Name: generation of human neurons and oligodendrocytes from pluripotent stem cells for modeling neuron-oligodendrocyte interactions
Uploaded: 2020-11-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health (R00 AG054616 an Y.A.H. und T32 GM136566 an K.C.), der Stanford University School of Medicine und eines Siebel Fellowship (vergeben an S.C.) unterstützt. Y.A.H. ist DaF Translational Professor am Center for Translational Neuroscience am Brown Institute for Translational Sciences.

1. Induktion menschlicher Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen
<ol><li>Lentivirus-Vorbereitung (~5 Tage, detailliertes Protokoll wie zuvor beschrieben16)<ol><li>Platte ~ 1 Million HEK293T-Zellen jeder T75-Kolben, um sie ~ 40% konfluent zu haben, wenn Transfektion durchgeführt wird. Transfizieren Sie sie mit Plasmiden, die Tetracyclin-induzierbares Ngn2 und puromycin-resistentes Gen (PuroR; unter derselben TetO-Promotorkontrolle), rtTA und die drei Helferplasmide pRSV-REV, pMDLg/pRRE u...

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	<li>Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+glial+cell+numbers+in+human+brains.">Neocortical glial cell numbers in human brains.</a> Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).</li><li>Barres, B. 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(149), (2019).</li><li>Douvaras, P., Fossati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+isolation+of+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelinating+oligodendrocytes+in+human+cortical+spheroids.">Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids.</a> Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Grubman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+entorhinal+cortex+from+individuals+with+Alzheimer's+disease+reveals+cell-type-specific+gene+expression+regulation.">A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).</li><li>Goldman, S. A., Kuypers, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+an+oligodendrocyte.">How to make an oligodendrocyte.</a> Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).</li><li>Behrendt, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+myelin+aberrations+and+oligodendrocyte+generation+in+chronic+amyloidosis+in+mice+and+men.">Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men.</a> Glia. 61 (2), 273-286 (2013).</li><li>Patzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulator+signaling+bidirectionally+controls+vesicle+numbers+in+human+synapses.">Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses.</a> Cell. 179 (2), 498-513 (2019).</li><li>Piao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitors+remyelinate+the+brain+and+rescue+behavioral+deficits+following+radiation.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).</li><li>Keirstead, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+OPC-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+for+treating+spinal+cord+injury.">Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).</li></ol>

Neben der physikalischen und metabolischen Unterstützung zur Stabilisierung der Synapsenstrukturen und zur Erleichterung der salzatorischen Signalleitung durch Myelinisierung können Oligodendrozyten-Linienzellen neuronale Aktivitätsmuster durch schnelle und dynamische Cross-Talks mit Neuronen 5,6,7 formen. Während in der AD-Pathologie die oligodendroglialen Reaktionen zunächst lediglich als sekundär zu Entzündungen und ox...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>.&#160;The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig03.jpg" /> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs.&#160;(A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2.png" /> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs.&#160;(A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded.&#160;(E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The fourth&#160;paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).&#160;The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure&#160;3E and 3F).&#160;

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>.&#160;The Representative Results section has been updated.

Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Oligodendrozyten-Linienzellen – einschließlich Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), myelinisierende Oligodendrozyten und Übergangstypen dazwischen – bilden eine Hauptgruppe menschlicher Gehirnzellen1, die aktiv an vielen kritischen Funktionen für den ordnungsgemäßen Betrieb und die Aufrechterhaltung unseres zentralen Nervensystems während der neuronalen Entwicklung und des Alterns beteiligtsind 2,3,4 . Während Oligodendrozyten dafür bekannt sind, Myelin zu produzieren, um die Übertragung neuronaler Aktivität zu erleichtern und die axonale Gesundheit in der weißen Substanz zu unterstützen, sind OPCs reichlich vorhanden (~ 5%) in der grauen Substanz, wo Myelinisierung knapp ist und aktivitätsabhängige Signalfunktionen ausführen, um das Lernverhalten und die Gedächtnisbildung zu steuern 5,6,7,8 . Wie oligodendrogliale Zellen funktionieren und dysfunktional in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen ist zu wenig untersucht9. Die Unzulänglichkeiten eines geeigneten Modellsystems und Defizite im Allgemeinwissen, um einen experimentellen Weg nach vorne zu leiten, sind die Hauptgründe für diese Lücke.
Angesichts der jüngsten Durchbrüche bei der Gewinnung menschlicher Gehirnzellen aus pluripotenten Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), haben sich solche zellulären Modelle in Verbindung mit modernen Gen-Editing-Tools als robuste Werkzeuge zur Handhabung des komplizierten Nexus zellulärer Interaktionen im Gehirn erwiesen und sind in der Lage, humanspezifische Krankheitsmanifestationennachzuweisen10. 11. In Anbetracht der Tatsache, dass einzelne Gehirnzelltypen angesichts der gleichen AD-fördernden Bedingungen unterschiedliche und sogar widersprüchliche Wirkungen zeigen können12,13, bietet diese Stammzellmethodik auf einzigartige Weise zelltypspezifische Informationen, die zuvor unter Verwendung etablierter In-vivo- oder In-vitro-Modelle, die nur aggregierte Messwerte aus Sammlungen von Gehirnzelltypen liefern, übersehen wurden. In den letzten zehn Jahren wurde eine große Anzahl zuverlässiger Protokolle entwickelt, um menschliche Neuronen aus Transdifferenzierung von ES/iPS-Zellen oder direkter Umwandlung aus anderen terminaldifferenzierten Zelltypen (z. B. Fibroblasten) zu erzeugen14,15. Insbesondere die Anwendung wichtiger neurogener Transkriptionsfaktoren (z.B. Neurogenin 2, Ngn2)16 auf humane pluripotente Stammzellen kann eine homogene Population gut charakterisierter neuronaler Zelltypen für Reinkulturen erzeugen, ohne dass eine Kokulturierung mit Gliazellen erforderlich ist12,17,18. Für induzierte menschliche Oligodendrozyten gibt es einige veröffentlichte Protokolle, die funktionelle Zellen erzeugen können, die ihren primären Gegenstücken sehr ähnlich sind, mit einer breiten Palette von Effizienz und Bedarf an Zeit und Ressourcen 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Bisher wurde keines dieser Protokolle angewendet, um zu untersuchen, wie oligodendrogliale Zellen auf die AD-Pathogenese reagieren und diese beeinflussen.
Hier beschreiben wir unsere verbesserten Protokolle für Einzel- und Mischkulturen von humaninduzierten Neuronen (iNs) und OPCs/Oligodendrozyten (iOPCs/iOLs). Das hier beschriebene iN-Protokoll basiert auf dem weit verbreiteten Ngn2-Ansatz16 und hat zusätzlich die Eigenschaft, gliafrei zu sein. Die resultierenden iNs sind homogen und ähneln stark den exzitatorischen Neuronen der kortikalen Schicht 2/3 mit charakteristischer pyramidaler Morphologie, Genexpressionsmuster und elektrophysiologischen Merkmalen17,18 (Abbildung 1). Um einige der grundlegenden Barrieren bei der gerichteten Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu überwinden, haben wir eine einfache und effektive Methode der Vorbehandlung von niedrig dosiertem Dimethylsulfoxid (DMSO) entwickelt29,30 und berichteten über eine erhöhte Neigung menschlicher ES/iPS-Zellen, in iOPCs und iOLs31 zu transdifferenzieren, basierend auf einem weitgehend angepassten Protokoll von Douvaras und Fossati 32 . Wir haben das Protokoll weiter vereinfacht und eine robuste differenzierungsfördernde Verbindung, Clemastin 7,33,34, integriert, um den Prozess der oligodendroglialen Reifung zu beschleunigen. Als Ergebnis (Abbildung 2) können die iOPCs in 2 Wochen (~95% positiv für den Marker O4) und iOLs in vier Wochen (exprimierend für reife Marker MBP und PLP1) generiert werden. Interessanterweise fanden wir heraus, dass iOPCs allein eine bemerkenswerte Menge an Amyloid-β (Aβ) sezernieren, was mit den unabhängigen transkriptomischen Daten übereinstimmt, die die reichliche Expression des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und der Verarbeitungsprotease β-Sekretase (BACE1) in Oligodendrozyten-Linienzellen35,36 zeigen. Darüber hinaus fördert unser iN-iOPC-Kokultursystem die Umhüllung von Axonen durch MBP-positive iOL-Prozesse und bietet eine signifikante Unterstützung für die Synapsenbildung (Abbildung 3). Daher haben die Protokolle, die wir unten beschrieben haben, technische und biologische Vorteile gegenüber zuvor katalogisierten Neuron-Oligodendroglia-Co-Kultivierungsmethoden und versprechen eine bessere Modellierung der Neurodegeneration bei AD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PHG 0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clemastine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SML0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D3072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1 human ES cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-AA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>221-AA-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71002-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff SMADi Neural Induction Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>8581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 triiodothyronine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs</td>
			<td>Tempo BioScience</td>
			<td>SKU102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetO-Ng2-Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human neurons and oligodendrocytes from pluripotent stem cells for modeling neuron-oligodendrocyte interactions

Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ist das oligodendrogliale Versagen ein häufiges frühes pathologisches Merkmal, aber wie es zur Entwicklung und Progression der Krankheit beiträgt, insbesondere in der grauen Substanz des Gehirns, bleibt weitgehend unbekannt. Die Dysfunktion von Oligodendrozyten-Linienzellen ist gekennzeichnet durch Mängel in der Myelinisierung und eine gestörte Selbsterneuerung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs). Diese beiden Defekte werden zumindest teilweise durch die Störung der Interaktionen zwischen Neuronen und Oligodendrozyten während des Aufbaus der Pathologie verursacht. OPCs führen während der ZNS-Entwicklung zu myelinisierenden Oligodendrozyten. In der reifen Hirnrinde sind OPCs die wichtigsten proliferativen Zellen (die ~5% der gesamten Gehirnzellen ausmachen) und kontrollieren die Neubildung von Myelin in Abhängigkeit von der neuronalen Aktivität. Solche Neuron-zu-Oligodendrozyten-Kommunikationen sind insbesondere im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie AD aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen deutlich unteruntersucht. In den letzten Jahren haben unsere Gruppe und andere bedeutende Fortschritte bei der Verbesserung der derzeit verfügbaren Protokolle zur individuellen Erzeugung funktioneller Neuronen und Oligodendrozyten aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gemacht. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere optimierten Verfahren, einschließlich der Etablierung eines Kokultursystems zur Modellierung der Neuron-Oligodendrozyten-Verbindungen. Unsere illustrativen Ergebnisse deuten auf einen unerwarteten Beitrag von OPCs / Oligodendrozyten zur Amyloidose und Synapsenintegrität des Gehirns hin und unterstreichen den Nutzen dieser Methodik für die AD-Forschung. Dieser reduktionistische Ansatz ist ein mächtiges Werkzeug, um die spezifischen heterozellulären Interaktionen aus der inhärenten Komplexität im Gehirn zu sezieren. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Protokolle zukünftige Studien zu oligodendroglialen Defekten in der Pathogenese der Neurodegeneration erleichtern.

Direkte Erzeugung von humaninduzierten Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen Es ist sehr wichtig, dass die startenden humanen pluripotenten Stammzellen einen hohen Grad an Pluripotenz für die erfolgreiche Erzeugung von iNs oder iOPCs/iOLs aufweisen. Daher sollten Zellen auf bestimmte Marker wie Oct4 und SOX2 gefärbt werden, bevor eines der im vorliegenden Manuskript beschriebenen Induktionsprotokolle gestartet wird (Abbildung 1A). Menschliche H1-Zellen wurden v...

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Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...