Name: generation of human neurons and oligodendrocytes from pluripotent stem cells for modeling neuron-oligodendrocyte interactions
Uploaded: 2020-11-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R00 AG054616 для Y.A.H. и T32 GM136566 для K.C.), Медицинской школы Стэнфордского университета и стипендии Siebel (присуждается S.C.). Y.A.H. является профессором трансляции GFL из Центра трансляционной неврологии в Институте трансляционных наук Брауна.

1. Индукция нейронов человека из плюрипотентных стволовых клеток человека
<ol><li>Препарат лентивируса (~5 дней, подробный протокол, как описано ранее16)<ol><li>Пластина ~ 1 миллион HEK293T клеток в каждой колбе T75, чтобы иметь их ~ 40% слива при выполнении трансфекции. Трансфектируйте их ...

<ol>
	<li>Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+glial+cell+numbers+in+human+brains.">Neocortical glial cell numbers in human brains.</a> Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+phase+of+Alzheimer's+disease.">The cellular phase of Alzheimer's disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+plasticity+and+nervous+system+function.">Myelin plasticity and nervous system function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+remodeling+through+experience-dependent+oligodendrogenesis+in+the+adult+somatosensory+cortex.">Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344 (6183), 1252304 (2014).</li><li>Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+a+remote+fear+memory+requires+new+myelin+formation.">Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation.</a> Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).</li><li>Thornton, M. A., Hughes, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-oligodendroglia+interactions:+Activity-dependent+regulation+of+cellular+signaling.">Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling.</a> Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).</li><li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+and+myelin+in+neurodegenerative+diseases:+more+than+just+bystanders.">Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li><li>Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Alzheimer's+disease+with+human+iPS+cells:+advancements,+lessons,+and+applications.">Modeling Alzheimer's disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+mutations+in+astrocytes+impair+oligodendrocyte+progenitor+proliferation+and+myelination+in+an+hiPSC+model+of+Alexander+disease.">GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease.</a> Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APOE4+causes+widespread+molecular+and+cellular+alterations+associated+with+Alzheimer's+disease+phenotypes+in+human+iPSC-derived+brain+cell+types.">APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types.</a> Neuron. 98 (6), 1294 (2018).</li><li>TCW, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+matrisome+pathways+dysregulated+in+human+APOE+&#949;4+glia.">Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE &#949;4 glia.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Ang, C. E., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+reprogramming.">Induced neuronal reprogramming.</a> Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).</li><li>Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Alzheimer's+disease+with+iPSC-derived+brain+cells.">Modeling Alzheimer's disease with iPSC-derived brain cells.</a> Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+mediated+by+ApoE2,+ApoE3,+and+ApoE4+in+human+neurons+parallels+Alzheimer's+Disease+risk.">Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer's Disease risk.</a> Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).</li><li>Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE2,+ApoE3,+and+ApoE4+Differentially+Stimulate+APP+Transcription+and+Abeta+Secretion.">ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion.</a> Cell. 168 (3), 427-441 (2017).</li><li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion.">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+myelinating+oligodendrocytes+from+primary+progressive+multiple+sclerosis+patients+by+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).</li><li>Lee, E. H., Park, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reprogramming+methods+for+generation+of+induced-oligodendrocyte+precursor+cells.">Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).</li><li>Ehrlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+generation+of+oligodendrocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+transcription+factors.">Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).</li><li>Rodrigues, G. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+scalable+differentiation+of+human+oligodendrocyte+precursors+from+pluripotent+stem+cells+in+a+3D+culture+system.">Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).</li><li>Izrael, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+derived+from+embryonic+stem+cells:+Effect+of+noggin+on+phenotypic+differentiation+in+vitro+and+on+myelination+in+vivo.">Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+dissociated+monolayer+and+feeder-free+cultured+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+oligodendrocyte+progenitor+cells+can+myelinate+and+rescue+a+mouse+model+of+congenital+hypomyelination.">Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).</li><li>Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+derived+oligodendrocytes+to+study+myelin+diseases.">Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases.</a> Glia. 68 (4), 705-720 (2020).</li><li>Chetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+tool+to+improve+pluripotent+stem+cell+differentiation.">A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation.</a> Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+DMSO+treatment+increases+the+differentiation+potential+of+human+pluripotent+stem+cells+through+the+Rb+family.">A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family.</a> PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).</li><li>Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+treatment+of+human+pluripotent+stem+cells+with+DMSO+to+promote+differentiation.">Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).</li><li>Douvaras, P., Fossati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+isolation+of+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelinating+oligodendrocytes+in+human+cortical+spheroids.">Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids.</a> Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Grubman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+entorhinal+cortex+from+individuals+with+Alzheimer's+disease+reveals+cell-type-specific+gene+expression+regulation.">A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).</li><li>Goldman, S. A., Kuypers, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+an+oligodendrocyte.">How to make an oligodendrocyte.</a> Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).</li><li>Behrendt, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+myelin+aberrations+and+oligodendrocyte+generation+in+chronic+amyloidosis+in+mice+and+men.">Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men.</a> Glia. 61 (2), 273-286 (2013).</li><li>Patzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulator+signaling+bidirectionally+controls+vesicle+numbers+in+human+synapses.">Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses.</a> Cell. 179 (2), 498-513 (2019).</li><li>Piao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitors+remyelinate+the+brain+and+rescue+behavioral+deficits+following+radiation.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).</li><li>Keirstead, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+OPC-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+for+treating+spinal+cord+injury.">Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).</li></ol>

В дополнение к физической и метаболической поддержке для стабилизации синапсных структур и облегчения проведения соляного сигнала путем миелинизации, клетки линии олигодендроцитов могут формировать паттерн активности нейронов посредством быстрых и динамических перекрестных разго...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>.&#160;The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig03.jpg" /> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs.&#160;(A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2.png" /> 
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs.&#160;(A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded.&#160;(E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61778/61778fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The fourth&#160;paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs 
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).&#160;The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure&#160;3E and 3F).&#160;

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61778/generation-human-neurons-oligodendrocytes-from-pluripotent-stem-cells">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions</a>.&#160;The Representative Results section has been updated.

Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Клетки линии олигодендроцитов, включая клетки-предшественники олигодендроцитов (OPCs), миелинирующие олигодендроциты и переходные типы между ними, составляют основную группу клеток головного мозга человека1, которые активно участвуют во многих критических функциях для правильной работы и поддержания нашей центральной нервной системы на протяжении всего нервного развития и старения 2,3,4 . В то время как олигодендроциты хорошо известны тем, что производят миелин для облегчения передачи активности нейронов и поддержки здоровья аксонов в белом веществе, OPC в изобилии (~ 5%) в сером веществе, где миелинизация скудна, и выполняют зависящие от активности сигнальные функции для управления поведением обучения и формированием памяти 5,6,7,8 . Как функционируют олигодендроглиальные клетки и дисфункция в патогенезе болезни Альцгеймера (БА) и других возрастных нейродегенеративных состояний, было недостаточно изучено9. Недостатки соответствующей модельной системы и недостатки в общих знаниях, позволяющих направлять экспериментальный путь вперед, являются основными причинами этого разрыва.
В свете последних прорывов в получении клеток человеческого мозга из плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые (ES) и индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, такие клеточные модели в сочетании с современными инструментами редактирования генов стали надежными инструментами для обработки сложной связи клеточных взаимодействий в мозге и способны демонстрировать специфические для человека проявления заболеваний10, 11. Учитывая, что отдельные типы клеток мозга могут проявлять различные и даже противоречивые эффекты перед лицом одних и тех же условий, способствующих АД12,13, эта методология стволовых клеток однозначно предлагает информацию, специфичную для типа клеток, которая ранее была пропущена с использованием установленных моделей in vivo или in vitro, которые обеспечивают только агрегированные показания из коллекций типов клеток мозга. В последнее десятилетие было разработано большое количество надежных протоколов для генерации нейронов человека из трансдифференцировки ES/iPS-клеток или прямого преобразования из других терминально дифференцированных типов клеток (например, фибробластов)14,15. В частности, применение ключевых нейрогенных факторов транскрипции (например, нейрогенина 2, Ngn2)16 к плюрипотентным стволовым клеткам человека может генерировать однородную популяцию хорошо охарактеризованных типов нейрональных клеток для чистых культур без необходимости кокультурирования с глиальными клетками 12,17,18. Для индуцированных человеческих олигодендроцитов существует несколько опубликованных протоколов, которые могут генерировать функциональные клетки, очень похожие на их первичные аналоги, с широким диапазоном эффективности и спроса во времени и ресурсах 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . На сегодняшний день ни один из этих протоколов не был применен для исследования того, как олигодендроглиальные клетки реагируют и влияют на патогенез БА.
Здесь мы описываем наши улучшенные протоколы для одиночных и смешанных культур индуцированных человеком нейронов (iNs) и OPCs / олигодендроцитов (iOPCs / iOL). Протокол iN, описанный здесь, основан на широко используемом подходеNgn2 16 и имеет дополнительную особенность быть свободным от глии. Полученные iNs однородны и очень напоминают кортикальный слой 2/3 возбуждающих нейронов, с характерной пирамидальной морфологией, паттерном экспрессии генов и электрофизиологическими особенностями17,18 (Рисунок 1). Чтобы преодолеть некоторые из фундаментальных барьеров в направленной дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток, мы разработали простой и эффективный метод предварительного лечения низкими дозами диметилсульфоксида (DMSO)29,30 и сообщили о повышенной склонности человеческих ES/iPS-клеток к трансдифференциации в iOPCs и iOL31, основанный на широко адаптированном протоколе Douvaras и Fossati32. . Мы еще больше упростили протокол и включили надежное соединение, способствующее дифференцировке, клемастин 7,33,34, для ускорения процесса созревания олигодендроглии. В результате (рисунок 2) iOPC могут быть сгенерированы за 2 недели (~95% положительных для маркера O4) и iOL за четыре недели (экспрессируя зрелые маркеры MBP и PLP1). Интересно, что мы обнаружили, что только iOPCs секретируют значительное количество β амилоида (Aβ), что согласуется с независимыми транскриптомными данными, показывающими обильную экспрессию белка-предшественника амилоида (APP) и обработку протеазы β-секретазы (BACE1) в клетках линии олигодендроцитов35,36. Кроме того, наша система кокультуры iN-iOPC способствует оболваниванию аксонов MBP-положительными процессами iOL и обеспечивает значительную поддержку образования синапсов (рисунок 3). Таким образом, протоколы, которые мы подробно описали ниже, имеют технические и биологические преимущества по сравнению с ранее каталогизированными методами совместного культивирования нейронов и олигодендроглии и имеют перспективу в лучшем моделировании нейродегенерации при БА.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PHG 0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clemastine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SML0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D3072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1 human ES cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR plus</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-AA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>221-AA-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71002-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff SMADi Neural Induction Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>8581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 triiodothyronine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs</td>
			<td>Tempo BioScience</td>
			<td>SKU102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetO-Ng2-Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human neurons and oligodendrocytes from pluripotent stem cells for modeling neuron-oligodendrocyte interactions

При болезни Альцгеймера (БА) и других нейродегенеративных расстройствах олигодендроглиальная недостаточность является общей ранней патологической особенностью, но как она способствует развитию и прогрессированию заболевания, особенно в сером веществе мозга, остается в значительной степени неизвестным. Дисфункция клеток линии олигодендроцитов характеризуется недостатками миелинизации и нарушением самообновления клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК). Эти два дефекта вызваны, по крайней мере частично, нарушением взаимодействия между нейронами и олигодендроцитами вдоль накопления патологии. ОПК дают начало миелинизации олигодендроцитов во время развития ЦНС. В зрелой коре головного мозга OPC являются основными пролиферативными клетками (составляющими ~ 5% от общего количества клеток мозга) и контролируют образование новых миелинов в зависимости от нейронной активности. Такие нейронно-олигодендроцитарные коммуникации значительно недоизучены, особенно в контексте нейродегенеративных состояний, таких как БА, из-за отсутствия соответствующих инструментов. В последние годы наша группа и другие добились значительного прогресса в улучшении доступных в настоящее время протоколов для генерации функциональных нейронов и олигодендроцитов индивидуально из плюрипотентных стволовых клеток человека. В этой рукописи мы описываем наши оптимизированные процедуры, включая создание системы кокультуры для моделирования нейронно-олигодендроцитарных связей. Наши иллюстративные результаты свидетельствуют о неожиданном вкладе OPCs / олигодендроцитов в амилоидоз мозга и целостность синапсов и подчеркивают полезность этой методологии для исследований БА. Этот редукционистский подход является мощным инструментом для препарирования специфических гетероклеточных взаимодействий из присущей сложности внутри мозга. Ожидается, что протоколы, которые мы описываем здесь, облегчат будущие исследования олигодендроглиальных дефектов в патогенезе нейродегенерации.

Прямая генерация индуцированных человеком нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток Очень важно, чтобы исходные плюрипотентные стволовые клетки человека проявляли высокую степень плюрипотентности для успешной генерации iNs или iOPCs / iOL. Поэтому клетки должны...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions at JoVE.com

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Нейронно-глиальные взаимодействия при нейродегенерации недостаточно изучены из-за неадекватных инструментов и методов. Здесь мы описываем оптимизированные протоколы для получения индуцированных нейронов, клеток-предшественников олигодендроцитов и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека и приводим примеры значений этих методов в понимании специфических для типа клеток вклада в болезнь Альцгеймера.

Генерация нейронов человека и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток для моделирования нейронно-олигодендроцитарных взаимодействий

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Поколение олигодендроцитов и олигодендроцитов-кондиционированных средних для совместно-культурных экспериментов

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...