Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Vi tackar Maria Pia DiPalma för att ha redigerat videon. Vi tackar också Office of Educational Outreach och Student Services vid Arizona State University för deras generösa offentliggörande avgift bistånd. Forskning för detta protokoll stöddes av School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Odla N. benthamiana växter
<ol><li>Placera jord torv pellets på en bricka och häll tidigare kokt, fortfarande varm (~ 40-45 °C), vatten över torv pellets för full expansion. Efter pellets är helt expanderade, placera 2-3 N. benthamiana frön på varje torv pellet med hjälp av pincett.</li>
	<li>Häll ca 0,5 i vatten för att täcka botten av facket. Märk brickan med sådatumet. Fortsätt att vattna plantorna dagligen med lämpliga mängder gödningsmedel. ...

Detta protokoll kan utnyttjas för visuell verifiering av alla rekombinanta Ab eller rekombinant protein som produceras i N. benthamiana växter, inklusive de som kräver tillfällig exponering för sura miljöer för kolonnrening ändamål42,43,44. Vidare kan sammansmältningen av asGFP till andra proteiner i olika uttryckssystem vara ett användbart verktyg för experimentell visualisering och utbildning. Protokollet ...

Branschrapporter visar att tretton av de tjugo mest högt inkomstbringande läkemedel i USA var biologiska läkemedel (proteinbaserade läkemedel), varav nio var antikroppar. Från och med 2019 fanns det över 570 antikropps -(Ab) therapeutics vid olika kliniskautvecklingsfaser 1,2,3. Nuvarande globala Ab försäljning överstiger 100 miljarder USD, och monoklonala Ab (mAb) terapeutiska marknaden förväntas generera upp till 300 miljarder USD 20251,4. Med så hög efterfrågan och beräknade ökningar av intäkterna, forskare har arbetat för att utveckla sätt att producera Ab therapeutics på en allt större skala, med högre kvalitet och lägre kostnader. Växtbaserade uttryckssystem har flera fördelar jämfört med traditionella däggdjurscelllinjer för prisvärd och storskalig tillverkning av Ab therapeutics5,6. Produktion av protein therapeutics i växter ("molekylär pharming") kräver inte dyra bioreaktorer eller cellodlingsanläggningar som gör traditionella tekniker för däggdjurscellodling7,8. Växter kan inte kontrakt mänskliga patogener, minimera potentiella kontaminering9. Både övergående och transgent växtbaserat proteinuttryck kan utnyttjas som billigare alternativ till system för produktion av däggdjur eller bakteriell produktion10. Även om transgena växter är att föredra för växtodling, kan rekombinant proteinproduktion med denna metod kräva veckor till månader. Framsteg i transienta uttryck med hjälp av virala vektorer genom antingen spruta eller vakuum agroinfiltration möjliggör små- och storskalig produktion, respektive, av det önskade proteinet idagar 11,12,13,14. Produktion av mAbs mot ebola, Dengue och, Zika, och många andra rekombinanta proteiner, har producerats och renats snabbt och effektivt med hjälp av övergående uttryck i N. benthamiana växter15,16,17,18,19. Dessa omständigheter gör övergående växtbaserat uttryck ett attraktivt alternativ för att utveckla flera Ab-therapeutics och de metoder som visas i detta protokoll20.
Första generationens mAbs var av murin härledning, vilket resulterade i icke-specifik immunogenicitet när den används i mänskliga försök21. Med tiden, chimeric, humaniserade, och så småningom, helt mänskliga Abs producerades för att minska immunogenicitet inducerad av Ab therapeutics. Tyvärr, några av dessa Abs orsakar fortfarande värd immunogenicitet på grund av skillnader i glycosylation21. Utvecklingen inom anläggningsbyggnad har möjlig gjort det möjligt för modifiering av Ab-glyknaner, vilket är väsentligt eftersom en Ab:s stabilitet och funktion avsevärt kan påverkas av dess glykosyleringstillstånd22. Framsteg har möjlig gjort produktion i växtsystem av hög nivå uttryck för humaniserade mAbs, som innehåller mänskliga glykaner och resultantly de önskade biologiska drag av en massproducerad humana läkemedel19,21.
Förutom rekombinanta Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) har undersökts för olika ändamål under de senaste decennierna. Ab fusioner består ofta av en Ab eller Ab fragment smält till en molekyl eller protein och är utformade för att framkalla svar från immun effektor celler23. Dessa molekyler har skapats som potentiella terapeutiska ingrepp för att behandla olika patologier som cancer och autoimmuna sjukdomar24,25,26,27. Rekombinanta immunkomplex (RI) är en annan klass av Ab-fusioner som har anställts som vaccinkandidater28. RIC dra nytta av immunsystemets förmåga att känna igen Fc regioner av Ab fusioner och har befunnits förbättra immunogenicitet när de kombineras med andra vaccin plattformar29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) är ett bioluminescerande protein som härrör från maneter Aequorea Victoria, som avger grönt ljus när upphetsad av ultraviolettljus 32,33. Under årens lopp har GFP: s användning som en visuell markör för genuttryck expanderat från uttryck i Escherichia coli till ett flertal proteinuttryck system, inklusive N. benthamiana växter34,35,36,37,38. Synliga markörer, såsom GFP, har rikliga konsekvenser i undervisningen och inlärningen av vetenskapliga begrepp. Många nybörjarstudenter beskriver svårigheter att förstå vetenskapliga begrepp när idén som lärs ut inte är synlig för blotta ögat, såsom begreppen molekylärbiologi och relaterade områden39. Visuella markörer, som GFP, kan alltså bidra till bearbetning av information som rör de vetenskapliga processerna och skulle kunna bidra till att minska de svårigheter som eleverna rapporterar att lära sig många vetenskapliga begrepp.
Även om GFP ofta används som en markör för att indikera gen och uttryck in vivo, är det svårt att visualisera det i nedströmsprocesserna om du använder sura förhållanden. Denna omständighet beror främst på att GFP inte upprätthåller sin struktur och resulterande fluorescens vid ett lågt pH40. Tillfälliga sura miljöer krävs ofta i olika reningsprocesser, såsom protein G, protein A, och protein L kromatografi, ofta utnyttjas för Ab rening41,42,43,44. GFP mutanter har använts för att behålla fluorescens under sura förhållanden45,46.
Häri beskriver vi en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta IgG fusion proteiner i N. benthamiana växter. Vi producerade traditionella GFP smält till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en GFP-IgG fusion. Samtidigt utvecklade vi fusionen av en växt kodonoptimerad sekvens för en syra-stabil GFP (asGFP) till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en asGFP-IgG fusion. Fördelarna med att producera GFP-IgG inkluderar möjligheten att visualisera förekomsten av ett målprotein under uttryck, medan asGFP-IgG tillåter att se förekomsten av rekombinant protein i inte bara uttrycket och extraktionsstegen utan också i reningsstegen av proteinet. Detta protokoll kan anpassas för produktion, rening, och visualisering av en rad GFP fusion proteiner som produceras i N. benthamiana och renas med hjälp av kromatografi tekniker som kräver lågt pH. Processen kan också skräddarsys för olika mängder bladmaterial. Medan Abs och fusion proteiner taggade med GFP eller asGFP inte är avsedda att användas för terapier, dessa metoder kan vara användbara som kontroller under experiment och kan också ytterligare utnyttjas som ett pedagogiskt verktyg för molekylär och cellbiologi och bioteknik, både i-person och praktiskt taget.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

Hög efterfrågan på antikroppar som terapeutiska ingrepp för olika infektiösa, metabola, autoimmuna, neoplastiska, och andra sjukdomar skapar ett växande behov av att utveckla effektiva metoder för rekombinant antikroppsproduktion. Från och med 2019 fanns det mer än 70 FDA-godkända monoklonala antikroppar, och det finns exponentiell tillväxtpotential. Trots deras löfte, begränsande faktorer för utbredd användning är tillverkningskostnader och komplexitet. Potentiellt, växter erbjuder billiga, säkra och lätt skalbara strategier proteintillverkning. Växter som Nicotiana benthamiana inte bara kan korrekt vika och montera komplexa däggdjurproteiner men också kan lägga till kritiska post-translationella ändringar liknande dem som erbjuds av däggdjurscellkulturer. I detta arbete, genom att använda inhemska GFP och en syra-stabil variant av gröna fluorescerande protein (GFP) smält till mänskliga monoklonala antikroppar, kunde vi visualisera hela övergående antikropp uttryck och rening process från N. benthamiana växter. Beroende på experimentets syfte kan inhemsk GFP-fusion säkerställa enklare visualisering under uttrycksfasen i växterna, medan syrastabil GFP-fusion möjliggör visualisering under nedströmsbearbetning. Denna skalbara och okomplicerade förfarande kan utföras av en enda forskare för att producera milligram mängder av mycket ren antikropp eller antikroppar fusion proteiner på några dagar med bara några små växter. En sådan teknik kan utvidgas till visualisering av någon typ av antikroppsreningsprocess och potentiellt många andra proteiner, både i växt- och andra uttryckssystem. Dessutom kan dessa tekniker gynna virtuella instruktioner och utföras i ett undervisningslaboratorium av studenter som har minimal tidigare erfarenhet av molekylärbiologiska tekniker, vilket ger en grund för projektbaserad utforskning med verkliga tillämpningar.

Denna studie visar en enkel och snabb metod för att producera rekombinanta proteiner och visualisera dem i hela nedströms processer. Med hjälp av N. benthamiana och efter det föreskrivna protokollet kan rekombinant proteinproduktion som beskrivs här uppnås på mindre än en vecka. Det övergripande arbetsflödet för växtuttryck, extraktion och rening visas i figur 1. Stadierna av växttillväxt från 2 veckor gamla plantor, 4 veckor gamla växter, och 6 veckor gamla växter ...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Vi beskriver här en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta mänskliga IgG smält till GFP i Nicotiana benthamiana. Detta protokoll kan utvidgas till rening och visualisering av ett flertal proteiner som utnyttjar kolumnkromatografi. Dessutom är protokollet anpassningsbart till det personrelaterade och virtuella collegeundervisningslaboratoriet, vilket ger projektbaserad utforskning.

Produktion av IgG Fusion Proteiner Övergående Uttryckt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Detta är en demonstration av en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta mänskliga IgG smält till GFP i tobak relaterade Nicotiana benthamiana växter. Detta protokoll kan utnyttjas för rening och visualisering av växt producerade antikroppar, antikropp fusioner, och de flesta proteiner som kan renas genom kolumnkromatografi. Detta protokoll tillåter forskare och studenter vid universitetets arbetslaboratorier att visualisera GFP taggade proteiner på de flesta steg av proteinproduktionsprocessen.Placera jord torv pellets på en bricka och häll tidigare kokt, fortfarande varmt vatten över torv pellets för full expansion. Pellets kommer att ta några minuter att expandera fullt ut. Efter pallar är helt expanderade, placera två till tre Nicotiana benthamiana frön på varje torv pellet med hjälp av pincett.När detta är gjort, måste du hälla ca 0,5 inches vatten för att täcka botten av facket. Glöm inte att märka facket med sådddatum. Fortsätt att vattna plantorna dagligen med lämpliga mängder gödningsmedel.Brickan ska täckas med en humidome topp och plats i en tillväxtkammare. Den seedade torvpelleten bör hållas i tillväxtkammaren vid 23 till 25 grader Celsius med en 16 timmars fotoperiod och 60%relativ luftfuktighet. Efter en vecka, ta bort en extra anläggning från pelleten lämnar varje torv pall med endast en planta.När växterna är två till tre veckor gamla, överför varje torvpellet till en individuell kruka som innehåller fuktkontrollerad jord. Fortsätt att vatten plantor dagligen med ett gram per liter gödselmedel, aldrig lämna jorden helt torr. Växter är redo för infiltration när de är fem till sex veckor gamla.Följande steg måste göras bredvid en Bunsen brännare och grundläggande aseptiska tekniker bör tillämpas för att undvika kontaminering. Du behöver en Lb kanamycin platta. Ett mikrogram per milliliter kanamycinkoncentration.strikt med en två mutationer EHA105 hyser din önskade kanamycin resistenta konstruera och odlas över natten. EHA105 är en av de vanligaste stammarna av Agrobacterium två mutationer. Till att börja kulturen, fyll koniska röret med 10 milliliter lb media, nästa, på 10 mikroliter av 100 mikrogram per milliliter kanamycin, du kan också lägga till 10 mikroliter av 2,5 mikrogram per milliliter rifampicin för att förhindra e-coli kontaminering.Från plattan kommer du att använda en enda isolerad koloni som verifierats av PCR för att få din nya kultur att växa. Välj din isolerade koloni och inokulera den i lb. Placera inokulering på skakren.inkubera vid 30 grader Celsius och 120 till 150 RPM över natten. Nästa dag, om Agrobacterium kulturen dras till OD600 lika 0,6 till 0,9 det kan användas för infiltration. Om det är övervuxna OD600 ovan en till två milliliter bör överföras till en färsk lb med antibiotika och odlas till den nödvändiga OD600.En gång på anslår OD600 förlägger kulturerna i en centrifug och att se till att centrifugen är allbalanserad. Skinn bakterierna genom centrifugeringen vid 4, 500G i 20 minuter vid rumstemperatur. De kan inte supernate från båda proverna.Sedan resuspend varje pellet och en X infiltration buffert för att få den slutliga OD till 0,4. Kombinera lika stora volymer av varje IgG fusion konstruera med ljuset kedjan konstruera, för att få den slutliga OD på 0,2 per konstruktion i varje rör. Ta ett gem och en fem till sex veckor gammal och benthamiana växt från steg ett.Använda gemens skarpa kant ovikta göra en liten punktering i den första epidermala lagret av bladet. Undvik att punktera bladet hela vägen igenom. Fyll en milliliterspruta utan en nål fäst med den beredda Agrobacterium-lösningen från steg två.Täck hålet som gjorts i föregående steg med änden av sprutan. Och långsamt tryck för att injicera bakterierna i bladet samtidigt som den applicerar ett försiktigt mottryck från bakom bladet. Försök att infiltrera det mesta av bladet och peta bladet högst tre till fyra gånger, överskott bladskador kan hindra protein avkastning.Se när lövet mörknar när lösningen injiceras utan att för mycket tryck appliceras på sprutan. Den infiltrerade växtblad kommer att visas mestadels mörkt från botten vyn. Observera att denna bakterielösning bör räcka till minst tre till fyra växter per konstruktion.Autoklavera eventuell kvarvarande bakterielösning innan du kasserar. Efter att ha avslutat nål-mindre infiltration, placera växter tillbaka i tillväxtkammaren och fortsätta att vatten dagligen. Observerade bladen för kloros, nekros samt för GFP fluorescens, vinterlång och kortvåg UV-lampa.Vanligtvis lämnar på dag fyra och fem visar den högsta GFP fluorescens. Skörda alla bladen vid fyra till fem dagar efter infiltration och väga den totala mängden bladmaterial. Du kan använda bladmaterialet omedelbart för nedströms bearbetning, eller så kan du frysa det i negativt 80 grader Celsius tills den är klar att använda Placera de infiltrerade växterna tillbaka i tillväxtkammaren och fortsätta att vattna dagligen.observerade bladen för kloros, nekros, förändringar i färg och lövvävnadsdöd i infiltrerade områden. Observerade växter för GFP fluorescens. Om GFP är närvarande under en lång och kort våg UV-lampa.Proteinuttryck ökar med tiden, med den högsta fluorescensen av båda GFP-konstruktioner som i allmänhet förekommer mellan dag fyra och fem. Skörda alla blad vid fyra till fem dagar efter infiltration och väga det totala bladmaterialet. Använd den omedelbart för nedströms processer eller frysa vid negativa 80 grader Celsius tills klar att använda.Under blandningsprocessen, se till att hålla buffertar och mixerkoppar på is eller vid fyra grader Celsius före användning. Placera växtvävnad från steg fyra i förundersökningsmixerkoppen. Vid kyld extraktionsbuffert innehållande respektive PMSF och natriumaskorbatkoncentrationer till mixerkoppen.Placera mixerkoppen på mixern, ta ett färdigklippt ark parafilm och sträck den över mixerkoppens topp. Blanda bladvävnaden med extraktionsbuffert för att föreställa sig 80 med 22:a intervall. Du måste röra väl mellan blandning cykler som behövs.Blandningen ska visas homogen utan bitar av bladmaterial. Överför blandat material till en bägare. Vid en rör bar och rör om i fyra grader Celsius i 30 minuter för att förbättra proteinlöslighet och för att tillåta utfällning av fasta ämnen.Placera två lager av bar duk över en ren bägare på is och häll extraktet genom den för att ta bort stora blad skräp. Efter allt extrakt hälls genom spegeln trasa vik spegelduken att pressa restblad extrakt. Extraktet ska verka mörkgrönt utan synliga partiklar.Överför extraktet till centrifugrör. Centrifugera extraktet vid 16, 000Gs i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Detta kommer pellet alla återstående olösligt material.Se till att båda rören är balanserade och att rotorlocket är ordentligt åtdraget. Efter centrifugeringen ska pelleten vara synlig, säg supernatant och kassera pelleten. Filtrera supernatanten med hjälp av en 50 milliliter spruta och glasfiberfilter.Samla 50 mikroliter av ett prov och märka råextrakt för senare analys. Ställ in en polypropylenkolumn som rymmer 20 milliliter prov. Uppskatta mängden flytgödsel som behövs beroende på målimglobulintyp och dess affinitet till hartset.I den här demonstrationen använder vi tre milliliter flytgödsel. Generellt tre milliliter av total slurry med 1,5 milliliter säng volym är effektiv för rening av flera milligram av antikropp. Försiktigt pipettera den erforderliga mängden återsuspendd slurry i den utjämnade kolumnen.Öppna kolonnutloppet från botten av kolonnen och låt den rinna av tills det mesta av bufferten är borta. Häll omedelbart 10 milliliter tvättbuffert en gång PBS ovanpå. Låt det rinna av och upprepa detta tvättsteg två gånger.Använd det filtrerade provet från steg fem till kolumnen och samla in flödet-through. Aliquot 50 mikroliter av flow-through för senare analys. Spara resten av genomflödet i fall antikroppen inte binda in i hartset.Tvätta hartset två gånger med 10 milliliter på en gång PBS för att minska icke-specifik bindning. Om så önskas, alikvot 50 mikroliter av tvätt som bufferten rinner genom kolonnen för att kontrollera att målet antikroppen inte anspelas med en tvätt buffert. Medan tvättbufferten löper genom hartset, setup och etikett fem mikro centrifugrör med 125 mikroliter av sterila, en molar tris-HCL vid pH åtta för neutralisering av eluering buffert.Alternativt, tillsätt 30 mikroliter av två molar tris bas för att få mer koncentrerad eluat. Vid eluering får UV-ljus användas för visualisering. Detta behöver inte göras under den tid som elueringen pågår.Om du UV används, se till att bära lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika skador på ögon och hud. En UV-belysning behöver inte användas under eulutionssteget. Elute antikropparna genom att applicera fem milliliter elueringsbuffert på kolonnen och samla en milliliterfraktioner, på varje anvisat rör från föregående steg.Omedelbart regenerera kolonnen genom att applicera 20 milliliter följt av 10 milliliter tvättbuffert. Se till att hartset inte lämnas i en sur miljö under längre tid. Eluering bör verka fluorescerande.Ofta ses den högsta fluorescensen i den andra elueringen, men kan variera från extraktion till extraktion. För förvaring, tvätta hartset med 10 milliliter av 20%etanol och PBS och låt avlopp halvvägs. Recap toppen, sedan botten av kolumnen och hålla upprätt vid fyra grader C.Bestäm antikroppskoncentrationen med hjälp av en fotospektrometer genom att mäta absorbans vid 280 nanometer.Förvara eluaterna i negativt 80 grader Celsius och alikvot 50 mikroliter av varje fraktion till ett separat rör för vidare analys. Generellt protein varaktigheter kan återanvändas upp till 10 gånger utan betydande förlust av effektivitet. Se tillverkarens riktlinjer för specifika detaljer bestämma antikroppskoncentration, med hjälp av en spektrofotometer genom att mäta absorbans vid 280 nanometer.Förvara eluaterna i minus 80 grader Celsius och alikvot 50 mikroliter av varje fraktion i ett separat rör för vidare analys. Analys av renat protein genom Zs sida kan göras genom att följa standardprotokoll. Observerade fluorescens som ett resultat som indikerar framgång kloning, infiltration och uttryck för en konstruktion som innehåller GFP.Under loppet av några dagar, fluorescerande bör successivt öka med hög fluorescens på dag fyra och fem. När protein G används fluorescerande proteinbindning och efterföljande eluering från kolonnen indikerar rening av en IgG fusion som innehåller som en stabil GFP. Och den UV-exponerade gelen, du kan se bara 25KDa och 75KDa banden av stegen.Du kan också se, den icke reducerade eluering 2 prov. Den icke reducerade eluering behåller sin fluorescens som den relativa storleken man kan förvänta sig av en intakt IgG som sin stabila GFP fusion. I coomassie fläck gel både reducerade och icke reducerade prover visualiseras.Alla stege komponenter är synliga, inhemska proteiner och IgG fusioner kan ses i den totala extrakt supernatant och flöde genom prover. Tvätten innehåller en liten mängd IgG fusion. Elution ett och fyra innehöll mindre koncentrerat protein som förväntas eftersom de flesta protein i allmänhet har undgått från andra och tredje elueringsstegen.Elution 2 icke minska kan också ses flera band finns i alla minska elution prover. 75KDa indikerar en kraftig kedjesäkring till GFP. 50KDa indikerar en tung kedja ensam, 25KDa indikerar en ljuskedja ensam, och 10 KDA indikerar sannolikt nedbrytning som kan förhindras genom tillsats av proteashämmare.Detta protokoll kan användas för rening av någon antikropp smält till någon önskad målprotein. Processen kan redigeras för att rymma olika mängder bladmaterial, och möjliggör också visuell bestämning av protein närvaro före, under, och efter ingåendet av proteinet extraktion och rening processer. Dessa metoder kan vara användbara som kontroller och kan vara syfte för undervisningsteknik.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrering och PVX-agroinfektion i Potatis och Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferas komplettering Imaging test i Nicotiana benthamiana blad för övergående bestämma Protein-protein interaktioner Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...