Name: a protocol for immunohistochemistry and rna in-situ distribution within early drosophila embryo
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), Foreign Distinguished Scientist Program fra National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45), og XZ støttes af Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), Det naturvidenskabelige grundforskningsprogram Ungdomsprojekt fra Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

1. Tilberedning af druesaft agar plader
<ol><li>Tilsæt 5 g agar og 5 g saccharose til 150 ml destilleret vand. Kog det ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil agar og saccharose er fuldt opløst. Bland 50 ml 100% druesaft og opløsningen sammen.</li>
	<li>Tilsæt 1 ml 100% propionsyre for at gøre den endelige koncentration til 0,5% propionsyre. Hæld 25 ml af den tilberedte opløsning i hver plade. Når agaren er størknet, opbevares mediet i 4 °C.</li>
</ol>2. Belægni...

<ol>
	<li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+Receptors:+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors.">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li><li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling:+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis.">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li><li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel.">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li><li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein:+evaluation,+structure,+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster.">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart.">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+CaSR/IP3R+in+prostate+cancer+development.">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis,+to+immune+evasion,+and+metastasis.">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12.">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li><li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy.">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li><li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor.">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li><li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs.">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2.">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li><li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster.">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li><li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+expression+of+DmFKBP12/Calstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster.">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).</li><li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse.">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2.">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li><li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+&amp;#34;leaky&amp;#34;+channels:+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity.">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &amp;#34;leaky&amp;#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li><li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice.">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506.">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li><li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++release+channels+join+the+'resolution+revolution'.">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li></ol>

RyRs og IP3Rs medieret calciumsignalering er en grundlæggende vej i mange fysiologiske og patologiske processer hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutationer, såsom CPVT-associeret R4496C-mutation, i RyR2-genet til calciumlækage fra det sarkoplasmatiske retikulum af kardiomyocyt, hvilket resulterer i hjertedysfunktion. Disse mutationer præsenterer som...

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer, såsom skelet/glat muskel og hjertevaskulær funktion, celleproliferation og apoptose, udvikling, aldring, neuronal synaptisk plasticitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodinreceptorer (RyR'er) og inositol 1,4,5-trisphosphatreceptorer (IP3R'er) er vigtige aktører i calciumsignalvejen, der styres af deres regulatorer proteinkinase A (PKA), Ca2+/calmodulinafhængig proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende proteiner (FKBP'er), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormal menneskelig ekspression og mutationer i disse proteiner kan føre til patologisk fysiologi såsom arytmier7 og onkogen proliferation8,9.
FKBP'er regulerer calciumfrigivelsen fra den endoplasmatiske retikulære (ER) af RyRs. Denne proces er afgørende for sammentrækningsmekanismen og dermed ansvarlig for al mekanisk bevægelse genereret af myosin-actinkontraktion gennem calciuminduceret calciumfrigivelse sammen med embryonale RyRs1,2. I musemodeller er manglen på RyR2 og dens regulator FKBP12/Calstabin altid dødelig, enten under embryonal udvikling eller i den tidlige postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout-mus udviser kritiske hjertefejl med uregelmæssig excitationskontraktionskobling (EC) og cerebralt ødem under embryonal udvikling. Dette indikerer, at FKBP12/Calstabin spiller en væsentlig rolle i reguleringen af RyR2-kanalekspression, hvilket er vigtigt både for hjerte- og cerebral udvikling10.
RyR-udførte calciumgnister blev oprindeligt opdaget i zygotdannelsesfasen af befrugtede Medaka-æg13,14. Der er imidlertid kun foretaget få undersøgelser af calciumsignaleringens funktion i den tidlige embryonale udvikling. I Drosophila melanogaster giver resultater opnået fra DmFKBP12 S107-mutanter stærke beviser, der understøtter betydningen af dette gen for larveudvikling og en sund levetid, hvilket tilskrives dets funktion mod oxidativ stress15,16. For nylig identificerede vi den dynamiske lokalisering af FKBP12/Calstabin-protein og messenger-RNA under den tidlige Udvikling af Drosophila melanogaster17. Ved hjælp af de tilgange, der er beskrevet i denne metode, var vi i stand til at spore ekspressionen af FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under syncytial blastoderm (0-2 timer), cellulær blastoderm (2-3 timer), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 timer). I dette papir præsenterer vi de detaljerede protokoller for hver tilgang i den foregående undersøgelse, herunder præ-embryoindlejring til klassisk paraffinsektionering, præ-coating diasbehandling til embryonale sektioner, histo-kemi farvning og immunfarvning og mRNA in-situ hybridisering til identifikation af genekspression.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Meiling Biology &#38;Medical</td>
			<td>DW-YL270</td>
			<td>Used for regent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Forma 90 Series</td>
			<td>Used for regent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB6360V</td>
			<td>Preparation of grape juice agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>For the detection of digoxigenin-labeled compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Shanghai Bluepard Instruments</td>
			<td>LRH-250</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>69945460</td>
			<td>Drosophila Embryo Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540BH07808</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2170</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome Alum</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10001018</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature water bath</td>
			<td>Jintan Henfeng Instruments</td>
			<td>KW-1000DC</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako REAL EnVision Detection System</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K5007</td>
			<td>In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td>
			<td>The stocks of Drosophila melanogaster mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric blast drying oven</td>
			<td>Tianjin Taiste Instruments</td>
			<td>101-0AB</td>
			<td>For coating slides and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230251</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>100092680</td>
			<td>Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10010328</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379948</td>
			<td>Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure PCR Product Purification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11732668001</td>
			<td>For purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent constant temperature and humidity box</td>
			<td>Ningbo Jiangnan Instruments</td>
			<td>HWS</td>
			<td>For fly maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>HyAgarose</td>
			<td>14190108029</td>
			<td>Pre-embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10014108</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Observer.A1</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>MeVid Labware Manufacturing</td>
			<td>P105-2001</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Gum</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10004160</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-heptane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>40026768</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin slicer</td>
			<td>Huahai science instrument</td>
			<td>HH-2508III</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>69019461</td>
			<td>Paraffin Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/mV Meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>PB-10</td>
			<td>For determing the pH value of a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10018461</td>
			<td>Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water meter</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>AFXI-0501-P</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10023418</td>
			<td>Paraffin Embedding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for immunohistochemistry and rna in-situ distribution within early drosophila embryo

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferation og apoptose, udvikling og aldring til neuronal synaptisk plasticitet og regenerering har været forbundet med ryanodinreceptorer (RyR'er). På trods af vigtigheden af calciumsignalering er den nøjagtige mekanisme for dens funktion i tidlig udvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskabsperiode er embryonerne af Drosophila melanogaster primære forsøgspersoner til undersøgelse af distribution og lokalisering af CICR-associerede proteiner og deres regulatorer under udvikling. På grund af deres lipidrige embryoner og chitinrige chorion er deres anvendelighed imidlertid begrænset af vanskeligheden ved at montere embryoner på glasoverflader. I dette arbejde introducerer vi en praktisk protokol, der signifikant forbedrer fastgørelsen af Drosophila embryo på dias og detaljer metoder til vellykket histokemi, immunhistokemi og in situ hybridisering . Krom alun gelatine diasbelægningsmetode og embryo pre-embedding metode dramatisk øger udbyttet i studiet af Drosophila embryo protein og RNA ekspression. For at demonstrere denne tilgang studerede vi DmFKBP12 / Calstabin, en velkendt regulator af RyR under tidlig embryonal udvikling af Drosophila melanogaster. Vi identificerede DmFKBP12 så tidligt som det syncytiale blastodermstadium og rapporterer det dynamiske ekspressionsmønster af DmFKBP12 under udvikling: først som et jævnt fordelt protein i syncytial blastoderm, derefter foreløbigt lokaliseret til kælderlaget af cortex under cellulær blastoderm, før det fordeles i den primitive neuronale og fordøjelsesarkitektur under tre-ædelstenslagsfasen i tidlig gastrulation. Denne fordeling kan forklare den kritiske rolle, RyR spiller i de vitale organsystemer, der stammer fra disse lag: den suboøsofageale og supraesophageale ganglion, ventrale nervesystem og muskuloskeletale system.

Tallene beskriver protokoller, der bruges til at overvinde udfordringen med at fastgøre høje lipid- og chitinholdige chorion Drosophila-embryoner (tabel 1) til glasglideoverfladen til undersøgelse og eksperimentering. Ved hjælp af krommamelatine-diasbelægningsmetoden vist i figur 1 forbedrede vi fastgørelsen af Drosophila-embryoner på overfladen af dias, mens embryo-præindlejringsmetoden vist i figur 2 muliggør effekti...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo at JoVE.com

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Her beskriver vi en protokol til påvisning og lokalisering af Drosophila embryoprotein og RNA fra indsamling til præindlejring og indlejring, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

En protokol til immunohistokemi og RNA in situ-distribution inden for tidligt drosophila-embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Som en organisme med en kort svangerskabsperiode er embryonerne af Drosophila melanogaster primære undersøgelsesemner til undersøgelse af distribution og lokalisering af proteiner og deres regulatorer under udvikling. På grund af deres lipidrige embryoner og chitinrige chorion er deres anvendelighed imidlertid begrænset af vanskeligheden ved at montere embryoner på glasoverflader. I dette arbejde introducerer vi en praktisk metode, der signifikant forbedrer fastgørelsen af Drosophila embryo på dias og beskriver vores metoder til vellykket histokemi, immunhistokemi og in situ hybridisering.Før de trin, der er vist her, skal dias vaskes med vaskemiddel, skylles derefter i ledningsvand og destilleret vand, inden de placeres i ovnen for at tørre. Tørre dias skal forsigtigt suge i kaliumdichromat i 24 timer, før de skylles og tørres igen og derefter anbringes i 95% ethanol i mindst to timer. I løbet af dette trin kan du forberede yderligere dias eller krommalum-gelatine i henhold til vores metoder.Gelatine kan derefter opbevares i 60 graders badevand inden brug. For at belægge dias skal du slippe en lille mængde gelatine på den ene kant af diaset. Brug derefter et andet glasglide til langsomt og jævnt at trække gelatinen hen over overfladen af diaset, der skal belægges.Dette skaber et tyndt, jævnt lag. Før de sættes i en rist eller et tørreapparat, der skal opbevares i en ovn for at muliggøre fuld tørring i endnu en nat eller 48 timer. Embryo opsamles ved hjælp af en druesaft agar plade, når den er klar, kan druesaft agar plade derefter fjernes.Oversvøm pladen med PBS og børst forsigtigt med en blød børste for at fjerne eventuelle vedhæftede embryoner. Fjern embryo indeholdende PBS til et 1,5 ml centrifugerør og lad det hvile på is. Når embryoet er lagt på is, skal du forsigtigt fjerne supernatanten PBS.Pas på ikke at forstyrre embryoet i bunden af røret. Tilsæt 1 ml 50% blegemiddel til prøven og ryst forsigtigt i to minutter. Fjern blegemidlet ved filtrering og vask embryoner i PBS tre gange.Forbered n-heptan. Når de er klar, vaskes embryonerne fra filterpapiret til n-heptan ved at ryste filterpapiret forsigtigt i opløsningen. Lad embryoner slå sig ned i bunden af n-heptanpladen og opsaml denne n-heptan i et nyt 1,5 ml centrifugerør.Tilsæt en milliliter methanol til røret, lad opløsningen udfælde og derefter aspirere n-heptanmethanolen. Vask embryoet i PBS tre til fem gange for at fjerne resterende methanol. Fjern denne ekstra PBS og tilsæt Bouins fikseringsmiddel og lad det slå sig ned i 30 til 60 minutter for at fikse embryonerne.Fjern Bouins fikseringsmiddel og vask embryonerne igen i PBS tre gange. Forbered 1,2% agarose i PBS og hold varmen i et 60 graders vandbad, og forbered derefter embryonerne til indlejring ved forsigtigt at aspirere ekstra PBS, som det er blevet opbevaret i. Pas på ikke at forstyrre embryonerne i bunden, og aspirer derefter embryoproppen i bunden af opløsningen og læg forsigtigt i en flaskehætteform.Aspirer eventuel yderligere PBS fra denne form, før du tilsætter 1,2% agarosegel. Forbered en opløsning af PBS for at opbevare disse agarosepropper. Når agarose er størknet, kan individuelle stik derefter flyttes ind i denne PBS til opbevaring.Her viser vi den sekventielle dehydreringsproces. Tillader 15 minutter til inkubation hver gang. Fjern derefter fra 100% ethanol og fastgør i en en-til-en opløsning af ethanol og xylen i yderligere 15 minutter.Når den er fjernet fra denne en-til-en-opløsning, fjernes den i ren xylen i et minut. Nu er vævsprøven klar til at blive flyttet til en opvarmet en-til-en xylenparaffinopløsning. Lad det sidde i 30 minutter før den endelige indlejring i 100% paraffin.Flyt til den første af 100% paraffin og hvil i to timer. Gentag denne proces i sine to og tre paraffiner. Prøven er nu klar til at blive flyttet i en form og formen fyldt med voks for at afslutte indlejringsprocessen.Indlejring af Drosophila embryoner. Anbring tilberedte paraffinsektioner af Drosophila embryoner i en 60 graders ovn i 15 minutter. Anbring dem i en 100% opløsning af xylen.Vi begynder derefter rehydrering. Placer diasene i hver af disse løsninger i tre minutter hver. Når glideren er i destilleret vand, anbringes i hæmatoxylinopløsningen i to minutter.Når du er færdig, skal du sørge for at dræne så meget af opløsningen som muligt fra diaset. Når diaset er vasket i destilleret vand, skal du plette glideren i eosin i et minut. Til sidst skal du fjerne glideren fra eosin og vaske i destilleret vand.Når dette dias er rent, begynder vi nu vores sidste dehydreringsproces. Til sidst anbringes i 100% xylen i fem minutter. Denne proces gentages i to nye opløsninger af 100% xylen og slipper en lille mængde neutralt tyggegummi langs den ene kant af diaset.Tag denne dæksel glide og placer forsigtigt på den ene kant af diaset. Først deparaffinisere diasene ved at placere dem i 100% xylen. Når diasene er fjernet fra destilleret vand, skal de dækkes med 1% periodisk syreopløsning.Vi kasserer derefter den overskydende opløsning og skyller i destilleret vand. Ved at placere glideren direkte i en forvarmet opløsning. Når dette er afsluttet, skyller vi diaset i destilleret vand og toner derefter opløsningen med 0,2% guldchlorid i et til to minutter.Dernæst fastgør vi vævet med 3% natriumthiosulfat i tre minutter ved hjælp af destilleret vand. Og så modplet med hæmatoxylin. Efter modfarvning kan pletten vaskes med begge rør destilleret vand som vist her.Derefter går vi videre til dehydreringsprocessen. Følg dette ved at sætte diasene direkte i 100% xylen og derefter påføre en lille mængde neutralt tyggegummi på hjørnet af diaset. Dæk forsigtigt med en dæksel.Begynd at forberede diasene som tidligere ved at deparaffinisere og xylen. Og så i en-til-en xylenethanol. Når diasene er deparaffiniseret, begynder vi at rehydrere deres væv og derefter til sidst i PBS.Anbring lysbillederne i 0,3% hydrogenperoxid fremstillet i methanol i 10 minutter. Derefter dækkes diasene med 20 mLs målhentningsløsning. Lysbillederne kan derefter placeres i farvningsboksen.Anbring pletteboksen i en damper, og det sikres, at ingen løsning slipper ud, og at gliderne stadig er helt dækket. Bemærk, at låget til pletteboksen ikke skal være helt lukket, så vanddamp kan slippe ud under dampningsprocessen. Og skyl derefter forsigtigt i PBS-T tre gange.Kassér den overskydende opløsning og gentag processen, denne gang med PBS. Dernæst inkuberer vi diasene i en peroxidblok i fem til 10 minutter og skyller derefter flere gange igen i PBS-T og derefter i PBS. Forbered antistoffet og slip direkte på vævet.Disse væv kan derefter inkuberes eller ved stuetemperatur i fire timer. Det sekundære antistof skal inkuberes ved stuetemperatur i 90 minutter, hvilket er farvning med 5% DAB i to til 10 minutter. Når den passende farve er opnået, skylles i destilleret vand og derefter modplet i hæmatoxylin.Efter denne hæmatoxylinplet kan diasene derefter sekventielt dehydreres. Placer diasene i 100% xylen og lad dem trække i tre minutter. Slip derefter små mængder neutralt tyggegummi på den ene kant af diaset.Når et tyggegummi er blevet placeret, skal du tage glidedækslet og placere det forsigtigt fra den ene kant af diaset. Tilsæt et mikrogram renset lineariseret skabelon-DNA til et sterilt RNase-frit reaktionshætteglas. Tilsæt derefter nok sterilt RNase-frit DEPC-behandlet dobbeltdestilleret vand til at fremstille et samlet prøvevolumen på 13 mikroliter.Derefter centrifugeres kort og inkuberes i to timer ved 37 grader Celsius. Til RNase-beskyttelseseksperimenter anbefaler vi, at du inkuberer i 15 minutter med to mikroliter Dnase-1, RNase-fri for at fjerne skabelon-DNA. Når inkubationstrinnet er afsluttet, Stop reaktionen ved at tilsætte to mikroliter 0,2 molær EDTA ved pH på otte.Forud for trinnene viser her diasene blev deparaffiniseret og rehydreret i henhold til vores tidligere demonstrerede protokol. Efter rehydrering inkuberes diasene i 0,01 mol pr. Liter PBS ved pH på 7,4 i fem minutter hver for at fjerne den fikserende opløsning fra vævet. Efter skylning i PBS skyller vi derefter med 100 millimolær pr. Liter glycinopløsning i fem minutter to gange for at fjerne frie aldehydgrupper fra vævet.Efter dette trin skylles dias med PBS i fem minutter. Derefter inkuberes i PBS indeholdende 0,3% triton X-100 i 15 minutter før skylning og derefter inkuberes igen med et mikrogram pr. Mikroliter proteinase K.Derefter fastgøres dias med 4% paraformaldehyd og PBS ved pH på 7,2 i tre minutter. Vask derefter diasene, inden de inkuberes med 0,1 molær triethanolaminbuffer pH 8, der indeholder 0,25% eddikesyreanhydrid.Du kan vælge at vippe kassen på dette tidspunkt for at sikre fuld dækning med løsningen. Kassen fremstilles ved at tilsætte 20% glycerol eller DEPC-vand til bunden af en tør hybridiseringsboks. Dæk derefter diasene i 20 mikroliter præhybridiseringsopløsning.Laksens sæd-DNA i en koncentration på 100 mikrogram pr. milliliter til hvert dias. Og derefter inkubere ved 42 grader Celsius i fire timer. Dette gøres i en forberedt befugtet kasse for at sikre, at opløsningen ikke tørrer under denne proces.I posthybridiseringsfasen er det meget vigtigt, at hybridiseringsopløsningen skylles fuldstændigt fra dine prøver. Dette kan gøres i på hinanden følgende skylninger på 15 minutter ved 37 grader ved anvendelse af fire gange koncentration SSC, to gange koncentration en gange koncentration, 0,5 gange koncentration og 0,1 gange koncentration SSC-opløsning. Hver inkubation i 15 minutter ved 37 grader Celsius.Når dette er gjort, vaskes med PBS tre gange i fem minutter hver, før du tilføjer vaskebufferen. Vaskebufferen skal skylles i et minut før de næste trin Sørg for, at vaskebufferen er helt tør fra diasene, før du tilsætter den næste opløsning. Tilsæt 100 ml blokeringsopløsning til hvert dias og inkuber diaset i 30 minutter.Dette gøres bedst i et lysfrit miljø for at sikre god farvning. Derefter inkuberes diasene i 30 minutter igen i 20 mLs antistofopløsning. Påfør antistofopløsningen direkte på dias for fuld dækning af dit væv.Når inkubationen er afsluttet, påføres 100 ml vaskebuffer. Inkuber i 15 minutter under lysfrie forhold for at fjerne ubundne antistofkonjugater. Fjern vaskebufferen.Påfør derefter 20 ml detektionsbuffer og lad den inkubere i ca. fire minutter. Efter fire minutter skal du fjerne detektionsbufferen. Tør diasene for at sikre, at der ikke er yderligere opløsning, og tilsæt 10 ml frisklavet farvesubstratopløsning.Denne reaktion begynder inden for få minutter, men den er færdig efter 16 timer. Så lad os inkubere i den periode i en lysfri tilstand. Når de ønskede steder, hvor bånd detekteres, vaskes glideren med 50 ml TE-buffer for at stoppe reaktionen.Og afslut derefter vores tidligere viste dehydreringsproces og monteringsproces for neutralt tyggegummi. Figur et og to viser kromugeliumgelatinebelægningsmetoden til paraffinsektioner og indlejringsmetoden til ekspressionsprofil af FKBP12 og DmFKBP12 i udviklingen af Drosophila-embryoner. Figur tre viser proteinfordelingen af antistof påvist FKBP12 på de syncytialcellulære blastodermstadier.Fra disse histokemiske resultater kan det ses, at FKBP12-ekspression er mindre polariseret i den syncytiale blastoderm og derefter begynder at lokalisere sig i kældermembranen under trophektodermepitelet informerer gradienten med mere udtryk, der findes i de forreste og bageste poler. Figur fire, der følger de tidlige og sene gasrelationsstadier i Drosophila-embryoet, viser, at FKBP12-proteinet bliver begrænset til visse arkitektoniske komponenter i det primitive embryonale væv. Med mindre ekstracellulær fordeling end den, der observeres i tidlige og sene gastroembryonale stadier.Interessant nok ledsages den ovenfor beskrevne dynamiske proteinfordeling ikke af tilsvarende ændringer i MR-niveauer af FKBP12 som vist i figur fem. Indikerer proteinekspression at være resultatet af en stadig ukendt posttranskriptionel molekylær mekanisme. Ryanodinreceptormedieret calciumsignalering er en grundlæggende vej i mange fysiologiske og patologiske processer hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr.Mutationer i dette gen er kendt for at forårsage mange fysiologiske forstyrrelser, der fører til sygdom eller tidlig hjertedød. Den rolle, dette gen spiller i den tidlige Drosophila-udvikling, har imidlertid været vanskelig at studere. Som en transitkomponent i embryoet, lipidrig embryo og chitinrig chorion, gør undersøgelser af protein og embryonal ekspression i tidlig Drosophila udvikling vanskelig.Diasbelægningen, embryoindlejringen og immunohistokemiske teknikker, der er beskrevet i dette papir, har gjort det muligt for os at studere detaljeret den dynamiske fordeling af ryanodinreceptorprotein og mRNA. Vi deler disse teknikker og håbet om, at de vil give andre mulighed for at studere andre proteiner i de tidlige udviklingsstadier af Drosophila.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forståelse Tidlig Organogenesis efter en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridization protokol<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protokoller til Indhentning zygotiske og somatiske for studere regulering af Early Embryo Udviklingen i Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Middelskala forberedelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter til proteomiske forsøg

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...