Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agradecemos a Maria Pia DiPalma por editar el vídeo. También agradecemos a la Oficina de Alcance Educativo y Servicios Estudiantiles de la Universidad Estatal de Arizona por su generosa asistencia de cuota de publicación. La investigación para este protocolo fue apoyada por la Escuela de Ciencias de la Vida de la Universidad Estatal de Arizona.

1. Cultivar plantas N. benthamiana 
<ol><li>Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, todavía caliente (40-45 oC), agua sobre los pellets de turba para una expansión completa. Después de que los pellets se expanden por completo, colocar 2-3 N. benthamiana semillas en cada pellet de turba utilizando pinzas.</li>
	<li>Vierta aproximadamente 0.5 en agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. Etiquete la bandeja con la fe...

Este protocolo se puede utilizar para la verificación visual de cualquier proteína recombinante Ab o recombinante producida en plantas N. benthamiana, incluidas aquellas que requieren exposición temporal a ambientes ácidos para fines de purificación decolumnas 42,43,44. Además, la fusión de asGFP a otras proteínas en diferentes sistemas de expresión puede ser una herramienta útil para la visualización y educa...

Los informes de la industria indican que trece de los veinte medicamentos más graves de los Estados Unidos eran biológicos (productos farmacéuticos a base de proteínas), de los cuales nueve eran anticuerpos. En 2019, había más de 570 terapias de anticuerpos (Ab) en varias fases de desarrollo clínico1,2,3. Las ventas globales actuales de Ab superan los 100 mil millones de dólares, y se espera que el mercado terapéutico monoclonal Ab (mAb) genere hasta 300 mil millones de USD para 20251,4. Con una demanda tan alta y aumentos proyectados de los ingresos, los investigadores han estado trabajando para desarrollar formas de producir terapias Ab a una escala cada vez mayor, con mayor calidad y menores costos. Los sistemas de expresión a base de plantas tienen varias ventajas sobre las líneas celulares tradicionales de mamíferos para la fabricación asequible y a gran escala de Ab therapeutics5,6. La producción de terapias proteicas en plantas ("pharming molecular") no requiere costosos biorreactores o instalaciones de cultivo celular como lo hacen las técnicas tradicionales de cultivo celular de mamíferos7,8. Las plantas no pueden contraer patógenos humanos, minimizando la contaminación potencial9. Tanto la expresión de proteínas de origen vegetal transitoria como la transgénica pueden utilizarse como alternativas de menor costo a los sistemas de producción de mamíferos o bacterias10. Aunque las plantas transgénicas son preferidas para la producción de cultivos, la producción de proteína recombinante utilizando este método puede requerir semanas o meses. Los avances en la expresión transitoria utilizando vectores virales a través de jeringa o agroinfiltración al vacío permiten la producción a pequeña y gran escala, respectivamente, de la proteína deseada en los días11,12,13,14. La producción de mAbs contra el ébola, el dengue y el zika, y muchas otras proteínas recombinantes, se han producido y purificado rápida y eficientemente utilizando la expresión transitoria en las plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Estas circunstancias hacen de la expresión transitoria a base de plantas una opción atractiva para el desarrollo de múltiples terapias Ab y los métodos demostrados en este protocolo20.
Los mAbs de primera generación eran de derivación murina, lo que dio lugar a una inmunogenicidad no específica cuando se utiliza en ensayos en humanos21. Con el tiempo, los Abs quiméricos, humanizados y, finalmente, totalmente humanos, se produjeron para disminuir la inmunogenicidad inducida por las terapias Ab. Desafortunadamente, algunos de estos Abdominales todavía causan inmunogenicidad del huésped debido a diferencias en la glicosilación21. Los desarrollos en la ingeniería de plantas han permitido la modificación de los glicanos Ab, lo que es esencial ya que la estabilidad y la función de un Ab pueden verse significativamente afectadas por su estado de glicosilación22. Los avances han permitido la producción en sistemas vegetales de expresión de alto nivel de mAbs humanizados, que contienen glicanos humanos y, como resultado, los rasgos biológicos deseados de un fármaco humano producido en masa19,21.
Además de Abs recombinante, las moléculas de fusión Ab (Ab fusiones) se han explorado para varios propósitos en las últimas décadas. Las fusiones Ab a menudo consisten en un fragmento de Ab o Ab fusionado con una molécula o proteína y están diseñadas para provocar respuestas de las células efectoras inmunitarias23. Estas moléculas han sido creadas como posibles intervenciones terapéuticas para tratar diversas patologías como el cáncer y las enfermedades autoinmunes24,25,26,27. Los complejos inmunes recombinantes (RC) son otra clase de fusiones Ab que se han empleado como candidatos a vacunas28. Los RC aprovechan la capacidad del sistema inmunitario para reconocer las regiones Fc de las fusiones Ab y se ha encontrado para mejorar la inmunogenicidad cuando se combina con otras plataformas de vacunas29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) es una proteína bioluminiscente derivada de la medusa Aequorea Victoria, que emite luz verde cuando se excita por la luz ultravioleta32,33. A lo largo de los años, el uso de GFP como marcador visual de expresión génica se ha expandido de la expresión en Escherichia coli a numerosos sistemas de expresión de proteínas, incluyendo plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Los marcadores visibles, como la GFP, tienen abundantes implicaciones en la enseñanza y el aprendizaje de conceptos científicos. Numerosos estudiantes de nivel básico describen dificultades para captar conceptos científicos cuando la idea que se enseña no es visible a simple vista, como los conceptos de biología molecular y campos relacionados39. Por lo tanto, los marcadores visuales, como la GFP, pueden contribuir al procesamiento de la información relacionada con los procesos científicos y podrían ayudar a reducir las dificultades que los estudiantes reportan para aprender numerosos conceptos científicos.
Aunque la GFP se utiliza a menudo como un marcador para indicar el gen y la expresión in vivo,es difícil visualizarlo en los procesos posteriores si se utilizan condiciones ácidas. Esta circunstancia se debe principalmente a que la GFP no mantiene su estructura y la fluorescencia resultante a un pH bajo40. Los ambientes ácidos temporales a menudo son necesarios en varios procesos de purificación, tales como proteína G, proteína A, y cromatografía de proteína L, a menudo utilizado para la purificación Ab41,42,43,44. Los mutantes GFP se han utilizado para retener la fluorescencia en condiciones ácidas45,46.
Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de proteínas de fusión IgG recombinantes en plantas N. benthamiana. Producimos GFP tradicional fusionado con el N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión GFP-IgG. Simultáneamente, desarrollamos la fusión de una secuencia optimizada para codón de planta para un GFP estable en ácido (asGFP) al N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión asGFP-IgG. Las ventajas de producir GFP-IgG incluyen la capacidad de visualizar la presencia de una proteína diana durante la expresión, mientras que asGFP-IgG permite ver la presencia de proteína recombinante no sólo en los pasos de expresión y extracción, sino también en los pasos de purificación de la proteína. Este protocolo se puede adaptar para la producción, purificación y visualización de una gama de proteínas de fusión GFP producidas en N. benthamiana y purificadas mediante técnicas de cromatografía que requieren un pH bajo. El proceso también se puede adaptar a varias cantidades de material de hoja. Si bien el abs y las proteínas de fusión etiquetadas con GFP o asGFP no están destinadas a ser utilizadas para terapias, estos métodos pueden ser útiles como controles durante los experimentos y también pueden utilizarse como una herramienta de enseñanza para la biología molecular y celular y la biotecnología, tanto en persona como virtualmente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

La alta demanda de anticuerpos como intervenciones terapéuticas para diversas enfermedades infecciosas, metabólicas, autoinmunes, neoplásicas y otras factores crea una creciente necesidad en el desarrollo de métodos eficientes para la producción de anticuerpos recombinantes. A partir de 2019, había más de 70 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, y hay un potencial de crecimiento exponencial. A pesar de su promesa, los factores limitantes para un uso generalizado son los costos de fabricación y la complejidad. Potencialmente, las plantas ofrecen estrategias de fabricación de proteínas de bajo costo, seguras y fácilmente escalables. Plantas como Nicotiana benthamiana no sólo pueden plegar y ensamblar correctamente proteínas complejas de mamíferos, sino que también pueden añadir modificaciones post-traduccionales críticas similares a las ofrecidas por los cultivos celulares de mamíferos. En este trabajo, mediante el uso de GFP nativa y una variante ácida estable de proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con anticuerpos monoclonales humanos, pudimos visualizar todo el proceso transitorio de expresión y purificación de anticuerpos de plantas N. benthamiana. Dependiendo del propósito del experimento, la fusión nativa de GFP puede garantizar una visualización más fácil durante la fase de expresión en las plantas, mientras que la fusión de PFN estable en ácido permite la visualización durante el procesamiento posterior. Este procedimiento escalable y directo puede ser realizado por un solo investigador para producir cantidades de miligramos de proteínas de fusión de anticuerpos o anticuerpos altamente puras en cuestión de días utilizando sólo unas pocas plantas pequeñas. Tal técnica puede extenderse a la visualización de cualquier tipo de proceso de purificación de anticuerpos y potencialmente muchas otras proteínas, tanto en plantas como en otros sistemas de expresión. Además, estas técnicas pueden beneficiar instrucciones virtuales y ser ejecutadas en un laboratorio de enseñanza por estudiantes de pregrado que poseen una experiencia previa mínima con técnicas de biología molecular, proporcionando una base para la exploración basada en proyectos con aplicaciones del mundo real.

Este estudio demuestra un método fácil y rápido para producir proteínas recombinantes y visualizarlas a través de procesos posteriores. Usando N. benthamiana y siguiendo el protocolo proporcionado, la producción de proteína recombinante descrita aquí se puede lograr en menos de una semana. El flujo de trabajo general de expresión, extracción y purificación de la planta se muestra en la Figura 1. Las etapas de crecimiento de la planta a partir de plántulas viejas de 2 sem...

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Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Esta es una demostración de un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con la GFP en plantas Nicotiana benthamiana relacionadas con el tabaco. Este protocolo se puede utilizar para la purificación y visualización de anticuerpos producidos por plantas, fusiones de anticuerpos y la mayoría de las proteínas que se pueden purificar a través de la cromatografía de columna. Este protocolo permite a investigadores y estudiantes de laboratorios de trabajo universitarios visualizar proteínas etiquetadas por GFP en la mayoría de los pasos del proceso de producción de proteínas.Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, agua todavía caliente sobre los pellets de turba para una expansión completa. Los pellets tardarán unos minutos en expandirse por completo. Después de que los palets se expandan por completo, coloque de dos a tres semillas de Nicotiana benthamiana en cada pellet de turba utilizando pinzas.Después de esto, tendrá que verter alrededor de 0,5 pulgadas de agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. No olvide etiquetar la bandeja con la fecha de siembra. Continúe regando las plántulas diariamente con cantidades apropiadas de fertilizante.La bandeja debe cubrirse con una tapa de humidomo y colocarla en una cámara de crecimiento. El pellet de turba de semillas debe mantenerse en la cámara de crecimiento de 23 a 25 grados Celsius con un período fotográfico de 16 horas y 60% de humedad relativa. Después de una semana, retire una planta extra del pellet dejando cada palé de turba con una sola plántula.Cuando las plantas tienen de dos a tres semanas de edad, transfiera cada pellet de turba a una maceta individual que contenga suelo controlado por humedad. Continúe regando las plántulas diariamente con un litro por litro de fertilizante, nunca deje el suelo completamente seco. Las plantas están listas para la infiltración cuando tienen cinco a seis semanas de edad.Los siguientes pasos deben realizarse junto a un quemador Bunsen y se deben aplicar técnicas asépticas básicas para evitar la contaminación. Necesitarás una placa de kanamicina Lb. Concentración de kanamicina de un microgramo por mililitro.estricto con dos mutaciones EHA105 que alberga su construcción resistente a la kanamicina deseada y se cultiva de la noche a la mañana. EHA105 es una de las cepas más utilizadas de Agrobacterium dos mutaciones. Para comenzar el cultivo, llenar el tubo cónico con 10 mililitros de medios de libra, a continuación, a 10 microlitros de 100 microgramos por mililitrormicina, también se pueden añadir 10 microlitros de 2,5 microgramos por mililitro de rifampicina para evitar la contaminación por e-coli.Desde la placa, utilizará una sola colonia aislada verificada por PCR para hacer crecer su nueva cultura. Elige tu colonia aislada e inocula en la libra. Coloque la inoculación en la coctelera.incubar a 30 grados centígrados y 120 a 150 RPM durante la noche. Al día siguiente, si la cultura Agrobacterium se atrae a OD600 igual a 0.6 a 0.9 se puede utilizar para la infiltración. Si está cubierto OD600 por encima de uno de uno a dos mililitros deben ser transferidos a una libra fresca con antibióticos y crecidos a la OD600 requerida.Una vez en el OD600 apropiado colocar las culturas en una centrífuga, asegurándose de que la centrífuga está equilibrada. Pelar las bacterias por centrifugación a 4, 500G durante 20 minutos a temperatura ambiente. No pueden superncarse de ambas muestras.A continuación, resuspender cada pellet y un búfer de infiltración X para llevar el OD final a 0.4. Combine volúmenes iguales de cada construcción de fusión IgG con la construcción de la cadena ligera, para obtener el OD final de 0,2 por construcción en cada tubo. Tome un clip de papel y una planta de cinco a seis semanas de edad y benthamiana del primer paso.Usando el borde afilado del clip de papel desplegado hacer una pequeña punción en la primera capa epidérmica de la hoja. Evite perforar la hoja hasta el final. Llene una jeringa de mililitro sin una aguja unida con la solución de Agrobacterium preparada del paso dos.Cubra el orificio realizado en el paso anterior con el extremo de la jeringa. Y empuje lentamente para inyectar las bacterias en la hoja mientras se aplica una suave contrapresión desde detrás de la hoja. Trate de infiltrarse en la mayor parte de la hoja y pinchar la hoja un máximo de tres a cuatro veces, el exceso de daño de la hoja puede obstaculizar el rendimiento proteico.Observe cómo la hoja se oscurece mientras se inyecta la solución sin aplicar demasiada presión sobre la jeringa. La hoja de la planta infiltrada aparecerá en su mayoría oscura desde la vista inferior. Tenga en cuenta que esta solución bacteriana debe ser suficiente para al menos tres a cuatro plantas por construcción.Autoclave cualquier solución bacteriana restante antes de desecharla. Después de haber terminado la infiltración sin aguja, coloque las plantas de nuevo en la cámara de crecimiento y continúe regando diariamente. Observó las hojas para la clorosis, necrosis, así como para la fluorescencia GFP, invierno largo y lámpara UV de onda corta.Por lo general, las hojas en los días cuatro y cinco muestran la fluorescencia GFP más alta. Cosecha todas las hojas a los cuatro a cinco días después de la infiltración y pesa la cantidad total de material de la hoja. Puede utilizar el material de la hoja inmediatamente para el procesamiento aguas abajo, o puede congelarlo en 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para usar Coloque las plantas infiltradas de nuevo en la cámara de crecimiento y continúe regando diariamente.observó las hojas de clorosis, necrosis, cambios en el color y la muerte del tejido de las hojas en áreas infiltradas. Plantas observadas para la fluorescencia de la GFP. Si GFP está presente bajo una lámpara UV de onda larga y corta.La expresión de proteínas aumenta con el tiempo, con la fluorescencia más alta de ambas construcciones de GFP que generalmente ocurren entre los días cuatro y cinco. Cosecha todas las hojas a los cuatro a cinco días después de la infiltración y pesa el material total de la hoja. Utilícelo inmediatamente para procesos posteriores o congele a 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para usar.Durante el proceso de mezcla, asegúrese de mantener los tampones y las tazas de la licuadora en hielo o a cuatro grados centígrados antes de usarlos. Coloque el tejido vegetal del paso cuatro en la taza de la licuadora previa al juicio. En el tampón de extracción refrigerado que contiene las respectivas concentraciones de PMSF y ascorbato sódico a la taza de la licuadora.Coloque la taza de la licuadora en la licuadora, tome una hoja precortado de para film y estírela sobre la parte superior de la taza de la licuadora. Mezcle el tejido de la hoja con el tampón de extracción para imaginar 80 con intervalos 22. Tendrás que agitar bien entre ciclos de mezcla según sea necesario.La mezcla debe parecer homogénea sin trozos de material de hoja. Transfiera material mezclado a un vaso de precipitados. En una barra de agitación y revuelva durante cuatro grados Centígrados durante 30 minutos para mejorar la solubilidad proteica y permitir la precipitación de sólidos.Coloque dos capas de tela desnuda sobre un vaso limpio sobre hielo y vierta el extracto a través de él para eliminar los restos de hojas grandes. Después de todo el extracto se vierte a través del paño del espejo doblar el paño del espejo para apretar el extracto de hoja residual. El extracto debe aparecer de color verde oscuro sin partículas visibles.Transfiera el extracto a tubos centrífugos. Centrifugar el extracto a 16.000G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Esto va a peletizar cualquier material insoluble restante.Asegúrese de que ambos tubos estén equilibrados y de que la tapa del rotor esté bien apretada. Después de la centrifugación, el pellet debe ser visible, decir sobrenadante y desechar el pellet. Filtrar el sobrenadante utilizando una jeringa de 50 mililitros y un filtro de fibra de vidrio.Recoger 50 microlitros de una muestra y etiquetar extracto crudo para su posterior análisis. Configure una columna de polipropileno que contiene 20 mililitros de muestra. Estimar la cantidad de lodos necesarios dependiendo del tipo de inmunoglobulina objetivo y su afinidad con la resina.En esta demostración, usamos tres mililitros de purines. Generalmente tres mililitros de lodo total con 1,5 mililitros de volumen de lecho es eficiente para la purificación de varios miligramos de anticuerpo. Pipetee cuidadosamente la cantidad necesaria de lodos resuspendidos en la columna tapada.Abra la salida de columna desde la parte inferior de la columna y permita que drene hasta que la mayor parte del búfer haya desaparecido. Verter inmediatamente 10 mililitros de tampón de lavado una vez PBS en la parte superior. Deje que drene y repita este paso de lavado dos veces.Aplique la muestra filtrada del paso cinco a la columna y recoja el flujo a través. Aliquot 50 microlitros de flujo a través para su posterior análisis. Guarde el resto del flujo a través en caso de que el anticuerpo no se uniera a la resina.Lave la resina dos veces con 10 mililitros de una vez PBS para reducir la unión no específica. Si se desea, aliquot 50 microlitros de lavado a medida que el tampón drena a través de la columna para verificar que el anticuerpo objetivo no se alude con un tampón de lavado. Mientras el tampón de lavado atraviesa la resina, configure y etiquete cinco tubos de micro centrífuga con 125 microlitros de estériles, un tris-HCL molar a pH ocho para neutralizar el tampón de elución.Alternativamente, agregue 30 microlitros de dos bases de tris molares para obtener un eluido más concentrado. Durante la elución, se puede utilizar luz UV para la visualización. Esto no necesita hacerse durante la duración de la elución.Si se está utilizando UV, asegúrese de usar un equipo de protección personal adecuado para evitar daños en los ojos y la piel. No es necesario utilizar una luz UV durante el paso de elución. Eluir los anticuerpos mediante la aplicación de cinco mililitros de tampón de elución a la columna y recoger fracciones de mililitro, a cada tubo designado del paso anterior.Regenere inmediatamente la columna aplicando 20 mililitros seguidos de 10 mililitros de tampón de lavado. Asegúrese de que la resina no se deja en un ambiente ácido durante un período prolongado de tiempo. La elución debe parecer fluorescente.A menudo se observa la fluorescencia más alta en la segunda elución, pero puede variar de la extracción a la extracción. Para el almacenamiento, lave la resina con 10 mililitros de 20% de etanol y PBS y deje drenar hasta la mitad. Recapitula la parte superior, luego la parte inferior de la columna y manténgase erguida a cuatro grados C.Determine la concentración de anticuerpos utilizando un espectrómetro de foto midiendo la absorbancia a 280 nanómetros.Almacene los eluidos en 80 grados Celsius negativos y aliquot 50 microlitros de cada fracción a un tubo separado para su posterior análisis. Generalmente, las duraciones proteicas se pueden reutilizar hasta 10 veces sin pérdida significativa de eficiencia. Consulte las directrices del fabricante para obtener detalles específicos para determinar la concentración de anticuerpos, utilizando un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nanómetros.Almacene los eluidos en menos 80 grados Celsius y aliquot 50 microlitros de cada fracción en un tubo separado para su posterior análisis. El análisis de la proteína purificada por la página Zs se puede hacer siguiendo los protocolos estándar. Fluorescencia observada como resultado que indica el éxito de la clonación, infiltración y expresión de una construcción que contiene GFP.En el transcurso de unos días, los fluorescentes deben aumentar progresivamente con alta fluorescencia en los días cuatro y cinco. Cuando se utiliza la proteína G, la unión a proteínas fluorescentes y la elución posterior de la columna indica la purificación de una fusión IgG que contiene como una GFP estable. Y el gel expuesto a los rayos UV, se pueden ver sólo las bandas 25KDa y 75KDa de la escalera.También se puede ver, la muestra de elución no reducida 2. La elución no reducida conserva su fluorescencia como el tamaño relativo que uno esperaría de un IgG intacto como su fusión GFP estable. En el gel de tinción coomassie se visualizan tanto las muestras reducidas como las no reducidas.Todos los componentes de la escalera son visibles, las proteínas nativas y las fusiones IgG se pueden ver en el sobrenadante total de extractos y fluyen a través de muestras. El lavado contiene una pequeña cantidad de fusión IgG. Elución uno y cuatro contenían proteína menos concentrada como se espera, ya que la mayoría de las proteínas generalmente ha eludido de la segunda y tercera medidas de elución.Elution 2 non reduce también se puede ver que existen múltiples bandas en todas las muestras de elución reductoras. 75KDa indica un fusible de cadena pesada a GFP. 50KDa indica una cadena pesada solo, 25KDa indica una cadena ligera sola, y 10 KDA probablemente indica degradación que se puede prevenir mediante la adición de inhibidores de la proteasa.Este protocolo se puede utilizar para la purificación de cualquier anticuerpo fusionado con cualquier proteína diana deseada. El proceso se puede editar para acomodar varias cantidades de material de hoja, y también permite la determinación visual de la presencia de proteínas antes, durante y después de la conclusión de los procesos de extracción y purificación de proteínas. Estos métodos pueden ser útiles como controles y pueden ser propósito para las técnicas de enseñanza.

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