Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
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Wir danken Dr. Tom Kirby, Scott Gabel und Dr. Robert London für ihre Hilfe und Unterstützung während dieser Arbeit, zusammen mit Dr. Bob Petrovich und Lori Edwards für die Verwendung ihrer Instrumentierung und ihre Unterstützung bei der Erstellung der bla g 1-Konstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. Wir danken Andrea Adams für die Unterstützung bei der Massenspektrometrie und Dr. Eugene DeRose für die Unterstützung bei der NMR-Instrumentierung. Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Environmental Health Sciences dar.

1. Bla g 1 Klonen
<ol><li>Erhalten Sie das Gen für das Kakerlakenallergen Bla g 1.0101 (Rückstände 34-216), das eine einzige Wiederholung der MA-Domäne darstellt. Der Einfachheit halber wird Bla g 1 während des gesamten Werks verwendet, um diese einzelne Wiederholung darzustellen, und nicht das gesamte Bla g 1.0101-Transkript.</li>
	<li>Subklonieren Sie das Bla g 1 Gen in den gewünschten Vektor. In dieser Studie wurde das Gen, das ein N-terminales Glutathion-S-Transferase-Tag (GST) enthält, das ...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um die Lipidbindungseigenschaften von Bla g 1 systematisch zu untersuchen. Dies zeigte eine Korrelation zwischen Ladungsbindung, Thermostabilität und endosomaler Verarbeitung, von denen letztere mit einer Abnahme der Erzeugung eines bekannten T-Zell-Epitops mit möglichen Auswirkungen auf die Immunogenität korrelierte9,18. Zusätzlich zu Bla g 1 haben andere Allergene wie Pru p 3 und Bet ...

Eine Untersuchung der Allergendatenbank zeigt, dass Allergene nur in 2% aller bekannten Proteinfamilien vorkommen, was darauf hindeutet, dass gemeinsame funktionelle und biophysikalische Eigenschaften zur Allergenität beitragen1. Von diesen Eigenschaften scheint die Fähigkeit, Lipidladungen zu binden, unter allergenen stark überrepräsentiert zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Ladungen den Sensibilisierungsprozess beeinflussen können1. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass das Paranussallergen Ber e 1 eine gleichzeitige Verabreichung mit seinem endogenen Lipid erfordert, um sein volles sensibilisierendes Potenzialauszuschöpfen 2. Diese Lipide könnten potentiell das Immunsystem direkt stimulieren, wie die Milbenallergene Der p 2 und Der p 7 zeigen, die beide eine starke strukturelle Homologie mit LPS-bindenden Proteinen3,4,5teilen . Basierend auf dieser Beobachtung wurde vorgeschlagen, dass Derp 2 und Der p 7 bakterielle Lipide binden und das Immunsystem des Wirts durch TLR4-vermittelte Signalisierung direkt stimulieren könnten, was den Sensibilisierungsprozess erleichtert5,6. Es ist auch möglich, dass endogen gebundene Lipide die biophysikalischen Eigenschaften allergener Proteine selbst verändern könnten. Zum Beispiel erhöhte die Fähigkeit von Sin a 2 (Senf) und Ara h 1 (Erdnüsse), mit Phospholipidvesikeln zu interagieren, signifikant ihre Resistenz gegen Magen- und Endosomalabbau7, während die Ligandenbindung an das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sowohl die Rate der endosomalen Verarbeitung als auch die Vielfalt der resultierenden Peptide veränderte8. Dies ist besonders relevant für die Allergenität angesichts der Korrelation, die zwischen Stabilität, T-Zell-Epitopbildung und Allergenität für Proteine wie Bet v 1 und Bla g 1 beobachtet wurde; Letzteres wird Gegenstand dieser Arbeit sein9,10.
Bla g 1 repräsentiert das prototypische Mitglied der Proteinfamilie des Major Allergen (MA) des Insekts und besitzt eine einzigartige Struktur, die aus 12 amphipathischen Alpha-Helices besteht, die einen ungewöhnlich großen hydrophobenHohlraumumschließen 9,11. Die verfügbare Röntgenkristallstruktur von Bla g 1 zeigt eine Elektronendichte innerhalb dieses Hohlraums, die mit gebundenen Phospholipid- oder Fettsäureliganden übereinstimmt; eine Vermutung, die durch 31P-NMR und Massenspektrometrie bestätigt wird. Diese Ladungen waren heterogener Natur und ihre Zusammensetzung hing stark von der Allergenquelle ab, wobei für rekombinante Bla g 1, ausgedrückt in E. coli und P. pastoris,unterschiedliche Lipidprofile beobachtet wurden. Seltsamerweise enthielt Bla g 1, gereinigt von seiner natürlichen Allergenquelle (Kakerlakenfrass), überwiegend Fettsäuren an seiner Bindungsstelle, wobei eine Mischung aus Palmitat, Oleat und Stearat als seine "natürlichen" Liganden identifiziert wurde9,11. Die Fähigkeit von Bla g 1, Lipide und Fettsäuren nach mehreren Reinigungsschritten zurückzuhalten, behindert die Bemühungen, das Protein isoliert zu untersuchen. Umgekehrt wurde vermutet, dass die natürlichen Palmitat-, Stearat- und Oleatliganden von Bla g 1 (im Folgenden als nMix bezeichnet) eine Schlüsselrolle sowohl bei seiner Allergenität als auch bei seiner nativen biologischen Funktion spielen9. Diese Liganden sind jedoch in Bla g 1, die aus rekombinanten Quellen gewonnen wurden, nicht vorhanden, was es schwierig macht, diese Hypothese zu beurteilen. Ähnliche Probleme wurden für andere lipidbindende Allergene wie Bet v 112,13beobachtet. Um die systematische Untersuchung von Lipid-Allergen-Interaktionen zu erleichtern, haben wir ein Protokoll entwickelt, mit dem Allergene quantitativ von ihren endogen gebundenen Lipiden befreit und entweder in Apo-Form rekonstituiert oder mit spezifischen Liganden beladen werden können.
Allergene werden am häufigsten aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen mittels Affinitätschromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie gereinigt. Hier führen wir einen zusätzlichen Reinigungsschritt in Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasen-C18-Säule ein, aus der das Allergen in ein organisches Lösungsmittel eluiert wird, ähnlich den protokollierten Protokollen, die für fettsäurebindende Proteine entwickelt wurden14. Das resultierende Protein wird dann in Abwesenheit oder Gegenwart von Fettsäuren und/oder Phospholipiden einem thermischen Glühschritt unterzogen. Zusätzlich zur Rückgewinnung des nativen Bla g 1-fachen erhöhen die erhöhten Temperaturen die Löslichkeit und Zugänglichkeit der Lipidladungen, wodurch Bla g 1 entweder in apo-Form oder gleichmäßig mit dem gewünschten hydrophoben Liganden beladen wird. 31 P-NMR-Spektren von Bla g 1, die auf diese Weise gereinigt wurden, bestätigten die vollständige Entfernung endogener gebundener Liganden und den gleichmäßigen Ersatz durch die gewünschten Verbindungen, während der zirkuläre Dichroismus die erfolgreiche Wiederherstellung der Bla g 1-Falte bestätigte. Der Nutzen dieser Methode wird in einer kürzlich durchgeführten Arbeit hervorgehoben, in der festgestellt wurde, dass die Ladungsbindung die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 verbessert und die Kinetik der T-Zell-Epitoperzeugung mit potenziellen Auswirkungen auf die Sensibilisierung und Allergenität verändert9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Viele wichtige Allergene binden an hydrophobe lipidähnliche Moleküle, darunter Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 und Fel d 1. Diese Liganden bleiben stark erhalten und haben das Potenzial, den Sensibilisierungsprozess zu beeinflussen, entweder durch direkte Stimulation des Immunsystems oder durch Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften des allergenen Proteins. Um diese Variablen zu kontrollieren, sind Techniken zur Entfernung endogener gebundener Liganden und gegebenenfalls zum Ersatz durch Lipide bekannter Zusammensetzung erforderlich. Das Kakerlakenallergen Bla g 1 umschließt eine große hydrophobe Höhle, die eine heterogene Mischung aus endogenen Lipiden bindet, wenn sie mit traditionellen Techniken gereinigt wird. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der diese Lipide mittels Umkehrphasen-HPLC gefolgt von thermischem Glühen entfernt werden, um Bla g 1 entweder in seiner Apo-Form oder mit einer benutzerdefinierten Mischung aus Fettsäure- oder Phospholipidladungen zu erhalten. Die Kopplung dieses Protokolls mit biochemischen Assays zeigt, dass Fettsäureladungen die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 signifikant verändern, mit nachgelagerten Auswirkungen auf die Rate der T-Zell-Epitopbildung und Allergenität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Lipidentfernungs- / Nachladeprotokollen wie dem hier beschriebenen bei der Untersuchung von Allergenen aus rekombinanten und natürlichen Quellen. Das Protokoll ist auf andere Allergenfamilien verallgemeinerbar, einschließlich Lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) und Uteroglobin (Fel d 1), und bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Rolle von Lipiden bei der allergischen Reaktion zu untersuchen.

Mit Hilfe der Affinitätschromatographie wurde rekombinantes GST-Bla g 1 leicht auf einen hohen Reinheitsgrad isoliert (Abbildung 1A), wodurch eine Ausbeute von ~ 2-4 mg / L Zellkultur erzeugt wurde. Die Inkubation über Nacht mit TEV-Protease bei 4 °C reicht aus, um das GST-Tag zu entfernen, wodurch das Endprodukt bei ~ 24 kDa entsteht. Beachten Sie, dass in diesem Fall eine signifikante Menge an GST-Bla g 1 in den Durchfluss- und Waschfraktionen vorhanden ist, was darauf hindeutet, dass die Bindungska...

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Dieses Protokoll beschreibt die Entfernung endogener Lipide aus Allergenen und deren Ersatz durch benutzerdefinierte Liganden durch Umkehrphasen-HPLC in Verbindung mit thermischem Glühen. 31 P-NMR und zirkulärer Dichroismus ermöglichen die schnelle Bestätigung der Ligandenentfernung/-belastung und die Wiederherstellung der nativen Allergenstruktur.

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Viele Allergene binden hydrophobe Moleküle. Dieses Protokoll ermöglicht die vollständige Entfernung und den Ersatz dieser Liganden, so dass wir ihre Auswirkungen auf Struktur und Immunogenität systematisch untersuchen können. Der Einsatz von Umkehrphasen-HPLC, gekoppelt mit thermischem Glühen, hat zwei Vorteile.Es entfernt endogene Liganden und hilft, Liganden zu solubilisieren, um ansonsten unzugängliche Bindungsstellen zu öffnen. Wenn wir die Faktoren bestimmen können, die zur Allergenität beitragen, können wir möglicherweise Therapien entwickeln, die diese Faktoren vermeiden. Viele Proteine binden Lipidliganden, die stark zurückgehalten werden und sowohl Struktur als auch Funktion beeinflussen können.Unsere Methode ermöglicht die systematische Untersuchung dieser Wechselwirkungen. Die begrenzte Löslichkeit und Zugänglichkeit vieler Lipidladungen kann den Ladevorgang hemmen. Achten Sie darauf, bei der Vorbereitung dieser Liganden darauf zu achten und die Notwendigkeit systemspezifischer Anpassungen zu berücksichtigen.Da die Arbeit mit hydrophoben und unlöslichen Liganden für einige Allergologen und Biochemiker eine Anpassung ist, kann es nützlich sein zu sehen, wie die Proben in verschiedenen Stadien aussehen. Nach der Klonexpression und -reinigung 12 Milliliter des gespaltenen Bla g 1 auf eine Zentrifugalfiltereinheit mit einer Molekulargewichtsabschaltung von weniger als 10 Kilodalton für mehrere Zentrifugationen in einem Schaufelrotor auftragen, bis das Gesamtvolumen auf weniger als zwei Milliliter reduziert wurde. Laden Sie das resultierende Konzentrat auf ein 250 x 10 Millimeter großes HPLC-System, das mit einer C18-Umkehrphasenchromatographiesäule ausgestattet ist, die mit 97% Puffer A und 3% Puffer B gleichgewichtet ist.Elute Bla g 1 bei einer Durchflussrate von 1,5 bis 4 Milliliter pro Minute, wie in der Tabelle angegeben, wobei die Fluoreszenzabsorption bei 280 Nanometern verwendet wird, um den Elutionsprozess zu überwachen.Ab etwa 34 bis 40 Minuten und einer Puffer-B-Konzentration über 74% sammeln sich nicht mehr als vier Milliliter jeder Bla g 1-Fraktion. Aliquot die gepoolte Bla g 1 Fraktion in Glas Reagenzgläser. Decken Sie die Röhrchen mit Paraffinfolie ab und perforieren Sie die Folie mit zwei Löchern.Anschließend die Proben eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren und die resultierenden entlipidierten Proteinproben mit einem Lyophilisator trocknen. Um die erwartete Bla g 1-Ausbeute zu bestimmen, suspendieren Sie ein lyophilisiertes delipidiertes Testaliquot in fünf Millilitern Umfaltungspuffer. Erhitzen Sie die Mischung in einem 500-Milliliter-Becherglas mit 250 Millilitern Wasser auf 95 Grad Celsius auf einer heißen Platte unter Rühren und intermittierendem Wirbeln.Halten Sie die Lösung 30 bis 60 Minuten bei 95 Grad, bevor sie das Wasserbad langsam auf Raumtemperatur ausgleichen lässt. Wenn die Lösung abgekühlt ist, geben Sie die geglühte Bla g 1-Lipidmischung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um Partikel zu entfernen, und verwenden Sie einen neuen Zentrifugalfilter mit einem 10-Kilodalton-Cutoff, um den Austausch des gefilterten Proteins dreimal in PBS zu puffern, um verbleibende freie Fettsäuren und organische Lösungsmittel zu entfernen. Bewerten Sie dann die Proteinkonzentration mit einem Standard-Proteinanalyse-Assay, um die erwartete Ausbeute für die verbleibenden Bla g 1-Aliquoten zu bestimmen.Um den Apo-Bla g 1 zu rekonstituieren, suspendieren Sie die Bla g 1 Aliquoten in fünf Millilitern Umfaltungspuffer pro Aliquot und glühen die Proben wie gezeigt. Um den Bla g 1 mit Phospholipiden zu beladen, fügen Sie 10 Milligramm der gewünschten Ladung in ein Glasreagenzglas und lösen Sie sich in Chloroform auf und verdampfen Sie das Chloroform zu einem Lipidfilm. Fügen Sie dann PBS in die Tube hinzu, um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 Millimolar zu erzeugen.Erhitzen Sie das Phospholipid über die Phasenübergangstemperatur der Lipidladung, um den Lipidfilm zu rehydrieren, und wirbeln Sie, bis die Lösung trüb wird. Fügen Sie dann die Phospho-Lipidladung hinzu, um einen 20-fachen molaren Überschuss an Liganden relativ zu Bla g 1 basierend auf der erwarteten Ausbeute zu erzeugen. Ein Niederschlagsmittel kann sich bilden.Wirbel zu mischen, bevor das Protein wie gezeigt geglüht wird. Um die Ladungsentfernung oder -beladung durch Phosphor-31 NMR zu bestätigen, verwenden Sie einen Zentrifugalfilter, um die Probe auf mehr als 100 Mikromolaren zu konzentrieren, wie gezeigt. Bereiten Sie Referenzphospholipidproben bekannter Konzentrationen im PBS-Puffer wie angegeben vor und verdünnen Sie die Bla g 1-Endreferenz auf ein Verhältnis von 1:1 mit Cholatpuffer auf ein Gesamtvolumen von etwa 600 Mikrolitern.Verwenden Sie eine Breitbandsonde, um eindimensionale 31-Phosphor-NMR-Spektren der kollatlösierten Bla g 1-Proben und Referenzphospholipid-Standards zu erfassen, vergleichen Sie die Bla g 1 31 Phosphor-NMR-Spektren mit denen, die für Phospholipid-Referenzproben erhalten wurden, um die Entfernung endogener gebundener Liganden und / oder die Bindung der gewünschten Liganden basierend auf den chemischen Verschiebungen der sichtbaren Peaks zu bestätigen, und vergleichen Sie dann die Spitzenintensität des Bla g 1-Spektrums mit der der Phospholipid-Referenzstandards, um die Bestätigung der vollständigen Bindungsstöchiometrie zu ermöglichen. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie kann rekombinanteS GST Bla g 1 leicht auf einen hohen Reinheitsgrad isoliert werden, was eine Ausbeute von zwei bis vier Milligramm pro Liter Zellkultur ergibt. Die Inkubation über Nacht mit TEV-Protease bei vier Grad Celsius reicht aus, um das GST-Tag zu entfernen, wodurch das Endprodukt bei etwa 24 Kilodalton entsteht.Die Anwendung des Bla g 1 auf eine Umkehrphasen-C18-Säule ergibt ein unverwechselbares Elutionsprofil mit zwei großen Peaks bei 50% Puffer B und einem zweiten großen Peak bei 75% Puffer B.Phosphor-31 NMR-Spektren von Apo-Bla g 1 zeigen keine nachweisbaren Phospholipide. Aus der NMR kann unter Verwendung von Referenzproben bekannter DSPC-Konzentrationen eine Standardkurve erstellt werden. Der Vergleich der phosphorigen 31-Signalintensität, die aus DSPC Bla g 1 erhalten wurde, mit dieser Standardkurve kann verwendet werden, um die Bindungsstöchiometrie der Lipide pro Protein zu erhalten.Zirkuläre Dichroismusspektren für Apo- und lipidbeladene Bla g 1 zeigen Minima von 220 und 210 Nanometern, was auf eine überwiegend alpha-helikale Struktur hinweist. Zirkuläre Dichroismus-basierte thermische Denaturierungsassays zeigen auch einen kooperativen Verlust der alpha-helikalen Sekundärstruktur, was auf eine gefaltete kugelförmige Domäne hinweist. Darüber hinaus zeigt die Analyse der resultierenden Schmelztemperaturen einen signifikanten Anstieg der nMix-Ligandenbindung, der mit Bla g 1 übereinstimmt, das aus seiner natürlichen Allergenquelle gewonnen wird.Der Erfolg dieses Protokolls hängt von der Fähigkeit ab, sowohl die begrenzte Löslichkeit hydrophober Liganden als auch die unzugängliche Natur der Bla g 1-Bindungshöhle zu überwinden. Dieses Verfahren legt die Grundlage für immunologische Studien, wie z.B. T-Zellproliferationsassays, um die Wirkung von Lipidliganden auf die Sensibilisierung und die molekularen Mechanismen, durch die dies geschieht, zu bewerten. Durch die Kopplung dieses Verfahrens mit weiteren biophysikalischen Assays haben wir gezeigt, dass die Bindung hydrophober Liganden die Stabilität von Bla g 1 verbessert, mit möglichen nachgelagerten Auswirkungen auf die Epitoperzeugung und Allergenität.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Forschung

Biochemie

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...