Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר טום קירבי, סקוט גבל וד"ר רוברט לונדון על עזרתם וסיועם לאורך כל העבודה, יחד עם ד"ר בוב פטרוביץ' ולורי אדוארדס על השימוש במכשור שלהם ועל עזרתם ביצירת מבני Bla g 1 המועסקים במחקר זה. אנו מודים לאנדריאה אדמס על הסיוע בספקטרומטריית ההמונים, וד"ר יוג'ין דה-רוז על הסיוע במכשור NMR. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמי של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, Z01-ES102906 (GAM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה.

1. בלה g 1 שיבוט
<ol><li>השג גן עבור אלרגן ג'וק בלה g 1.0101 (שאריות 34-216), המייצג חזרה אחת של תחום MA. למען הפשטות, Bla g 1 ישמש לאורך כל העבודה כדי לייצג את החזרה הבודדת הזו, ולא את כל תעתיק Bla g 1.0101.</li>
	<li>תת-קלף את הגן Bla g 1 לווקטור הרצוי. במחקר זה, הגן המכיל תג גלוטתיון S-transferase N-מסוף (GST) יחד עם וירוס ט...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יושם בהצלחה כדי לחקור באופן שיטתי את תכונות איגוד השומנים של Bla g 1. זה חשף מתאם בין מחייב מטען, תרמו יציבות, ועיבוד אנדוזומלי, האחרון שבהם היה בקורלציה עם ירידה בדור של אפיטופ T-cell ידוע עם השלכות פוטנציאליות על אימונוגניות9,18. בנוסף Bl...

סקר של מסד הנתונים אלרגנים מגלה כי אלרגנים נמצאים רק 2% של כל משפחות החלבון הידוע, מציע תכונות תפקודיות וביופיזיות נפוצות לתרום אלרגניות1. מבין מאפיינים אלה, נראה כי היכולת לקשור מטעני שומנים מיוצגת יתר על המיד בקרב אלרגנים, דבר המצביע על כך שמטענים אלה עשויים להשפיע על תהליך הרגישות1. אכן, הוכח כי ברזיל אגוז אלרגן Ber e 1 דורש שיתוף ממשל עם השומנים אנדוגני שלה כדי לממש את מלוא פוטנציאל הרגישות שלה2. שומנים אלה עלולים לעורר את המערכת החיסונית ישירות כפי שמודגם על ידי אלרגנים קרדית Der p 2 ו Der p 7, שניהם חולקים הומולוגיה מבנית חזקה עם חלבונים מחייבי LPS3,4,5. בהתבסס על תצפית זו הוצע כי Derp 2 ו Der p 7 יכול לקשור שומנים חיידקיים ישירות לעורר את המערכת החיסונית המארחת באמצעות איתות TLR4 בתיווך, להקל על תהליך הרגישות5,6. זה גם אפשרי כי שומנים מאוגדים אנדוגני יכול לשנות את המאפיינים הביופיזיים של חלבונים אלרגניים עצמם. לדוגמה, היכולת של חטא 2 (חרדל) ו Ara h 1 (בוטנים) לקיים אינטראקציה עם פוספוליפידים vesicles שיפרה באופן משמעותי את עמידותם השפלה קיבה אנדוסומלית7, בעוד קשירה ליגנד אלרגן אבקה ליבנה הגדול ב ' v 1 שינה הן את קצב העיבוד האנדוזומלי ואת המגוון של פפטידים וכתוצאה מכך8. זה רלוונטי במיוחד לאלרגניות בהתחשב במתאם שנצפה בין יציבות, דור האפיטופים של תאי T ואלרגניות לחלבונים כמו Bet v 1 ו- Bla g 1; האחרון שבהם יהיה הנושא של עבודה זו9,10.
Bla g 1 מייצג את החבר הטיפוסי של משפחת החלבון מייג'ור אלרגן (MA), ובעל מבנה ייחודי המורכב מ -12 הליקי אלפא אמפיפתיים המקיפים חלל הידרופובי גדול באופן חריג9,11. מבנה גביש רנטגן זמין של Bla g 1 מראה צפיפות אלקטרונים בתוך חלל זה עולה בקנה אחד עם פוספוליפיד קשור או חומצת שומן ליגנדים; השערה שאושרה על ידי 31P-NMR וספקטרומטריית מסה. מטענים אלה היו הטרוגניים בטבע והרכבם היה תלוי במידה רבה במקור האלרגן, עם פרופילי שומנים שונים שנצפו עבור Bla g 1 רקומביננטי לידי ביטוי E. coli ו P. pastoris. באופן מוזר, Bla g 1 מטוהר ממקור האלרגן הטבעי שלו (frass ג'וק) הכיל בעיקר חומצות שומן בתוך אתר הכריכה שלה, עם תערובת של palmitate, oleate, ו stearate להיות מזוהה כמו ליגנדים "טבעי" שלה9,11. היכולת של Bla g 1 לשמור שומנים וחומצות שומן בעקבות צעדי טיהור מרובים מעכבת את המאמצים לחקור את החלבון בבידוד. לעומת זאת, הוצע כי פלמיאט טבעי, stearate, ו oleate ליגנדים של Bla g 1 (מעתה ואילך המכונה nMix) לשחק תפקיד מפתח הן אלרגניות שלה פונקציה ביולוגית מקורית9. עם זאת, ליגנדים אלה אינם נוכחים Bla g 1 המתקבל ממקורות רקומביננטיים, מה שמקשה להעריך השערה זו. בעיות דומות נצפו עבור אלרגנים מחייבים שומנים אחרים כגון בית v 112,13. כדי להקל על המחקר השיטתי של אינטראקציות השומנים-אלרגן פיתחנו פרוטוקול שבאמצעותו אלרגנים יכולים להיות מופשטים כמותית של השומנים שלהם מאוגדים אנדוגנית ו reconstituted או אפו טופס או טעון עם ליגנדים ספציפיים.
אלרגנים מטוהרים בדרך כלל ממקורותיהם הטבעיים או הרקומביננטיים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ו/או כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל. כאן, אנו מציגים שלב טיהור נוסף בצורה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) המעסיקה עמודת C18 הפוכה שממנה האלרגן משופע לממס אורגני בדומה לפרוטוקולים שפותחו עבור חלבונים מחייבים חומצות שומן14. החלבון המתקבל נתון לאחר מכן לשלב חישול תרמי בהיעדר או נוכחות של חומצות שומן ו/או פוספוליפידים. בנוסף לשחזור Bla g הילידי 1 לקפל, הטמפרטורות גבוהות להגדיל את המסיסות והנגישות של מטעני השומנים, מניב Bla g 1 בצורה Apo או טעון באופן אחיד עם ligand הידרופובי הרצוי. 31 ספקטרום P-NMR של Bla g 1 מטוהר באופן זה אישר את ההסרה המלאה של ליגנדים מאוגדים אנדוגני והחלפה אחידה עם התרכובות הרצויות, בעוד dichroism מעגלי אישר את ההתאוששות המוצלחת של Bla g 1 לקפל. התועלת של שיטה זו מודגשת בעבודה האחרונה שבה נמצאה כריכת מטען כדי לשפר את התרמו היציבות Bla g 1 והתנגדות פרוטאוליטית, שינוי הקינטיקה של דור האפיטופים של תאי T עם השלכות פוטנציאליות על רגישות ואלרגניות9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

אלרגנים מרכזיים רבים נקשרים למולקולות הידרופוביות דמויי שומנים, כולל Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ו- Fel d 1. ליגנדים אלה נשמרים בחוזקה ויש להם פוטנציאל להשפיע על תהליך הרגישות או באמצעות גירוי ישיר של המערכת החיסונית או שינוי התכונות הביופיזיות של החלבון האלרגני. על מנת לשלוט על משתנים אלה, טכניקות נדרשות להסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני, ואם יש צורך, החלפה עם שומנים של הרכב ידוע. אלרגן המקק Bla g 1 מוקף חלל הידרופובי גדול אשר קושר תערובת הטרוגנית של שומנים אנדוגני כאשר מטוהרים באמצעות טכניקות מסורתיות. כאן, אנו מתארים שיטה שדרכה שומנים אלה מוסרים באמצעות HPLC פאזה הפוכה ואחריו חישול תרמי להניב Bla g 1 בצורת Apo שלה או נטען מחדש עם תערובת מוגדרת על ידי המשתמש של חומצות שומן או מטענים פוספוליפידים. צימוד פרוטוקול זה עם מבחנים ביוכימיים מגלה כי מטעני חומצות שומן משנים באופן משמעותי את התרמו היציבות וההתנגדות הפרוטאוליטית של Bla g 1, עם השלכות במורד הזרם על קצב ייצור האפיטופים של תאי T ואלרגניות. תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של הסרת השומנים / טעינה מחדש פרוטוקולים כגון זה המתואר בזאת בעת לימוד אלרגנים ממקורות רקומביננטיים וטבעיים כאחד. הפרוטוקול ניתן להכללה למשפחות אלרגנים אחרות כולל ליפוקלינים (Mus m 1), PR-10 (בית v 1), MD-2 (Der p 2) ו Uteroglobin (פל ד 1), מתן כלי רב ערך כדי ללמוד את התפקיד של שומנים בתגובה אלרגית.

באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה, GST-Bla g 1 רקומביננטי היה מבודד בקלות לרמה גבוהה של טוהר (איור 1A),לייצר תשואה של ~ 2-4 מ"ג / ליטר של תרבות התא. דגירה לילה עם פרוטאז TEV ב 4 מעלות צלזיוס מספיק כדי להסיר את תג GST, מניב את המוצר הסופי ב ~ 24 kDa. שים לב כי במקרה זה יש כמות משמעותית של GST-Bla g 1 בשברים זרימה ד?...

Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

פרוטוקול זה מתאר את הסרת השומנים האנדוגניים מאלרגנים, ואת החלפתם בליגדות שצוינו על-ידי המשתמש באמצעות HPLC הפוך בשילוב עם חישול תרמי. 31 P-NMR ו dichroism מעגלי לאפשר אישור מהיר של הסרת ליגנד / טעינה, ואת ההתאוששות של מבנה אלרגנים מקורי.

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

אלרגנים רבים קושרים מולקולות הידרופוביות. פרוטוקול זה מאפשר הסרה והחלפה מלאה של ליגנדים אלה, ומאפשר לנו ללמוד את השפעתם על המבנה והאימונוגניות באופן שיטתי. לשימוש ב-HPLC הפוך, יחד עם חישול תרמי, יש שני יתרונות.זה מסיר ליגנדים אנדוגניים, וזה עוזר לסכל ליגנדים כדי לפתוח אתרי קשירה שאינם נגישים אחרת. אם נוכל לקבוע את הגורמים התורמים לאלרגניות, אנו עשויים להיות מסוגלים לעצב טיפולים הנמנעים מגורמים אלה. חלבונים רבים קושרים ליגנדים של שומנים, אשר נשמרים בחוזקה ועשויים להשפיע הן על המבנה והן על התפקוד.השיטה שלנו מאפשרת מחקר שיטתי של אינטראקציות אלה. המסיסות המוגבלת והנגישות של מטעני שומנים רבים עלולים לעכב את תהליך הטעינה. הקפד לטפל בעת הכנת ליגנדים אלה, ולשקול את הצורך בהתאמות ספציפיות למערכת.כמו עבודה עם ליגנדים הידרופוביים בלתי מסיסים היא התאמה עבור כמה אלרגנים וביוכימאים, זה יכול להיות שימושי כדי לראות איך הדגימות נראות בשלבים שונים. לאחר שיבוט ביטוי וטיהור, להחיל 12 מיליליטר של Bla g בקע 1 ליחידת סינון צנטריפוגלי עם פחות מ 10 קילודלטון משקל מולקולרי ניתוק עבור צנטריפוגות מרובות רוטור דלי נדנדה עד נפח הכולל הופחת פחות משני מיליליטר. לטעון את התרכיז וכתוצאה מכך על 250 על ידי 10 מילימטר HPLC מערכת מצוידת C18 הפוך פאזה chromatography עמודה שווה עם 97%מאגר A ו 3%buffer B.Elute Bla g 1 בקצב זרימה 1.5 עד 4 מיליליטר לדקה, כפי שצוין בטבלה, באמצעות ספיגת פלואורסצנטיות ב 280 ננומטר כדי לפקח על תהליך elut.החל בסביבות 34 עד 40 דקות וריכוז B חיץ מעל 74%לאסוף לא יותר מארבעה מיליליטר של כל Bla g 1 שבר. Aliquot Bla g בריכה 1 שבר לתוך מבחנות זכוכית. מכסים את הצינורות בסרט פרפין ומחוררים את הסרט בשני חורים.לאחר מכן, להקפיא את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולהשתמש lyophilizer לייבש את דגימות החלבון de-השומנים וכתוצאה מכך. כדי לקבוע את התפוקה הצפויה Bla g 1, להשעות מחדש aliquot בדיקה lyophilized de-שומנים בחמישה מיליליטר של חיץ refolding. מחממים את התערובת ב 500 מיליליטר המכילה 250 מיליליטר של מים ל 95 מעלות צלזיוס על צלחת חמה עם ערבוב ומערבולת לסירוגין.החזק את הפתרון ב 95 מעלות במשך 30 עד 60 דקות לפני מתן אמבט מים לאט לשוויון לטמפרטורת החדר. כאשר הפתרון התקרר, להעביר את תערובת השומנים Bla g 1 annealed דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרון כדי להסיר חומר חלקיקי, ולהשתמש במסנן צנטריפוגלי חדש עם 10 קילודלטון ניתוק כדי לאגור את החלבון מסונן שלוש פעמים לתוך PBS כדי להסיר כל חומצות שומן חופשיות שיורית ממס אורגני. לאחר מכן, להעריך את ריכוז החלבון באמצעות ניתוח חלבון סטנדרטי assay כדי לקבוע את התשואה הצפויה עבור aliquots Bla g הנותרים 1.כדי לשקם את Apo-Bla g 1, להשעות מחדש את aliquots Bla g 1 בחמישה מיליליטר של מאגר refolding לכל aliquot, ו anneal הדגימות כפי שהוכח. כדי לטעון את Bla g 1 עם פוספוליפידים, להוסיף 10 מיליגרם של המטען הרצוי למבחנה זכוכית להתמוסס בכלורופורם, ולאדות את הכלורופורם כדי לייצר סרט שומנים. לאחר מכן, להוסיף PBS לצינור לייצר ריכוז פוספוליפיד הסופי של 20 מילימולאר.מחממים את הפוספוליפיד מעל טמפרטורת המעבר הפאזה של מטען השומנים כדי לתחורר מחדש את סרט השומנים, ומערבולת עד שהפתרון הופך מעונן. לאחר מכן, להוסיף את המטען השומנים phospho לייצר עודף טוחן 20X של ליגנדים יחסית Bla g 1 מבוסס על התשואה הצפויה. משקע יכול להיווצר.וורטקס לערבב לפני חישול החלבון כפי שהוכח. כדי לאשר הסרת מטען או טעינה על ידי זרחן-31 NMR, השתמש במסנן צנטריפוגלי כדי לרכז את המדגם ליותר מ -100 מיקרומולאר כפי שהוכח. הכן דגימות פוספוליפיד הפניה של ריכוזים ידועים במאגר PBS כפי שצוין, ולדלל את התייחסות קצה Bla g 1 ליחס 1:1 עם מאגר cholate לנפח כולל של כ 600 microliters.השתמש בבדיקה בפס רחב כדי לרכוש חד מימדי, 31-זרחן NMR ספקטרום של דגימות Bla g 1 solubilized איסוף והתייחסות סטנדרטים פוספוליפידים, ולהשוות את ספקטרום Bla g 1 31 זרחן NMR לאלה שהושגו עבור דגימות התייחסות פוספוליפיד כדי לאשר את הסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני ו / או כריכה של ליגנדים הרצוי מבוסס על השינויים הכימיים של הפסגות הנראה, ולאחר מכן להשוות את עוצמת השיא של הספקטרום Bla g 1 לזה של תקני התייחסות פוספוליפיד כדי לאפשר אישור של stoichiome מחייב מלא. באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה, GST Bla g 1 רקומביננטי יכול להיות מבודד בקלות לרמה גבוהה של טוהר, לייצר תשואה של שניים עד ארבעה מיליגרם לליטר של תרבות התא. דגירה לילה עם פרוטאז TEV בארבע מעלות צלזיוס מספיק כדי להסיר את תג GST, מניב את המוצר הסופי בערך 24 קילודאלטון.החלת Bla g 1 על עמודת C18 הפוכה מניבה פרופיל elution ייחודי, עם שתי פסגות גדולות ב 50%buffer B, ושיא גדול שני ב 75%חוצץ B.Phosphorus-31 ספקטרום NMR של Apo-Bla g 1 להראות לא פוספוליפידים לגילוי. עקומה סטנדרטית יכולה להיות מיוצרת מן NMR באמצעות דגימות הפניה של ריכוזי DSPC ידועים. השוואת עוצמת האות זרחן 31 המתקבל DSPC Bla g 1 נגד עקומה סטנדרטית זו ניתן להשתמש כדי להניב את stoichiometry מחייב של שומנים לחלבון.ספקטרום dichroism מעגלי עבור Apo-ו השומנים טעון Bla g 1 להראות מינימה של 220 ו 210 ננומטר, המעיד על מבנה אלפא סלילי בעיקר. מבחני דה-נטורציה תרמיים מעגליים מבוססי דיכרואיזם מראים גם אובדן קואופרטיבי של מבנה משני אלפא-סלילי, המעיד על תחום כדורי מקופל. בנוסף, ניתוח של טמפרטורות ההיתוך וכתוצאה מכך מגלה עלייה משמעותית על מחייב nMix ligand, עולה בקנה אחד עם Bla g 1 המתקבל ממקור האלרגן הטבעי שלה.ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על היכולת להתגבר הן על המסיסות המוגבלת של ליגנדים הידרופוביים, והן על האופי הבלתי נגיש של חלל הכריכה Bla g 1. הליך זה מניח את היסודות למחקרים אימונולוגיים, כגון מבחני התפשטות תאי T, כדי להעריך את ההשפעה של ליגנדים השומנים על רגישות ואת המנגנונים המולקולריים שדרכם זה קורה. צימוד הליך זה עם מבחנים ביופיזיים נוספים, הראינו כי קשירה של ליגנדים הידרופובי משפר את יציבות Bla g 1, עם השלכות פוטנציאליות במורד הזרם עבור ייצור אפיטופים ואלרגניות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...