica aumenta ao longo do tempo, com a maior fluorescência de ambos os construtos de GFP geralmente ocorrendo entre os dias quatro e cinco. Colher todas as folhas em quatro a cinco dias após a infiltração e pesar o material total da folha. Use-o imediatamente para processos a jusante ou congele a 80 graus Celsius negativos até estar pronto para uso.Durante o processo de mistura, certifique-se de manter tampões e copos de liquidificador no gelo ou a quatro graus Celsius antes de usar. Coloque o tecido vegetal do passo quatro no copo do liquidificador pré-julgamento. No tampão de extração refrigerado contendo suas respectivas concentrações de pmsf e ascorbate de sódio para o copo do liquidificador.Coloque o copo do liquidificador no liquidificador, pegue uma folha pré-cortada de para filme e estique-a sobre a parte superior do copo do liquidificador. Misture o tecido da folha com o tampão de extração para imaginar 80 com 22º intervalos. Você terá que mexer bem entre os ciclos de mistura, conforme necessário.A mistura deve parecer homogênea sem pedaços de material de folha. Transfira material misturado para um béquer. Em uma barra de mexida e mexa por quatro graus Celsius por 30 minutos para aumentar a solubilidade da proteína e permitir a precipitação de sólidos.Coloque duas camadas de pano nu sobre um béquer limpo no gelo e despeje o extrato através dele para remover grandes detritos de folhas. Depois de todo o extrato ser derramado através do pano do espelho dobre o pano do espelho para espremer o extrato residual da folha. O extrato deve parecer verde escuro sem partículas visíveis.Transfira o extrato para tubos de centrífuga. Centrifugar o extrato a 16.000Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Isso vai pellet qualquer material insolúvel restante.Certifique-se de que ambos os tubos estão equilibrados e que a tampa do rotor esteja bem apertada. Após a centrifugação, a pelota deve ser visível, digamos, sobrenante e descartar a pelota. Filtre o supernatante usando uma seringa de 50 mililitros e filtro de fibra de vidro.Colete 50 microliters de uma amostra e rotule extrato bruto para análise posterior. Configure uma coluna de polipropileno que contém 20 mililitros de amostra. Estimar a quantidade de chorume necessária dependendo do tipo de imunoglobulina alvo e sua afinidade com a resina.Nesta demonstração, usamos três mililitros de chorume. Geralmente três mililitros de chorume total com 1,5 mililitros de volume de cama é eficiente para purificação de vários miligramas de anticorpos. Pipeta cuidadosamente a quantidade necessária de chorume resuspended na coluna tampada.Abra a saída da coluna a partir da parte inferior da coluna e deixe-a drenar até que a maior parte do buffer se vá. Despeje imediatamente 10 mililitros de tampão de lavagem uma vez PBS em cima. Deixe-o drenar e repita esta etapa de lavagem duas vezes.Aplique a amostra filtrada da etapa cinco até a coluna e colete o fluxo.. Alíquota 50 microliters de fluxo para análise posterior. Guarde o resto do fluxo caso o anticorpo não se ligue à resina.Lave a resina duas vezes com 10 mililitros de uma vez PBS para reduzir a ligação não específica. Se desejar, alíquota de 50 microliters de lavagem à medida que o buffer escorre pela coluna para verificar se o anticorpo alvo não está aludido com um tampão de lavagem. Enquanto o tampão de lavagem está passando pela resina, configure e rotule cinco tubos de micro centrífugas com 125 microliters de estéril, um molar tris-HCL no pH oito para neutralizar o tampão de elução.Alternativamente, adicione 30 microliters de duas bases molar tris para obter eluato mais concentrado. Durante a eluição, a luz UV pode ser usada para visualização. Isso não precisa ser feito durante a elução.Se você UV está sendo usado, certifique-se de usar equipamento de proteção individual adequado para evitar danos aos olhos e pele. Uma luz UV não precisa ser usada durante a etapa de eluição. Elute os anticorpos aplicando cinco mililitros de tampão de elução na coluna e coletar uma fração mililitro, para cada tubo designado da etapa anterior.Regenere imediatamente a coluna aplicando 20 mililitros seguidos por 10 mililitros de tampão de lavagem. Certifique-se de que a resina não é deixada em um ambiente ácido por um longo período de tempo. A elução deve parecer fluorescente.Muitas vezes a maior fluorescência é vista na segunda eluição, mas pode variar de extração para extração. Para armazenamento, lave a resina com 10 mililitros de 20% de etanol e PBS e deixe drenar no meio do caminho. Recapitule a parte superior, depois a parte inferior da coluna e mantenha-se ereto a quatro graus C.Determine a concentração de anticorpos usando um espectrômetro fotográfico medindo a absorvência em 280 nanômetros.Armazene os eluatos em 80 graus Celsius negativos e alíquotas de 50 microliters de cada fração a um tubo separado para análise posterior. Geralmente, as durações proteicas podem ser reutilizadas até 10 vezes sem perda significativa de eficiência. Consulte as diretrizes do fabricante para obter detalhes específicos que determinem a concentração de anticorpos, usando um espectotômetro medindo a absorvância em 280 nanômetros.Armazene os eluatos em menos 80 graus Celsius e alíquota de 50 microliters de cada fração em um tubo separado para análise posterior. A análise da proteína purificada pela página Zs pode ser feita seguindo protocolos padrão. Fluorescência observada como resultado indicando sucesso de clonagem, infiltração e expressão de uma construção contendo GFP.Ao longo de alguns dias, as fluorescentes devem aumentar progressivamente com alta fluorescência nos dias quatro e cinco. Quando a proteína G é usada ligação de proteína fluorescente e elução subsequente da coluna indica purificação de uma fusão IgG contendo como um GFP estável. E o gel exposto UV, você pode ver apenas as bandas 25KDa e 75KDa da escada.Você também pode ver, a amostra de elução não reduzida 2. A elução não reduzida mantém sua fluorescência como o tamanho relativo que se esperaria de um IgG intacto como sua fusão GFP estável. No gel de manchas de coomassie, amostras reduzidas e não reduzidas são visualizadas.Todos os componentes da escada são visíveis, proteínas nativas e fusões IgG podem ser vistas no extrato total sobrenante e fluem através de amostras. A lavagem contém uma pequena quantidade de fusão IgG. A elução de um e quatro continha proteína menos concentrada, como é esperado, pois a maioria das proteínas geralmente escapou do segundo e terceiro passos de elução.A elução 2 não redutor também pode ser vista em todas as amostras de elução redutoras. 75KDa indica um fusível de corrente pesada para GFP. 50KDa indica uma cadeia pesada sozinho, 25KDa indica uma cadeia leve sozinho, e 10 KDA provavelmente indica degradação que pode ser evitada pela adição de inibidores de protease.Este protocolo pode ser usado para purificação de qualquer anticorpo fundido a qualquer proteína alvo desejada. O processo pode ser editado para acomodar várias quantidades de material da folha, e também permite a determinação visual da presença proteica antes, durante e após a conclusão dos processos de extração e purificação de proteínas. Esses métodos podem ser úteis como controles e podem ser propósito para técnicas de ensino.

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