Name: a protocol for immunohistochemistry and rna in-situ distribution within early drosophila embryo
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), Foreign Distinguished Scientist Program fra National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 /201701005/GERP-17-45), og XZ støttes av Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), Naturvitenskapelig grunnforskningsprogram Ungdomsprosjekt ved Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

1. Tilberedning av druejuice agarplater
<ol><li>Tilsett 5 g agar og 5 g sukrose til 150 ml destillert vann. Kok den med en mikrobølgeovn til agaren og sukrose er helt oppløst. Bland 50 ml 100% druejuice og løsningen sammen.</li>
	<li>Tilsett 1 ml 100% propionsyre for å gjøre den endelige konsentrasjonen til 0,5% propionsyre. Hell 25 ml av den tilberedte løsningen i hver plate. Etter at agaren har størknet, oppbevar mediet i 4 °C.</li>
</ol>2. Belegg lysbilder</stro...

<ol>
	<li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Sparks.">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+Receptors:+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors.">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li><li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling:+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis.">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li><li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel.">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li><li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein:+evaluation,+structure,+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster.">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart.">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+CaSR/IP3R+in+prostate+cancer+development.">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li><li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis,+to+immune+evasion,+and+metastasis.">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell &amp; Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12.">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li><li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy.">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li><li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor.">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li><li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs.">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2.">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li><li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster.">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li><li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+expression+of+DmFKBP12/Calstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster.">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).</li><li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse.">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2.">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li><li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+&amp;#34;leaky&amp;#34;+channels:+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity.">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &amp;#34;leaky&amp;#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li><li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice.">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506.">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li><li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++release+channels+join+the+'resolution+revolution'.">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li></ol>

RyRs og IP3Rs mediert kalsiumsignalering er en grunnleggende vei i mange fysiologiske og patologiske prosesser av både virveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutasjoner, som CPVT-assosiert R4496C-mutasjon, i RyR2-genet til kalsiumlekkasje fra sarkoplasmisk retikulum av kardiomyocytt, noe som resulterer i hjertedysfunksjon. Disse mutasjonene presenterer som arytmi med h...

Kalsiumindusert kalsiumutløsningssignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel skjelett/glatt muskel- og hjertevaskulær funksjon, celleproliferasjon og apoptose, utvikling, aldring, nevronal synaptisk plastisitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol 1,4,5-trisfosfat reseptorer (IP3Rs) er store aktører i kalsium signalveien kontrollert av sine regulatorer protein kinase A (PKA), Ca2 +/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII), FK506 bindende proteiner (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormalt menneskelig uttrykk og mutasjoner i disse proteinene kan føre til patologisk fysiologi som arytmier7 og onkogen spredning8,9.
FKBPs regulerer kalsiumutslippet fra endoplasmic reticular (ER) av RyRs. Denne prosessen er avgjørende for sammentrekningsmekanismen, og dermed ansvarlig for all mekanisk bevegelse generert av myosin-aktinkontraksjon gjennom kalsiumindusert kalsiumutslipp sammen med embryonale RyRs1,2. I musemodeller er mangelen på RyR2 og regulatoren FKBP12 /Calstabin alltid dødelig, enten under embryonal utvikling eller i tidlig barselperiode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout mus viser kritiske hjertefeil med uregelmessig eksitasjon- sammentrekningskobling (EC) og cerebral ødem under embryonal utvikling. Dette indikerer at FKBP12/Calstabin spiller en viktig rolle i reguleringen av RyR2 kanaluttrykk, noe som er viktig både for hjerte- og hjerneutvikling10.
RyR utførte kalsium gnister ble først oppdaget i zygote formasjonsfasen av befruktede Medaka egg13,14. Det er imidlertid gjort få undersøkelser om funksjonen til kalsiumsignalering i tidlig embryonal utvikling. I Drosophila melanogaster gir resultater hentet fra DmFKBP12 S107 mutanter sterke bevis som støtter betydningen av dette genet for larvutvikling og en sunn levetid, som tilskrives dens funksjon mot oksidativt stress15,16. Nylig identifiserte vi den dynamiske lokaliseringen av FKBP12 / Calstabin protein og messenger RNA under tidlig Drosophila melanogaster utvikling17. Ved hjelp av tilnærmingene beskrevet i denne metoden, var vi i stand til å spore uttrykket av FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under synkron blastoderm (0-2 h), cellulær blastoderm (2-3 h), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 h). I dette dokumentet presenterer vi de detaljerte protokollene for hver tilnærming i forrige studie, inkludert pre-embryo innebygging for klassisk parafinseksjon, pre-belegg lysbildebehandling for embryonale seksjoner, histokjemifarging og immunostaining, og mRNA in-situ hybridisering for identifisering av genuttrykk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-20&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Meiling Biology &#38;Medical</td>
			<td>DW-YL270</td>
			<td>Used for regent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C Ultra low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Forma 90 Series</td>
			<td>Used for regent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB6360V</td>
			<td>Preparation of grape juice agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>For the detection of digoxigenin-labeled compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>Shanghai Bluepard Instruments</td>
			<td>LRH-250</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>69945460</td>
			<td>Drosophila Embryo Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>540BH07808</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C-2170</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome Alum</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10001018</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature water bath</td>
			<td>Jintan Henfeng Instruments</td>
			<td>KW-1000DC</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako REAL EnVision Detection System</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K5007</td>
			<td>In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td>
			<td>The stocks of Drosophila melanogaster mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric blast drying oven</td>
			<td>Tianjin Taiste Instruments</td>
			<td>101-0AB</td>
			<td>For coating slides and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230251</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>100092680</td>
			<td>Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10010328</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379948</td>
			<td>Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure PCR Product Purification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11732668001</td>
			<td>For purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent constant temperature and humidity box</td>
			<td>Ningbo Jiangnan Instruments</td>
			<td>HWS</td>
			<td>For fly maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>HyAgarose</td>
			<td>14190108029</td>
			<td>Pre-embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10014108</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Observer.A1</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>MeVid Labware Manufacturing</td>
			<td>P105-2001</td>
			<td>Coating Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Gum</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10004160</td>
			<td>Hematoxylin-Eosin Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-heptane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>40026768</td>
			<td>Drosophila Embryo Collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin slicer</td>
			<td>Huahai science instrument</td>
			<td>HH-2508III</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>69019461</td>
			<td>Paraffin Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/mV Meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>PB-10</td>
			<td>For determing the pH value of a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10018461</td>
			<td>Periodic Acid-Silver Methenamine Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water meter</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>AFXI-0501-P</td>
			<td>In-situ Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent at Beijing</td>
			<td>10023418</td>
			<td>Paraffin Embedding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for immunohistochemistry and rna in-situ distribution within early drosophila embryo

Kalsiumindusert kalsiumutslippssignal (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferasjon og apoptose, utvikling og aldring, til nevronal synaptisk plastisitet og regenerering har vært forbundet med Ryanodine reseptorer (RyRs). Til tross for viktigheten av kalsiumsignalering, er den eksakte mekanismen for funksjonen i tidlig utvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskapsperiode er embryoene til Drosophila melanogaster hovedstudieemner for å undersøke distribusjon og lokalisering av CICR-tilknyttede proteiner og deres regulatorer under utvikling. Men på grunn av deres lipidrike embryoer og chitinrike korion, er deres nytte begrenset av vanskeligheten med å montere embryoer på glassflater. I dette arbeidet introduserer vi en praktisk protokoll som betydelig forbedrer vedlegget av Drosophila embryo på lysbilder og detaljmetoder for vellykket histokjemi, immunhiistokjemi og in-situ hybridisering. Den krom alum gelatin lysbilde-belegg metode og embryo pre-embedding metode dramatisk øker utbyttet i å studere Drosophila embryo protein og RNA uttrykk. For å demonstrere denne tilnærmingen studerte vi DmFKBP12/Calstabin, en kjent regulator av RyR under tidlig embryonal utvikling av Drosophila melanogaster. Vi identifiserte DmFKBP12 i så tidlig som det synytiale blastodermstadiet og rapporterte det dynamiske uttrykksmønsteret til DmFKBP12 under utvikling: først som et jevnt distribuert protein i synytial blastoderm, deretter foreløpig lokalisering til kjellerlaget av cortex under cellulær blastoderm, før distribusjon i den primitive nevronale og fordøyelsesarkitekturen under tre-perle lagfasen i tidlig gastrulation. Denne fordelingen kan forklare den kritiske rollen RyR spiller i de vitale organsystemene som stammer fra disse lagene: det suboøsofageale og supraesophageal ganglion, ventrale nervesystemet og muskel-skjelettsystemet.

Figurene beskriver protokoller som brukes for å overvinne utfordringen med å feste høy lipid og chitinholdige chorion Drosophila-embryoer (tabell 1) til glasssklieoverflaten for undersøkelse og eksperimentering. Ved hjelp av krom alum gelatin lysbildebeleggmetoden vist i figur 1, forbedret vi vedlegget av Drosophila-embryoer på overflaten av lysbilder mens embryoets pre-embedding-metode vist i figur 2 muliggjør effektiv i...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo at JoVE.com

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Her beskriver vi en protokoll for deteksjon og lokalisering av Drosophila embryoprotein og RNA fra innsamling til pre-embedding og innebygging, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

En protokoll for immunhiistokjemi og RNA in-situ distribusjon innen tidlig Drosophila embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Som en organisme med en kort svangerskapsperiode er embryoene til Drosophila melanogaster førsteklasses studiepersoner for å undersøke distribusjon og lokalisering av proteiner og deres regulatorer under utvikling. Men på grunn av deres lipidrike embryoer og chitinrike korion, er deres nytte begrenset av vanskeligheten med å montere embryoer på glassflater. I dette arbeidet introduserer vi en praktisk metode som betydelig forbedrer vedlegget av Drosophila embryo på lysbilder og beskriver våre metoder for vellykket histokjemi, immunhiistokjemi og in-situ hybridisering.Før trinnene som vises her, skal lysbildene vaskes med vaskemiddel, skylles deretter i vann fra springen og destillert vann før de plasseres i ovnen for å tørke. Tørre lysbilder skal forsiktig suge i kaliumdikromamat i 24 timer før de skyller og tørkes igjen, og deretter plasseres i 95% etanol i minst to timer. I løpet av dette trinnet kan du forberede ytterligere lysbilder eller krom alum-gelatin i henhold til våre metoder.Gelatin kan deretter oppbevares i 60 graders badevann før bruk. For å belegge lysbilder, slipp en liten mengde gelatin på den ene kanten av lysbildet. Bruk deretter en annen glasssklie til å dra gelatinet langsomt og jevnt over overflaten av lysbildet som skal belegges.Dette skaper et tynt, jevnt lag. Før det legges i et stativ eller tørkeapparat som skal lagres i en ovn for å tillate full tørking i en annen natt eller 48 timer. Embryo samles ved hjelp av en druejuice agarplate, når den er klar, kan druejuice agarplaten fjernes.Oversvømme platen med PBS og pensle forsiktig med en myk børste for å fjerne eventuelle vedlagte embryoer. Fjern embryoet som inneholder PBS til et sentrifugerslange på 1,5 milliliter og la det hvile på is. Når embryoet er avgjort på is, fjern forsiktig den supernatante PBS.Vær forsiktig så du ikke forstyrrer embryoet nederst på røret. Tilsett 1 ml 50 % blekemiddel i prøven, og rist forsiktig i to minutter. Fjern blekemiddelet ved filtrering og vask embryoer i PBS tre ganger.Forbered n-heptane. Når du er klar, vask embryoene fra filterpapiret i n-heptane ved å riste filterpapiret forsiktig i løsningen. La embryoer bosette seg på bunnen av n-heptanplaten og samle denne n-heptane i et nytt 1,5 milliliter sentrifugerør.Tilsett en milliliter metanol i røret, la løsningen utfelle og aspirer deretter n-heptanmetan. Vask embryoet i PBS tre til fem ganger for å fjerne gjenværende metanol. Fjern denne ekstra PBS og legg til Bouins fikseringsmiddel og la det bosette seg i 30 til 60 minutter for å fikse embryoene.Fjern Bouins fikseringsmiddel og vask embryoene igjen i PBS tre ganger. Forbered 1,2% agarose i PBS og hold deg varm i et 60 graders vannbad, og forbered deretter embryoene for innebygging ved å forsiktig aspirere ekstra PBS som den er lagret i. Forsiktig så du ikke forstyrrer embryoene i bunnen, og aspirer deretter embryopluggen på bunnen av løsningen og legg forsiktig inn i en flaskehetteform.Aspirer eventuell ekstra PBS fra denne formen før du tilsetter 1,2% agarose gel. Forbered en løsning av PBS for å lagre disse agarose pluggene. Når agarose har størknet, kan individuelle plugger deretter flyttes inn i denne PBS for lagring.Her viser vi den sekvensielle dehydreringsprosessen. Tillater 15 minutter for inkubasjon hver gang. Fjern deretter fra 100% etanol og fikse i en en-til-en-løsning av etanol og xylen i ytterligere 15 minutter.Når den er fjernet fra denne en-til-en-løsningen, fjern den i ren xylen i ett minutt. Nå er vevsprøven klar til å flyttes inn i en oppvarmet en-til-en xylenparafinløsning. La sitte i 30 minutter før siste innebygging i 100% paraffin.Gå til den første av 100% paraffin og hvile i to timer. Gjenta denne prosessen i sine to og tre paraffiner. Prøven er nå klar til å flyttes inn i en form og formen fylt med voks for å fullføre innebyggingsprosessen.Innebygging av Drosophila embryoer. Plasser tilberedte parafinseksjoner av Drosophila embryoer i en 60 graders ovn i 15 minutter. Plasser dem i en 100% løsning av xylen.Så begynner vi å rehydrere. Plasser lysbildene i hver av disse løsningene i tre minutter hver. Når lysbildet er i destillert vann, plasser i hematoksylinoppløsningen i to minutter.Når du er ferdig, må du tømme så mye av løsningen som mulig fra lysbildet. Når skredet er vasket i destillert vann, kan du flekke lysbildet i eosin i ett minutt. Til slutt fjerner du lysbildet fra eosin og vasker i destillert vann.Når dette lysbildet er rent, begynner vi nå vår endelige dehydreringsprosess. Til slutt blir plassert i 100%xylen i fem minutter. Denne prosessen gjentas i to nye løsninger på 100 % xylen og slipper en liten mengde nøytral tyggegummi langs den ene kanten av lysbildet.Ta denne dekselslippet og plasser det forsiktig på den ene kanten av lysbildet. Deparaffiniser lysbildene først ved å plassere dem i 100 %xylen. Når lysbildene er fjernet fra destillert vann, bør de dekkes med 1% periodisk syreoppløsning.Vi kaster deretter overflødig løsning og skyller i destillert vann. Ved å plassere lysbildet direkte i en forvarmet løsning. Når dette er fullført, skyller vi lysbildet i destillert vann og fargetoner deretter løsningen med 0,2% gullklorid i ett til to minutter.Deretter fikser vi vevet med 3% natriumtiosulfat i tre minutter ved hjelp av destillert vann. Og så motvirker med hematoksylin. Etter motsendelse kan flekken vaskes med et av rørene med destillert vann som vist her.Så går vi videre til dehydreringsprosessen. Følg denne ved å plassere lysbildene direkte i 100 %xylen og deretter bruke en liten mengde nøytral tyggegummi på hjørnet av lysbildet. Dekk forsiktig med en dekselglidning.Begynn å forberede lysbildene som tidligere ved å deparaffinere og xylen. Og så i en-til-en xylen etanol. Når lysbildene er deparaffinert, begynner vi å rehydrere vevet og til slutt i PBS.Plasser lysbildene i 0,3% hydrogenperoksid laget i metanol i 10 minutter. Deretter dekkes lysbildene med 20 mLs målhentingsløsning. Lysbildene kan deretter plasseres i fargeboksen.Plasser flekketeboksen i en dampbåt, og sørg for at ingen løsning unnslipper og lysbildene fortsatt er helt dekket. Vær oppmerksom på at flekkbokslokket ikke skal være helt lukket slik at vanndamp kan unnslippe under dampprosessen. Og skyll deretter forsiktig i PBS-T tre ganger.Kast overflødig løsning og gjenta prosessen, denne gangen med PBS. Deretter inkuberer vi lysbildene i en peroksidblokk i fem til 10 minutter og skyller deretter flere ganger igjen i PBS-T og deretter i PBS. Forbered antistoffet og slipp direkte på vevet.Disse vevene kan deretter inkuberes eller ved romtemperatur i fire timer. Det sekundære antistoffet skal inkuberes ved romtemperatur i 90 minutter, som er farging med 5% DAB i to til 10 minutter. Etter at riktig farge er oppnådd, skyll i destillert vann, og deretter motvirke i hematoksylin.Etter denne hematoksylinflekken kan lysbildene deretter dehydreres sekvensielt. Plasser lysbildene i 100 %xylen og la det ligge i bløt i tre minutter. Slipp deretter små mengder nøytral tyggegummi på den ene kanten av lysbildet.Når en tyggegummi er plassert, tar du glidedekselet og plasserer forsiktig fra den ene kanten av lysbildet. Tilsett ett mikrogram renset linearisert mal-DNA til et sterilt RNase-fritt reaksjonshette hetteglass. Tilsett deretter nok sterilt RNase-fritt DEPC-behandlet dobbelt destillert vann til å lage et totalt prøvevolum på 13 mikroliter.Deretter sentrifugerer kort og inkuberer i to timer ved 37 grader Celsius. For RNase-beskyttelseseksperimenter anbefaler vi å inkubere i 15 minutter med to mikroliter Dnase-1, RNase-fri til å fjerne mal-DNA. Når inkubasjonstrinnet er fullført, Stopp reaksjonen ved å legge til to mikroliter 0,2 molar EDTA ved pH på åtte.Før trinnene viser her ble lysbildene deparaffinert og rehydrert, i henhold til vår tidligere demonstrerte protokoll. Etter rehydrering inkuber lysbildene i 0,01 mol per liter PBS ved pH på 7,4 i fem minutter hver for å fjerne den fikseringsløsningen fra vevet. Etter skylling i PBS skyller vi deretter med 100 millimolar per liter glycinoppløsning i fem minutter to ganger for å fjerne frie aldehydgrupper fra vevet.Etter dette trinnet, skyll lysbilder med PBS i fem minutter. Deretter inkuberer du i PBS som inneholder 0,3% triton X-100 i 15 minutter før skylling og deretter inkuberer igjen med ett mikrogram per mikroliter proteinase K.Next, fikse lysbilder med 4% paraformaldehyd og PBS ved pH på 7,2 i tre minutter. Vask deretter lysbildene før du inkuberer med 0,1 molar trietanolaminbuffer pH 8, som inneholder 0,25% eddiksyre.Du kan velge å vippe boksen på dette stadiet for å sikre full dekning med løsningen. Boksen fremstilles ved å legge til 20 % glyserol- eller DEPC-vann på bunnen av en tørr hybridiseringsboks. Deretter dekker lysbildene i 20 mikroliter pre hybridiseringsløsning.Laksens sæd-DNA i en konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter til hvert lysbilde. Og inkuber deretter ved 42 grader Celsius i fire timer. Dette gjøres i en forhåndsforberedt fuktet boks for å sikre at løsningen ikke tørker under denne prosessen.I posthybridiseringsfasen er det svært viktig at hybridiseringsløsningen skyller helt fra prøvene dine. Dette kan gjøres i påfølgende skyllinger på 15 minutter ved 37 grader, ved hjelp av fire ganger konsentrasjon SSC, to ganger konsentrasjon en ganger konsentrasjon, 0,5 ganger konsentrasjon og 0,1 ganger konsentrasjon SSC-løsning. Hver inkuberer i 15 minutter ved 37 grader Celsius.Etter at dette er gjort, vask med PBS tre ganger i fem minutter hver før du legger til vaskebufferen. Vaskebufferen skal skylles i ett minutt før neste trinn Sørg for at vaskebufferen er helt tørr fra skredene før du legger til neste løsning. Tilsett 100 milliliter blokkeringsløsning i hvert lysbilde og inkuber lysbildet i 30 minutter.Dette gjøres best i et lysfritt miljø for å sikre god farging. Deretter inkuber lysbildene i 30 minutter igjen i 20 mLs antistoffoppløsning. Påfør antistoffløsningen direkte på lysbilder for full dekning av vevet ditt.Når inkubasjonen er fullført, bruk 100 milliliter vaskebuffer. Inkuber i 15 minutter under lysfrie forhold for å fjerne ubundne antistoffkonjugater. Fjern vaskebufferen.Deretter bruker du 20 milliliter deteksjonsbuffer og får lov til å inkubere i omtrent fire minutter. Etter fire minutter fjerner du gjenkjenningsbufferen. Tørk lysbildene for å sikre ingen ekstra løsning og tilsett 10 milliliter nylagde fargesubstratløsning.Denne reaksjonen begynner i løpet av få minutter, men den er fullført etter 16 timer. Så la det inkubere i den perioden i en lysfri tilstand. Når de ønskede flekkene der bånd oppdages, vaskes lysbildet med 50 milliliter TE-buffer for å stoppe reaksjonen.Og fullfør deretter vår tidligere viste dehydreringsprosess og monteringsprosess for nøytral tyggegummi. Figur en og to demonstrerer krom aluminium gelatin beleggmetode for parafin seksjoner og innebyggingsmetoden for uttrykksprofil av FKBP12 og DmFKBP12 i utviklingen av Drosophila embryoer. Figur tre viser proteinfordelingen av antistoff som ble påvist FKBP12 ved de synytiale cellulære blastodermstadiene.Fra disse histokjemiske resultatene kan det ses at FKBP12-uttrykket er mindre polarisert i synytial blastoderm, og begynner deretter å lokalisere seg i kjellermembranen under trophectoderm epitel informerer gradienten med mer uttrykk som finnes i fremre og bakre poler. Figur fire, som følger de tidlige og sene gassrelasjonsstadiene i Drosophila-embryoet, viser at FKBP12-proteinet blir begrenset til visse arkitektoniske komponenter i det primitive embryonale vevet. Med mindre ekstracellulær fordeling enn det som ble observert i tidlige og sene gastro embryonale stadier.Interessant nok er ovennevnte dynamisk proteinfordeling ikke ledsaget av tilsvarende endringer i MR-nivåer av FKBP12 sett i figur fem. Indikerer proteinuttrykk som et resultat av en fortsatt ukjent posttranskripsjonell molekylær mekanisme. Ryanodinreseptormediert kalsiumsignalering er en grunnleggende vei i mange fysiologiske og patologiske prosesser av både virveldyr og hvirvelløse dyr.Mutasjoner i dette genet er kjent for å forårsake mange fysiologiske forstyrrelser som fører til sykdom eller tidlig hjertedød. Imidlertid har rollen dette genet spiller i tidlig Drosophila-utvikling vært vanskelig å studere. Som en transittkomponent i embryoet, lipidrikt embryo og chitinrik korion, gjør studier av protein og embryonal uttrykk i tidlig Drosophila-utvikling vanskelig.Lysbildebelegget, embryoinnbyggingen og immunhiistokjemiske teknikker beskrevet i dette papiret har gjort det mulig for oss å studere i detalj den dynamiske fordelingen av ryanodinreseptorprotein og mRNA. Vi deler disse teknikkene og håper at de vil tillate andre å studere andre proteiner i tidlige utviklingsstadier av Drosophila.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forstå Tidlig organogenesis hjelp av en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protocol i<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protokoller for Innhenting zygotiske og somatiske embryoer for å studere regulering av tidlig embryoutvikling i Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-skala forberedelse av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter for proteomiske eksperimenter

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode for å vurdere Drosophila melanogaster' s levedyktighet fra embryo til Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...