Name: production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Biz video düzenleme için Maria Pia DiPalma teşekkür ederiz. Ayrıca Arizona State Üniversitesi Eğitim Sosyal Yardım ve Öğrenci Hizmetleri Ofisi onların cömert yayın ücreti yardım için teşekkür ederiz. Bu protokol için yapılan araştırmalar Arizona Eyalet Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

1. N. benthamiana bitkileri yetiştirmek
<ol><li>Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve daha önce haşlanmış dökün, hala sıcak (~ 40-45 °C), tam genişleme için turba pelet üzerinde su. Peletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde 2-3 N. benthamiana tohumları yerleştirin.</li>
	<li>Tepsinin altını kaplayacak şekilde yaklaşık 0,5 su dökün. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketleyin. Fideleri her gün uy...

Bu protokol, sütun arıtma amaçlı asidik ortamlara geçici maruz kalma gerektirenler de dahil olmak üzere, N. benthamiana tesislerinde üretilen herhangi bir rekombinant Ab veya rekombinant proteinin görsel doğrulaması için kullanılabilir42,43,44. Ayrıca, farklı ifade sistemlerinde diğer proteinler için ASGFP füzyon deneysel görselleştirme ve eğitim için yararlı bir araç olabilir. Buradaki protokol, ...

Endüstri raporları, Amerika Birleşik Devletleri'nde en çok hasılat yapan yirmi ilaçtan 13'ünün biyolojik (protein bazlı ilaçlar) olduğunu ve bunların dokuzunun antikor olduğunu göstermektedir. 2019 yılı itibariyle, çeşitli klinik gelişimevrelerinde570'in üzerinde antikor (Ab) terapötik1,2,3idi. Mevcut küresel Ab satışları 100 milyar USD aşan ve monoklonal Ab (mAb) terapötik pazar 20251,4tarafından 300 milyar USD kadar üretmek bekleniyor. Bu kadar yüksek talep ve beklenen gelir artışları ile, araştırmacılar daha yüksek kalite ve daha düşük maliyetler ile, her zamankinden daha büyük bir ölçekte Ab terapötik üretmek için yollar geliştirmek için çalışıyoruz. Bitki tabanlı ifade sistemleri Ab terapötik uygun fiyatlı ve büyük ölçekli üretim için geleneksel memeli hücre hatları üzerinde çeşitli avantajları var5,6. Bitkilerde protein terapötik üretimi ("moleküler pharming") pahalı biyoreaktörler veya hücre kültürü tesisleri geleneksel memeli hücre kültürü teknikleri7,8gibi gerektirmez. Bitkiler insan patojenlerine byüklenici olamaz, potansiyel kontaminasyonu en aza indirir9. Hem geçici hem de transgenik bitki bazlı protein ekspresyonu memeli veya bakteri üretim sistemlerine daha düşük maliyetli alternatifler olarak kullanılabilir10. Mahsul üretimi için transgenik bitkiler tercih edilebilse de, bu yöntemi kullanarak rekombinant protein üretimi haftalar ile aylar arasında sürebilir. Şırınga veya vakum agroinfiltrasyon yoluyla viral vektörler kullanarak geçici ifade gelişmeler, sırasıyla, gün11, 12,13,14istenilen proteinin küçük ve büyük ölçekli üretim için izin verir. Ebola, Dang ve Zika'ya karşı mAbs üretimi ve çok sayıda diğer rekombinant proteinler, hızlı ve verimli N. benthamiana bitkiler15geçici ifade kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmış 15,16,17,18,19. Bu koşullar geçici bitki tabanlı ifade birden fazla Ab terapötik ve bu protokol20gösterilen yöntemler geliştirmek için cazip bir seçenek olun.
Birinci nesil mAb'ler murine türevidir, bu da insan deneylerinde kullanıldığında spesifik olmayan immünjenite ile sonuçlanır21. Zamanla, şeymerik, insancıl, ve sonunda, tamamen insan Abs Ab terapötik tarafından indüklenen immünjenite yi tirmek için üretildi. Ne yazık ki, bu Abs bazıları hala glikozilasyon farklılıkları nedeniyle konak immünojenite neden21. Tesis mühendisliğindeki gelişmeler Ab glikanlarının modifikasyonuna olanak sağlamıştır, bu da ab'nin stabilitesi ve fonksiyonu glikozilasyon durumundan önemli ölçüde etkilenebileceğinden gereklidir22. Gelişmeler insanca mAbs üst düzey ifade bitki sistemlerinde üretim izin verdi, insan glikaniçeren ve sonuçta bir kitle üretilen insan ilaç istenilen biyolojik özellikleri19,21.
Rekombinant Abs ek olarak, Ab füzyon molekülleri (Ab füzyon) son yıllarda çeşitli amaçlar için araştırılmıştır. Ab füzyonları genellikle bir molekül veya proteine kaynaşmış bir Ab veya Ab parçasından oluşur ve bağışıklık efektörü hücrelerinden yanıt almak için tasarlanmıştır23. Bu moleküller kanser ve otoimmün hastalıklar24,25,26,27gibi çeşitli patolojiler tedavi etmek için potansiyel terapötik müdahaleler olarak oluşturulmuştur. Rekombinant bağışıklık kompleksleri (RİCs) aşı adayları28olarak istihdam edilmiştir Ab füzyon başka bir sınıftır. RiCs ab füzyon Fc bölgeleri tanımak için bağışıklık sisteminin yeteneğini yararlanmak ve diğer aşı platformları ile kombine edildiğinde immünojenite geliştirmek için bulunmuştur29,30,31.
Yeşil Floresan Protein (GFP) denizanası Aequorea Victoria elde edilen bir biyolüminesans protein, hangi ultraviyole ışık tarafından heyecanlı yeşil ışık yayan32,33. Yıllar içinde, gen ekspresyonu görsel bir belirteç olarak GFP kullanımı Escherichia coli ifade den çok sayıda protein ekspresyonu sistemleri, N. benthamiana bitkiler34dahil olmak üzere genişletilmiş,35,36,37,38. GFP gibi görünür işaretlerin bilimsel kavramların öğretive öğreniminde çok sayıda etkisi vardır. Çok sayıda giriş seviyesi öğrencisi, öğretilen fikrin çıplak gözle görülemediğinde, moleküler biyoloji ve ilgili alanlar gibi bilimsel kavramları kavramanın zorluklarınıanlatırlar 39. GFP gibi görsel belirteçler, böylece bilimsel süreçlerle ilgili bilgilerin işlenmesine katkıda bulunabilir ve öğrencilerin çok sayıda bilimsel kavramı öğrenmede rapor etme deki zorlukları nazına yardımcı olabilir.
GFP genellikle in vivogen ve ekspresyonu belirtmek için bir belirteç olarak kullanılmasına rağmen, asidik koşullar kullanıyorsanız downstream süreçlerinde görselleştirmek zordur. GFP düşük pH40yapısını ve ortaya çıkan floresan korumak değil çünkü bu durum öncelikle. Geçici asidik ortamlar genellikle protein G, protein A ve protein L kromatografisi gibi çeşitli arıtma süreçlerinde gereklidir, genellikle Ab arıtma için kullanılan41,42,43,44. GFP mutantları asidik koşullar altında floresan korumak için kullanılmıştır45,46.
Burada n. benthamiana bitkilerinde rekombinant IgG füzyon proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit bir yöntem açıklıyoruz. İnsanlaştırılmış bir IgG ağır zincirinin N-terminusuna kaynaşmış geleneksel GFP ürettik ve gfp-igg füzyonu yarattık. Aynı anda, insanlaşmış bir IgG ağır zincirinin N-terminus'una asit-kararlı GFP (asGFP) için bitki kodonu optimize edilmiş bir dizinin füzyonu geliştirdik ve bir asGFP-IgG füzyonu oluşturduk. GFP-IgG üretmenin avantajları arasında ifade sırasında hedef proteinin varlığını görselleştirme yeteneği yer alırken, asGFP-IgG sadece ifade ve ekstraksiyon adımlarında değil, aynı zamanda proteinin saflaştırma adımlarında rekombinant proteinin varlığını da görmenizi sağlar. Bu protokol, N. benthamiana'da üretilen ve düşük pH gerektiren kromatografi teknikleri kullanılarak saflaştırılan bir dizi GFP füzyon proteininin üretimi, saflaştırılması ve görselleştirilmesi için uyarlanabilir. Süreç aynı zamanda yaprak malzeme çeşitli miktarlarda uyarlanmış olabilir. GFP veya asGFP ile etiketlenmiş Abs ve füzyon proteinleri tedaviler için kullanılmak üzere tasarlanmasa da, bu yöntemler deneyler sırasında kontrol olarak yararlı olabilir ve aynı zamanda moleküler ve hücresel biyoloji ve biyoteknoloji için hem bizzat hem de sanal olarak bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:646px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">50 mL syringe</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Agar</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Blender with cups</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610404</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:174px;">MP BIOMEDICALS</td>
			<td style="width:119px;">219482101</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">E-6760</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Ethanol</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycerol</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BTNM-0037</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Glycine</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">G7126-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td style="width:174px;">EMD MILLIPORE CORPORATION</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-4</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Heating block</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Jiffy-7 727 w/hole peat pellets</td>
			<td style="width:174px;">Hummert International</td>
			<td style="width:119px;">14237000</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">K-120-100</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KCl (Potassium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P9541-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KH2PO4 (Potassium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3248-05</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">KOH (Potassium Hydroxide)</td>
			<td style="width:174px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0262</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M2773</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M8250</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Miracloth</td>
			<td style="width:174px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">4 75855-1R</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Moisture control potting mix</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">755783</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Na2HPO4 (Sodium Phosphate)</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">3827-01</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">NaCl (Sodium Chloride)</td>
			<td style="width:174px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-203274C</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Nicotiana benthamiana seeds</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-787</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Polypropylene Column</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:262px;">Precision Plus Protein Dual Color Standards</td>
			<td style="width:174px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610394</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Protein G resin</td>
			<td style="width:174px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20399</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:174px;">Gold Biotechnology Inc</td>
			<td style="width:119px;">R-120-25</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td style="width:174px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">DG093</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A7631-500G</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:174px;">any reputable supplier</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Titan3 0.75 &#181;m glass fiber filter</td>
			<td style="width:174px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">40725-GM</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tray for peat pellets with dome</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">TRIS Base</td>
			<td style="width:174px;">J.t.baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-02</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:174px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">M108-1KG</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Tryptone</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">17221</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">UV lamp</td>
			<td style="width:174px;">any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:262px;">Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td style="width:174px;">Miracle-Gro</td>
			<td style="width:119px;">2000992</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:262px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:174px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">9182</td>
			<td style="width:89px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of igg fusion proteins transiently expressed in nicotiana benthamiana

Çeşitli enfeksiyöz, metabolik, otoimmün, neoplastik ve diğer hastalıklar için terapötik müdahaleler olarak antikorlar için yüksek talep rekombinant antikor üretimi için verimli yöntemler geliştirilmesinde artan bir ihtiyaç oluşturur. 2019 itibariyle 70'ten fazla FDA onaylı monoklonal antikor vardı ve üstel büyüme potansiyeli var. Onların sözüne rağmen, yaygın kullanım için sınırlayıcı faktörler üretim maliyetleri ve karmaşıklığı vardır. Potansiyel olarak, bitkiler düşük maliyetli, güvenli ve kolayca ölçeklenebilir protein üretim stratejileri sunar. Nicotiana benthamiana gibi bitkiler sadece doğru katlayabilir ve karmaşık memeli proteinleri monte ama aynı zamanda memeli hücre kültürleri tarafından sunulan benzer kritik post-çevirisel değişiklikler ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, yerli GFP ve insan monoklonal antikorlar erimiş yeşil floresan protein (GFP) bir asit kararlı varyantı kullanarak, n. benthamiana bitkilerden tüm geçici antikor ekspresyonu ve arıtma süreci görselleştirmek başardık. Deneyin amacına bağlı olarak, yerli GFP füzyonbitkilerde ifade aşamasında daha kolay görselleştirme sağlayabilir, asit kararlı GFP füzyon aşağı işleme sırasında görselleştirme sağlarken. Bu ölçeklenebilir ve basit prosedür sadece birkaç küçük bitkiler kullanarak birkaç gün içinde son derece saf antikor veya antikor füzyon proteinleri miligram miktarlarda üretmek için tek bir araştırmacı tarafından yapılabilir. Böyle bir teknik antikor saflaştırma süreci ve potansiyel olarak diğer birçok proteinlerin her türlü görselleştirme için genişletilebilir, bitki ve diğer ifade sistemlerinde hem de. Ayrıca, bu teknikler sanal talimatlardan yararlanabilir ve moleküler biyoloji teknikleri konusunda en az deneyime sahip lisans öğrencileri tarafından bir öğretim laboratuvarında yürütülebilir ve gerçek dünya uygulamaları ile proje tabanlı keşif için bir temel sağlar.

Bu çalışma, rekombinant proteinler üretmek ve aşağı akım süreçleri boyunca görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yöntem göstermektedir. N. benthamiana kullanılarak ve sağlanan protokolü izleyerek, burada açıklanan rekombinant protein üretimi bir haftadan kısa bir sürede sağlanabilir. Bitki ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırmanın genel iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 1B nekroz(Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Bu ifade için basit bir yöntemin bir göstergesidir, çıkarma, ve rekombinant insan IgG arındırma Tütün ile ilgili Nicotiana benthamiana bitkilerde GFP erimiş. Bu protokol, bitki üretilen antikorların, antikor füzyonlarının ve kolon kromatografisi ile saflaştırılabilen proteinlerin çoğunun saflaştırılması ve görselleştirilmesi için kullanılabilir. Bu protokol, üniversite çalışma laboratuarlarında araştırmacıların ve öğrencilerin protein üretim sürecinin en adımlarında GFP etiketli proteinleri görselleştirmelerine olanak tanır.Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve tam genişleme için turba pelet üzerinde daha önce haşlanmış, hala sıcak su dökün. Peletlerin tamamen genişlemesi birkaç dakika sürer. Paletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde iki ila üç Nicotiana benthamiana tohumları yerleştirin.Bu yapıldıktan sonra, tepsinin alt kapsayacak şekilde su yaklaşık 0,5 inç dökmek gerekir. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketlemeyi unutmayın. Fideleri her gün uygun miktarda gübre ile sulamaya devam edin.Tepsi bir humidome üst ve bir büyüme odasında yer ile kaplı olmalıdır. Tohumlu turba pelet 16 saatlik fotoğraf süresi ve% 60 bağıl nem ile 23-25 santigrat derece büyüme odasında tutulmalıdır. Bir hafta sonra, pelet sadece bir fide ile her turba palet bırakarak ekstra bir bitki kaldırın.Bitkiler iki ila üç haftalık olduğunda, nem kontrollü toprak içeren ayrı bir pota her turba pelet aktarın. Her gün litre gübre başına bir gram ile fidanları sulamaya devam edin, toprağı asla tamamen kuru bırakmayın. Bitkiler 5-6 haftalıkken sızmaya hazırdırlar.Bunsen brülör yanında aşağıdaki adımlar yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için temel aseptik teknikler uygulanmalıdır. Bir Lb kanamisin plaka gerekir. Mililitre kanamisin konsantrasyonu başına bir mikrogram.istediğiniz kanamisin dirençli yapı ve bir gecede yetiştirilen barındıran iki mutasyon EHA105 ile sıkı. EHA105, Agrobacterium iki mutasyonunun en sık kullanılan suşlarından biridir. Kültüre başlamak için, lb medya 10 mililitre ile konik tüp doldurun, sonraki, mililitre kanamisin başına 100 mikrolitre 100 mikrolitre, ayrıca e-coli kontaminasyonunu önlemek için rifampisin mililitre başına 2,5 mikrogram 10 mikrolitre ekleyebilirsiniz.Plakadan, yeni kültürünüzü geliştirmek için PCR tarafından doğrulanmış tek bir izole koloni kullanırsınız. İzole koloniseçin ve lb içine aşılamak. Aşıyı çalkalayıcının üzerine yerleştirin.30 santigrat derece ve 120-150 RPM gecede kuluçka. Ertesi gün, Agrobacterium kültürü 0,6 ile 0,9 arasında od600'e çekilirse sızma için kullanılabilir. Bir ila iki mililitre yukarıda büyümüş ise antibiyotik ile taze bir lb transfer edilmelidir ve gerekli OD600 yetiştirilen.Uygun OD600'de kültürleri bir santrifüje yerleştirin, santrifüjün dengeli olduğundan emin olun. Bakteriyi 4, 500G'de oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj ile pelt. Her iki örnekten de üstünlük yapamazlar.Sonra son OD'yi 0,4'e getirmek için her pelet ve bir X sızma arabelleği yeniden askıya alın. Her bir tüpte yapı başına 0,2 son OD'yi elde etmek için her IgG füzyon yapısının eşit hacimli kısmını hafif zincir yapısıyla birleştirin. Bir ataç ve beş ila altı haftalık ve benthamiana bitki adım bir alın.Ataş keskin kenarı açık kullanarak yaprağın ilk epidermal tabakasında küçük bir delik yapmak. Yaprağı delmekten kaçının. İkinci adımdan hazırlanmış Agrobacterium çözeltisi ile bir mililitrelik şırıngayı iğne olmadan doldurun.Şırınganın ucuyla bir önceki adımda yapılan deliği kapatın. Ve yavaşça yaprağın arkasından nazik karşı basınç uygularken yaprağın içine bakteri enjekte etmek için itin. Yaprağın çoğuna sızmaya çalışın ve yaprağı en fazla 3-4 kez dürtün, fazla yaprak hasarı protein verimini engelleyebilir.Çözelti şırıngaya çok fazla basınç uygulamadan enjekte edilirken yaprağın koyulaşmasına dikkat edin. Sızmış bitki yaprağı çoğunlukla alt görünümden karanlık görünür. Bu bakteriyel çözelti nin her yapı için en az üç ila dört bitki için yeterli olması gerektiğini unutmayın.Otoklav atmadan önce kalan bakteriyel çözelti. İğnesiz infiltrasyonu bitirdikten sonra, bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve her gün su almaya devam edin. Kloroz, nekroz ve GFP floresan, kış uzun ve kısa dalga UV lambası için gözlenen yapraklar.Genellikle dördüncü ve beşinci günlerde en yüksek GFP floresansını gösterirler. Hasat dört ila beş gün sonrası infiltrasyon tüm yaprakları ve yaprak malzemenin toplam miktarını tartmak. Yaprak malzemeyi hemen aşağı işleme için kullanabilirsiniz, ya da negatif 80 santigrat derece ye kadar dondurabilirsiniz, kullanılmaya hazır olana kadar sızmış bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve günlük olarak su almaya devam edin.kloroz, nekroz, infiltrasyonlu bölgelerde renk ve yaprak dokusu ölümü değişiklikleri için yaprakları gözlendi. GFP floresan için gözlenen bitkiler. GFP uzun ve kısa dalga UV lamba altında mevcut ise.Protein ekspresyonu zamanla artar, her iki GFP yapılarının en yüksek floresansı genellikle dört ve beş gün arasında meydana gelir. Hasat dört ila beş gün sonrası infiltrasyon tüm yaprakları ve toplam yaprak malzeme tartmak. Akış aşağı işlemleri için hemen kullanın veya kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede dondurun.Harmanlama işlemi sırasında, kullanmadan önce buz veya dört derece santigrat tamponlar ve blender bardak tutmak için emin olun. Dördüncü adımdan itibaren bitki dokusunu duruşma öncesi blender kabına yerleştirin. Blender kabına ilgili PMSF ve sodyum askorbat konsantrasyonları içeren soğutulmuş ekstraksiyon tampon.Blender fincanı blender üzerine yerleştirin, para film önceden kesilmiş bir levha almak ve blender fincan üstüne streç. 22 aralıklarla 80 hayal için ekstraksiyon tampon ile yaprak dokusu karıştırın. Gerektiğinde karışım döngüleri arasında iyice karıştırmanız gerekir.Karışım yaprak malzeme parçaları olmadan homojen görünmelidir. Harmanlanmış malzemeyi bir kabına aktarın. Bir tavada ve protein çözünürlüğünü artırmak ve katı ların yağış sağlamak için 30 dakika boyunca dört derece santigrat için karıştırın.Buz üzerinde temiz bir bez üzerinde çıplak bez iki kat yerleştirin ve büyük yaprak enkaz kaldırmak için üzerinden özü dökün. Tüm özü ayna bezi ile dökülür sonra artık yaprak ekstresi sıkmak için ayna bezi katlayın. Ekstre görünür partiküller olmadan koyu yeşil görünmelidir.Özü santrifüj tüplerine aktarın. 4 santigrat derece 20 dakika için 16, 000Gs ekstresi santrifüj. Bu, çözünmez herhangi bir malzeme yiyecektir.Her iki tüpün de dengeli olduğundan ve rotor kapağının güvenli bir şekilde sıkDığından emin olun. Santrifüjden sonra, pelet görünür olmalı, supernatant demek ve pelet atın. 50 mililitrelik şırınga ve cam elyaf filtresi kullanarak supernatant filtre.Daha sonra analiz için bir örnek ve etiket ham özü 50 mikrolitre toplamak. 20 mililitre numune tutan bir polipropilen sütun ayarlayın. Hedef immünglobulin tipine ve rezorine olan yakınlığına bağlı olarak gerekli bulamaç miktarını tahmin edin.Bu gösteride, üç mililitre bulamaç kullanıyoruz. Genellikle 1.5 mililitre yatak hacmi ile toplam bulamaç üç mililitre antikor birkaç miligram saflaştırma için etkilidir. Kapaklı kolona gerekli miktarda yeniden askıya alınmış bulamacı dikkatlice pipetle.Sütun çıkışını sütunun altındakinden açın ve arabellek gidene kadar boşalmasını bekleyin. Hemen üzerine bir kez PBS yıkama tampon 10 mililitre dökün. Drenaj ve bu yıkama adımı iki kez tekrarlayın.Filtrelenmiş örneği beşinci adımdan sütuna uygulayın ve akış tantanasını toplayın. Aliquot 50 mikrolitre akış-through daha sonra analiz için. Antikor rezorna bağlanmadı diye akan geri kalanı kaydedin.Spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için reçiyiyi bir kez PBS'nin 10 mililitresiyle iki kez yıkayın. İstenirse, aliquot 50 mikrolitre yıkama tampon udoğrulamak için sütun üzerinden drenaj hedef antikor bir yıkama tampon ile ima olmadığını doğrulamak için. Yıkama tamponu reçine, kurulum ve etiket beş mikro santrifüj tüpler ifin ile çalışırken steril 125 mikrolitre, bir molar tris-HCL pH sekiz elüsyon tampon nötralize etmek için.Alternatif olarak, daha konsantre eluate almak için iki azı tris baz 30 mikrolitre ekleyin. Elüsyon sırasında, UV ışığı görselleştirme için kullanılabilir. Bunun elüsiyon süresi boyunca yapılması gerekmez.Uv kullanılıyorsa, gözlere ve cilde zarar vermemek için uygun kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Uv ışığının elüsyon adımı sırasında kullanılması gerekmez. Kolona beş mililitre elüsyon tamponu uygulayarak antikorları eute ve bir mililitre fraksiyonları toplamak, önceki adımdan her belirlenen tüp için.Hemen 20 mililitre ve ardından 10 mililitre yıkama tampon uygulayarak sütun uyenin. Resenin asidik bir ortamda uzun süre bırakılmadığından emin olun. Elüsyon floresan görünmelidir.Genellikle en yüksek floresan ikinci elution görülür, ancak çıkarma çıkarma değişebilir. Depolama için, reçin 10 mililitre ile yıkayın 20% etanol ve PBS ve yarıya drenaj sağlar. Üst, sonra sütunun alt recap ve dört derece C.280 nanometre de emiciölçme bir fotoğraf spektrometresi kullanarak antikor konsantrasyonu belirleyin dik tutun.Daha fazla analiz için ayrı bir tüp için negatif 80 santigrat derece ve aliquot her fraksiyonun 50 mikrolitre de eluates saklayın. Genellikle protein süreleri önemli verimlilik kaybı olmadan 10 kata kadar yeniden kullanılabilir. 280 nanometrede emiciliği ölçerek bir spektrofotometre kullanarak antikor konsantrasyonu belirlemek için üreticinin yönergelerine bakın.Daha fazla analiz için ayrı bir tüp içine eksi 80 santigrat derece ve aliquot her fraksiyonun 50 mikrolitre eluates saklayın. Zs sayfası ile saflaştırılmış protein analizi standart protokoller izleyerek yapılabilir. GFP içeren bir yapının klonlama, sızma ve ekspresyonu başarısını gösteren bir sonuç olarak gözlenen floresan.Birkaç gün boyunca, floresan lar dördüncü ve beşinci günlerde yüksek floresan ile kademeli olarak artmalıdır. Protein G kullanıldığında floresan protein bağlanması ve kolondan sonraki elüsiyon kararlı bir GFP olarak içeren bir IgG füzyon saflaştırma gösterir. Ve UV maruz jel, merdivensadece 25KDa ve 75KDa bantları görebilirsiniz.Ayrıca, azaltılmış olmayan elution 2 örnek görebilirsiniz. Azaltılmış olmayan elüs, kararlı GFP füzyonu olarak bozulmamış bir IgG'den beklenilen göreceli boyut olarak floresansını korur. Coomassie leke jelinde hem azaltılmış hem de indirgenmeyen numuneler görselleştirilir.Tüm merdiven bileşenleri görünür, yerli proteinler ve IgG füzyonlar toplam ekstre supernatant görülebilir ve örnekler aracılığıyla akış. Yıkama IgG füzyon küçük bir miktar içerir. Elüsyon bir ve dört çoğu protein genellikle ikinci ve üçüncü elüsyon adımlarından kurtulmuş olduğu gibi beklendiği gibi daha az konsantre protein içeriyordu.Elution 2 non reducing de birden fazla bantları tüm azaltma elüsyasyon örnekleri var görülebilir. 75KDa, GFP'ye ağır zincir sigortasını gösterir. 50KDa tek başına ağır bir zincir gösterir, 25KDa tek başına bir hafif zincir gösterir, ve 10 KDA büyük olasılıkla proteaz inhibitörleri eklenmesi ile önlenebilir bozulma gösterir.Bu protokol, istenilen hedef proteine kaynaşmış herhangi bir antikorun saflaştırılması için kullanılabilir. Bu süreç çeşitli miktarda yaprak materyalini barındıracak şekilde düzenlenebilir ve aynı zamanda protein çıkarma ve saflaştırma işlemlerinin tamamlanmasından önce, sırasında ve sonrasında protein varlığının görsel olarak belirlenmesini sağlar. Bu yöntemler kontrol olarak yararlı olabilir ve teknikleri öğretmek için bir amaç olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...