Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Tom Kirby, Scott Gabel, og Dr. Robert London for deres hjælp og bistand i hele dette arbejde, sammen med Dr. Bob Petrovich og Lori Edwards for brugen af deres instrumentering og deres bistand til at generere Bla g 1 konstruktioner ansat i denne undersøgelse. Vi takker Andrea Adams for hjælp med massespektrometrien og Dr. Eugene DeRose for hjælp til NMR-instrumenteringen. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Environmental Health Sciences.

1. Bla g 1 kloning
<ol><li>Få gen til kakerlak allergen Bla g 1.0101 (rester 34-216), der repræsenterer en enkelt gentagelse af MA domænet. For nemheds skyld vil Bla g 1 blive brugt i hele værket til at repræsentere denne ene gentagelse i stedet for hele Bla g 1.0101-udskriften.</li>
	<li>Underengen Bla g 1 ind i den ønskede vektor. I denne undersøgelse blev genet, der indeholder et N-terminal glutathion S-transferase (GST) tag koblet til en tobaksethisk virus (TEV) protease kavalergang site ind...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, er blevet anvendt til systematisk at undersøge Bla g 1's lipidbindingsegenskaber. Dette afslørede en sammenhæng mellem lastbinding, termo ustabilitet og endosomal behandling, hvoraf sidstnævnte var korreleret med fald i genereringen af en kendt T-celle epitop med potentielle konsekvenser for immunogenicitet9,18. Ud over Bla g 1 har andre allergener som Pru p 3 og Bet v 1 vist sig at bevare deres endogene laster ...

En undersøgelse af allergendatabasen afslører, at allergener findes i kun 2% af alle kendte proteinfamilier, hvilket tyder på, at almindelige funktionelle og biofysiske egenskaber bidrager til allergenicitet1. Af disse egenskaber synes evnen til at binde lipidfragter at være stærkt overrepræsenteret blandt allergener, hvilket tyder på, at disse laster kan påvirke sensibiliseringsprocessen1. Faktisk har det vist sig, at Brasilien Nut allergen Ber e 1 kræver co-administration med sin endogene lipid at realisere sin fulde sensibilisere potentiale2. Disse lipider kan potentielt stimulere immunsystemet direkte som illustreret af mide allergener Der p 2 og Der p 7, som begge deler en stærk strukturel homologi med LPS-bindende proteiner3,4,5. Baseret på denne observation blev det foreslået, at Derp 2 og Der p 7 kunne binde bakterielle lipider og direkte stimulere værts immunsystemet gennem TLR4-medieret signalering, hvilket letter sensibiliseringsprocessen5,6. Det er også muligt, at endogene bundet lipider kunne ændre de biofysiske egenskaber af allergifremkaldende proteiner selv. For eksempel forbedrede Sin a 2 (sennep) og Ara h 1 (jordnødder) evne til at interagere med fosfor vesikler betydeligt deres modstand mod gastrisk og endosomal nedbrydning7, mens ligand binding til det store birk pollenallergener Bet v 1 ændrede både hastigheden af endosomal behandling og mangfoldigheden af de resulterende peptider8. Dette er især relevant for allergenicitet i betragtning af den korrelation, der er observeret mellem stabilitet, T-celle epitop generation og allergenicitet for proteiner som Bet v 1 og Bla g 1; sidstnævnte vil blive genstand for dette arbejde9,10.
Bla g 1 repræsenterer det prototypiske medlem af insektet Major Allergen (MA) proteinfamilie og har en unik struktur bestående af 12 amfipatiske alfabæger, der omslutter et unormalt stort hydrofobisk hulrum9,11. Den tilgængelige røntgenkrystalstruktur i Bla g 1 viser elektrontætheden inden for dette hulrum i overensstemmelse med bundne fosfor- eller fedtsyreligler; en formodning bekræftet af 31P-NMR og massespektrometri. Disse laster var heterogene i naturen, og deres sammensætning var stærkt afhængig af allergenkilden, med forskellige lipidprofiler observeret for rekombinant Bla g 1 udtrykt i E. coli og P. pastoris. Mærkeligt nok indeholdt Bla g 1 renset fra sin naturlige allergenkilde (kakerlak frass) overvejende fedtsyrer inden for dets bindende sted, med en blanding af palmitate, oleat og stearit identificeret som dets "naturlige" ligands9,11. Bla g 1's evne til at fastholde lipider og fedtsyrer efter flere rensningstrin hindrer bestræbelserne på at studere proteinet isoleret. Omvendt er det blevet foreslået, at den naturlige palmitate, stearit, og oleate ligands af Bla g 1 (fremover benævnt nMix) spiller en central rolle i både dens allergenicitet og indfødte biologiske funktion9. Disse ligands er imidlertid ikke til stede i Bla g 1 fra rekombinant kilder, hvilket gør det vanskeligt at vurdere denne hypotese. Lignende problemer er blevet observeret for andre lipidbinding allergener såsom Bet v 112,13. For at lette den systematiske undersøgelse af lipid-allergen interaktioner har vi udviklet en protokol, hvorigennem allergener kan kvantitativt fratages deres endogene bundet lipider og rekonstitueres i enten Apo-form eller fyldt med specifikke ligands.
Allergener er oftest renset fra deres naturlige eller rekombinante kilder ved hjælp af affinitet kromatografi og / eller størrelse-udelukkelse kromatografi. Her introducerer vi et ekstra rensningstrin i form af højtydende væskekromatografi (HPLC), der anvender en omvendt fase C18-kolonne, hvorfra allergenet er udråbt til et organisk opløsningsmiddel svarende til protokoller udviklet til fedtsyrebindingsproteiner14. Det resulterende protein udsættes derefter for et termisk udglødningstrin i mangel af eller tilstedeværelse af fedtsyrer og/eller fosfolipider. Ud over at genvinde den oprindelige Bla g 1 fold, øger de forhøjede temperaturer opløseligheden og tilgængeligheden af lipidlasterne, hvilket giver Bla g 1 i enten Apo-formen eller ensartet fyldt med den ønskede hydrofobe ligand. 31 år P-NMR spektre af Bla g 1 renset på denne måde bekræftede fuldstændig fjernelse af endogene bundet ligands og ensartet udskiftning med de ønskede forbindelser, mens cirkulær dichroism bekræftede en vellykket inddrivelse af Bla g 1 fold. Nytten af denne metode er fremhævet i et nyligt arbejde, hvor lastbinding blev fundet for at forbedre Bla g 1 termo ustabilitet og proteolytisk modstand, ændre kinetik af T-celle epitop generation med potentielle konsekvenser for sensibilisering og allergenicitet9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Mange større allergener binder sig til hydrofobe lipidlignende molekyler, herunder Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 og Fel d 1. Disse ligands er stærkt bevaret og har potentiale til at påvirke sensibiliseringsprocessen enten ved direkte at stimulere immunsystemet eller ændre de biofysiske egenskaber af det allergifremkaldende protein. For at kunne kontrollere for disse variabler kræves der teknikker til fjernelse af endogene bundne ligands og om nødvendigt udskiftning med lipider af kendt sammensætning. Kakerlakallergeneret Bla g 1 omslutter et stort hydrofobisk hulrum, der binder en heterogen blanding af endogene lipider, når de renses ved hjælp af traditionelle teknikker. Her beskriver vi en metode, hvorigennem disse lipider fjernes ved hjælp af omvendt fase HPLC efterfulgt af termisk udglødning for at give Bla g 1 i enten sin Apo-form eller genindlæses med en brugerdefineret blanding af fedtsyrer eller fosforlastningslaster. Koblingen af denne protokol med biokemiske assays viser, at fedtsyrelaster i væsentlig grad ændrer termo ustabiliteten og proteolytisk resistens hos Bla g 1 med nedstrømsvirkninger for satsen for T-celle epitopdannelse og allergenicitet. Disse resultater fremhæver vigtigheden af lipid fjernelse / ladning protokoller som den, der er beskrevet heri, når de studerer allergener fra både rekombinant og naturlige kilder. Protokollen er generaliserbar for andre allergen familier, herunder lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) og Uteroglobin (Fel d 1), hvilket giver et værdifuldt redskab til at studere lipiders rolle i den allergiske reaktion.

Ved hjælp af affinitetskromatografi blev rekombinant GST-Bla g 1 let isoleret til et højt renhedsniveau (figur 1A), hvilket gav et udbytte på ~2-4 mg/l cellekultur. Inkubation natten over med TEV-protease ved 4 °C er tilstrækkelig til at fjerne GST-mærket, hvilket giver det endelige produkt ved ~24 kDa. Bemærk, at der i dette tilfælde er en betydelig mængde GST-Bla g 1 i gennemstrømnings- og vaskefraktionerne, hvilket tyder på, at glutathionharpiksbindingskapaciteten blev overskredet. Brugen a...

Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Denne protokol beskriver fjernelsen af endogene lipider fra allergener og deres erstatning med brugerspecifikke ligands gennem omvendt fase HPLC kombineret med termisk udglødning. 31 år P-NMR og cirkulær dichroism giver mulighed for hurtig bekræftelse af ligand fjernelse / lastning, og inddrivelse af indfødte allergen struktur.

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Mange allergener binder hydrofobe molekyler. Denne protokol gør det muligt at fjerne og erstatte disse ligands fuldstændigt, så vi kan studere deres indvirkning på struktur og immunogenicitet på en systematisk måde. Brugen af omvendt fase HPLC, kombineret med termisk udglødning, har to fordele.Det fjerner endogene ligands, og det hjælper med at opløse ligands for at åbne ellers utilgængelige bindingssteder. Hvis vi kan bestemme de faktorer, der bidrager til allergenicitet, kan vi være i stand til at designe terapier, der undgår disse faktorer. Mange proteiner binder lipid ligands, som er stærkt bevaret og kan påvirke både struktur og funktion.Vores metode gør det muligt systematisk at studere disse interaktioner. Den begrænsede opløselighed og tilgængelighed af mange lipidlaster kan hæmme lasteprocessen. Sørg for at tage sig af, når du forbereder disse ligands, og at overveje behovet for systemspecifikke tilpasninger.Da arbejde med hydrofobe og uopløselige ligands er en justering for nogle allergikere og biokemikere, kan det være nyttigt at se, hvordan prøverne ser ud på forskellige stadier. Efter kloningsudtryk og rensning påføres 12 milliliter af den kløvede Bla g 1 på en centrifugalfilterenhed med en skæring på mindre end 10 kilodalton molekylvægt for flere centriifugeringer i en svingspandrotor, indtil det samlede volumen er reduceret til mindre end to milliliter. Det resulterende koncentrat indlæses på et 250 gange 10 mm HPLC-system udstyret med et C18-chromatografikolonne ekvilibreret med 97%buffer A og 3%buffer B.Elute Bla g 1 ved en 1,5 til 4 milliliter pr. minut-strømningshastighed, som angivet i tabellen, ved hjælp af fluorescensabsorpturen ved 280 nanometer til overvågning af elueringsprocessen.Fra ca. 34 til 40 minutter og en buffer B-koncentration på over 74% indsamles højst fire milliliter af hver Bla g 1-fraktion. Aliquot den samlede Bla g 1 fraktion i glas reagensglas. Dæk rørene med paraffinfilm og perforere filmen med to huller.Derefter fryses prøverne ved minus 80 grader Celsius i en time og brug en lyophilizer til at tørre de resulterende de-lipiderede proteinprøver. For at bestemme det forventede Bla g 1-udbytte skal du suspendere en lyofiliseret de-lipideret test-aliquot i fem milliliter refoldingsbuffer. Blandingen opvarmes i et 500 milliliter bægerglas, der indeholder 250 milliliter vand til 95 grader Celsius på en kogeplade med omrøring og intermitterende hvirvelstrøm.Hold opløsningen ved 95 grader i 30 til 60 minutter, før du lader vandbadet langsomt ekvilibrere til stuetemperatur. Når opløsningen er afkølet, skal du sende den udglødede Bla g 1 lipidblanding gennem et 0,22 mikron sprøjtefilter for at fjerne partikler og bruge et nyt centrifugalfilter med en 10 kilodalton cutoff til bufferbytning af det filtrerede protein tre gange til PBS for at fjerne eventuelle resterende frie fedtsyrer og organisk opløsningsmiddel. Derefter skal du vurdere proteinkoncentrationen ved hjælp af en standard proteinanalyseanalyseanalyse for at bestemme det forventede udbytte for de resterende Bla g 1 aliquots.For at rekonstruere Apo-Bla g 1 skal prøverne suspenderes igen i fem milliliter refoldingsbuffer pr. aliquot, og prøverne anneales som påvist. For at læsse Bla g 1 med fosforlipider tilsættes 10 mg af den ønskede last til et glasredningsglas og opløses i kloroform og fordampes kloroformen for at producere en lipidfilm. Derefter tilsættes PBS til røret for at producere en endelig fosforkoncentration på 20 millimolar.Varm fosfolipiden over faseovergangstemperaturen for lipidlasten for at rehydrere lipidfilmen og vortex, indtil opløsningen bliver overskyet. Derefter tilsættes fosfor lipid last til at producere en 20X molar overskud af ligands i forhold til Bla g 1 baseret på det forventede udbytte. En precipitant kan dannes.Vortex at blande før udglødning proteinet som demonstreret. For at bekræfte fjernelse eller lastning af gods med fosfor-31 NMR skal der anvendes et centrifugalfilter til at koncentrere prøven til mere end 100 mikromolar som påvist. Der fremstilles referencephospholipidprøver af kendte koncentrationer i PBS-buffer som angivet, og der fortyndes Bla g 1-slutreferencen til et 1:1-forhold med cholatbuffer til et samlet volumen på ca. 600 mikroliter.Brug en bredbåndssonde til at erhverve endimensionale 31-fosfor-NMR-spektre af de kollegatopløsede Bla g 1-prøver og referencepholipidstandarder og sammenlign 1 31 fosfor NMR-spektre med dem, der er opnået for fosforreferenceprøver for at bekræfte fjernelsen af endogene bundne ligands og/eller bindingen af de ønskede ligands baseret på de synlige toppes kemiske forskydninger, og sammenlign derefter topintensiteten af Bla g 1-spektret med fosforreferencestandarderne for at gøre det muligt at bekræfte den fulde bindende stomiometeri. Ved hjælp af affinitetskromatografi kan rekombinant GST Bla g 1 let isoleres til et højt renhedsniveau, hvilket giver et udbytte på to til fire milligram pr. liter cellekultur. Inkubation fra den ene dag til den anden med TEV-protease ved fire grader Celsius er tilstrækkelig til at fjerne GST-mærket, hvilket giver det endelige produkt på ca. 24 kilodalton.Anvendelse af Bla g 1 på en omvendt fase C18 kolonne giver en karakteristisk elution profil, med to store toppe på 50%buffer B, og en anden stor top på 75% buffer B.Phosphorus-31 NMR spektre af Apo-Bla g 1 viser ingen påviselige fosforider. Der kan fremstilles en standardkurve af NMR ved hjælp af referenceprøver af kendte DSPC-koncentrationer. Sammenligning af fosfor 31 signalintensiteten fra DSPC Bla g 1 i forhold til denne standardkurve kan bruges til at give lipidernes bindende støkiometri pr. protein.Cirkulær dichroism spektre for Apo-og lipid-loaded Bla g 1 viser minima på 220 og 210 nanometer, der tyder på en overvejende alfa-spiralformet struktur. Cirkulære dichroism-baserede termiske denaturering assays viser også et kooperativt tab af alfa-spiralisk sekundær struktur, der tyder på en foldet kugleformet domæne. Desuden viser en analyse af de resulterende smeltetemperaturer en betydelig stigning i nMix ligand binding, i overensstemmelse med Bla g 1 opnået fra sin naturlige allergen kilde.Denne protokols succes afhænger af evnen til at overvinde både den begrænsede opløselighed af hydrofobe ligands og den utilgængelige karakter af Bla g 1 bindehulen. Denne procedure lægger grunden til immunologiske undersøgelser, såsom T-cellespredningsanalyser, for at vurdere virkningen af lipid ligands på sensibilisering og de molekylære mekanismer, hvorigennem dette sker. Ved at koble denne procedure sammen med yderligere biofysiske assays har vi vist, at bindingen af hydrofobe ligands øger Bla g 1-stabiliteten med potentielle downstream-implikationer for epitopgenerering og allergenicitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser udad: isolering af Cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Billeddannelse af podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med udvidelsesmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifikation af bindingsproteiner fra små ligands med Ligand Assays differentierede radiale kapillærhandling (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...