Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
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トム・カービー博士、スコット・ガベル博士、ロバート・ロンドン博士の助けと支援に感謝し、ボブ・ペトロヴィッチ博士とロリ・エドワーズ博士が、この研究で採用されているBla g 1コンストラクトの生成に役立ててくれたボブ・ペトロヴィッチ博士とロリ・エドワーズ博士と共に支援を受けました。アンドレア・アダムスの質量分析の支援、NMR計装の支援にユージン・デローズ博士に感謝します。この研究は、NIHの壁内研究プログラム、環境衛生科学研究所、Z01-ES102906(GAM)によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立環境衛生科学研究所の公式見解を表すものではありません。

1. ブラ g 1 クローニング
<ol><li>ゴキブリアレルゲンブラg1.0101(残基34-216)に対する遺伝子を得て、MAドメインの単一反復を表す。簡単にするために、Bla g 1は、Bla g 1.0101トランスクリプト全体ではなく、この単一の繰り返しを表すために、作業全体で使用されます。</li>
	<li>目的のベクターにBla g1遺伝子をサブクローニングする。本研究では、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

本研究で説明したプロトコルは、ブラg1の脂質結合特性を体系的に研究するためにうまく応用されている。これにより、貨物結合性、サーモスク性、および内因性処理との間の相関が明らかになっており、後者は、免疫原性に対する潜在的な意味を有する既知のT細胞エピトープの生成の減少と相関していた。Bla g 1に加えて、Pru p 3およびBet v 1のよ?...

アレルゲンデータベースの調査では、アレルゲンは全ての既知のタンパク質ファミリーの2%にしか見つからないことが明らかになっており、一般的な機能的および生物的性質がアレルゲン性1に寄与することを示唆している。これらの特性のうち、脂質貨物を結合する能力はアレルゲンの間で強く過剰に表現されているように見えるが、これらの貨物が感作プロセス1に影響を与える可能性があることを示唆している。実際、ブラジルナッツアレルゲンBer e1は、その完全な感作電を実現するためにその内因性脂質との共投与を必要とすることが示されている2.これらの脂質は、MITアレルゲンDer p2およびDer p 7によって示されるように免疫系を直接刺激する可能性があり、どちらもLPS結合タンパク質3、4、5と強い構造相同性を共有する。この観察に基づいて、Derp2とDerp7は細菌脂質を結合し、TLR4媒介シグナル伝達を介して宿主免疫系を直接刺激し、感作プロセス5,6を促進することが提案された。また、内因性に結合した脂質が、アレルギー性タンパク質自体の生物物理学的性質を変化させる可能性もあります。例えば、Sina2(マスタード)およびArah1(ピーナッツ)とリン脂質小胞と相互作用する能力は胃および内皮分解7に対する耐性を有意に増強し、一方で主要な白樺花粉アレルゲンBet v 1へのリガンド結合は、内経処理の速度と得られるペプチドの多様性を両方とも変化させた。これは特に、安定性、T細胞エピトープ生成、およびBet v 1およびBla g 1などのタンパク質のアレルゲン性との間で観察された相関関係を考えると、アレルゲン性に関連する。後者は、この作品9、10の主題になります。
Bla g 1は、昆虫主アレルゲン(MA)タンパク質ファミリーの原型型的なメンバーを表し、異常に大きな疎水性キャビティ9,11を囲む12の両生媒性アルファヘリックスからなるユニークな構造を有する。Bla g 1の利用可能なX線結晶構造は、結合したリン脂質または脂肪酸リガンドと一致するこの空洞内の電子密度を示す。31P-NMRと質量分析によって確認された推測。これらの貨物は本質的に異種であり、その組成はアレルゲン源に大きく依存しており、大腸菌およびP.パストリスで発現する組換えブラg1について異なる脂質プロファイルが観察された。不思議なことに、天然のアレルゲン源(ゴキブリのフラス)から精製されたBla g 1は、その結合部位に主に脂肪酸を含み、パルミチン酸塩、オレエー酸酸、ステアレートの混合物がその「天然」リガンド9,11として同定された。複数の精製ステップに従って脂質および脂肪酸を保持するBla g 1の能力は、単離でタンパク質を研究する努力を妨げる。逆に、天然のパルミチン酸、ステアリン酸、および、Bla g 1のオレエー酸リガンド(それ以降はnMixと呼ばれる)がそのアレルゲン性およびネイティブ生物学的機能9の両方において重要な役割を果たすることが示唆されている。しかし、これらのリガンドは組換え源から得られたBla g 1には存在せず、この仮説を評価することは困難である。同様の問題は、ベットv 112,13のような他の脂質結合アレルゲンに対して観察されている。脂質とアレルゲン相互作用の体系的な研究を容易にするために、アレルゲンを内因的に結合した脂質を定量的に取り除き、アポ形態または特異的リガンドを装填するプロトコルを開発しました。
アレルゲンは、アフィニティークロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、自然または組み換え源から最も一般的に精製されます。ここでは、アレルゲンが脂肪酸結合タンパク質14用に開発されたプロトコルと同様の有機溶媒に溶出される逆相C18カラムを採用した、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の形で追加の精製工程を導入する。得られたタンパク質は、次いで、脂肪酸および/またはリン脂質の存在または存在下で熱アニーリングステップを行う。天然のBla g1を回収することに加えて、高温は脂質貨物の溶解性および入手可能性を高め、所望の疎水性リガンドを均一にアポ形態または均一に装填した状態でBla g1を得る。 31このように精製されたBla g 1のP-NMRスペクトルは、所望の化合物との内因的に結合したリガンドおよび均一な置換の完全な除去を確認し、環状二色は、ブラg1倍の正常な回収を確認した。この方法の有用性は、貨物結合がBla g 1のサーモスタ性およびタンパク質分解性を増強し、感作およびアレルギー性に潜在的な影響を及ぼすT細胞エピトープ生成の運動学を変化させることが判明した最近の研究で強調されている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

多くの主要なアレルゲンは、Mus m、Bet v 1、Der p 2、およびFel d 1を含む疎水性脂質様分子に結合します。これらのリガンドは強く保持されており、免疫系を直接刺激するか、アレルギー性タンパク質の生物物理学的性質を変化させることによって感作プロセスに影響を与える可能性を有する。これらの変数を制御するためには、内因性結合リガンドの除去と、必要に応じて既知の組成物の脂質と置換する技術が必要である。ゴキブリアレルゲンブラg1は、従来の技術を使用して精製した場合に内因性脂質の異種混合物を結合する大きな疎水性空洞を囲む。ここでは、逆相HPLCを用いてこれらの脂質を除去し、続いて熱アニーリングを行い、そのアポ形態でBla g 1を得るか、または脂肪酸またはリン脂質カルゴのユーザ定義混合物でリロードする方法について述べた。このプロトコルと生化学的アッセイを結合すると、脂肪酸貨物はBla g 1のサーモスタ性とタンパク質分解性を有意に変化させ、T細胞エピトープ生成およびアレルゲン性の速度に下流の影響を及ぼすことが明らかになった。これらの結果は、組換え源と天然源の両方からアレルゲンを研究する際にここに記載されているような脂質除去/リロードプロトコルの重要性を強調している。このプロトコルは、リポカリン(Mus m 1)、PR-10(Bet v 1)、MD-2(Der p 2)、ウトログロビン(Fel d 1)を含む他のアレルゲンファミリーに一般化可能であり、アレルギー反応における脂質の役割を研究するための貴重なツールを提供する。

アフィニティクロマトグラフィーを用いて、組換えGST-Bla g 1は高い純度(図1A)に容易に単離され、細胞培養の収率は〜2〜4mg/Lを産生する。4°CでTEVプロテアーゼを用いた一晩のインキュベーションは、GSTタグを除去するのに十分であり、〜24kDaで最終生成物を得る。なお、この場合、フロースルーおよび洗浄画分にかなりの量のGST-Bla g 1があり、グルタチオン樹脂結合能力を超えたこ...

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

このプロトコルは、アレルゲンからの内在性脂質の除去と、熱アニーリングと結合された逆相HPLCによるユーザ指定リガンドとの置換を記述する。 31P-NMRおよび円形二色症はリガンドの除去/負荷の速い確認、およびネイティブアレルゲン構造の回復を可能にする。

脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

多くのアレルゲンは疎水性分子に結合する。このプロトコルは、これらのリガンドの完全な除去と置換を可能にし、体系的な方法で構造および免疫原性への影響を研究することを可能にする。逆相HPLCの使用は、熱アニーリングと相まって、2つの利点を有する。それは内因性リガンドを除去し、リガンドを可溶化して他の方法ではアクセスできない結合部位を開くのに役立ちます。アレルゲン性に寄与する要因を特定できれば、これらの要因を避ける治療法を設計できる可能性があります。多くのタンパク質は脂質リガンドに結合し、強固に保持され、構造と機能の両方に影響を与える可能性があります。我々の方法は、これらの相互作用の体系的な研究を可能にする。多くの脂質貨物の限られた溶解性およびアクセス性は、ローディングプロセスを阻害する可能性がある。これらのリガンドを準備する際には必ず注意を払い、システム特有の適応の必要性を考慮してください。疎水性および不溶性リガンドの作業は、一部のアレルギー物質や生化学者にとって調整であるため、サンプルが異なる段階でどのようなものであるかを確認するのに役立ちます。発現と精製をクローニングした後、全容が2ミリリットル未満になるまで、スイングバケットローターでの複数の遠心分離のための10キロダルトン分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットに、切断されたブラg1の12ミリリットルを適用する。得られた濃縮物を、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、280ナノメートルの蛍光吸光度を使用して、97%バッファAと3%バッファB.Elute Bla g 1を毎分1.5〜4ミリリットルの流量で平衡にしたC18逆相クロマトグラフィーカラムを装備した250 x 10ミリメートルHPLCシステムに積み込みます。約34〜40分から始まり、74%を超える緩衝B濃度は、各ブラg1画分の4ミリリットル以下を収集する。アリコートは、ガラス試験管にプールされたBla g 1分数を。パラフィンフィルムでチューブを覆い、2つの穴でフィルムを穿孔します。次に、サンプルをマイナス80度で1時間凍結し、凍結乾燥機を使用して得られた脂質分解タンパク質サンプルを乾燥させます。予想されるBla g 1収率を決定するために、リフォールディングバッファーの5ミリリットルで凍結乾燥脱脂試験アリコートを再中断する。250ミリリットルの水を含む500ミリリットルのビーカーで混合物を熱し、攪拌と断続的な渦を巻き付けたホットプレートで摂氏95度にします。水浴を室温にゆっくりと平衡させる前に、溶液を95度に30〜60分間保持します。溶液が冷却されたら、0.22ミクロンのシリンジフィルターを通してアニールされたBla g 1脂質混合物を通過させて粒子状物質を除去し、10キロダルトンカットオフを備えた新しい遠心フィルターを使用して濾過されたタンパク質をPBSに3回バッファー交換し、残留フリー脂肪酸および有機溶媒を除去します。次に、標準的なタンパク質分析アッセイを用いてタンパク質濃度を評価し、残りのBla g 1アリコートの予想収量を決定する。Apo-Bla g 1を再構成するために、Bla g 1アリコートをアリコート当たり5ミリリットルのリフォールバッファーで再中断し、サンプルをアニールして示すようにする。リン脂質を含むブラg1をロードするには、ガラス試験管に所望の貨物の10ミリグラムを加え、クロロホルムに溶解し、クロロホルムを蒸発させて脂質膜を作製する。次いで、PBSをチューブに加え、20ミリモルの最終的なリン脂質濃度を生成する。脂質貨物の相転移温度を超えてリン脂質を加熱して脂質膜を水分補給し、溶液が白濁するまで渦を加熱する。次に、リン脂質貨物を加えて、予想される収率に基づいて、Bla g 1に対して20倍のモル過剰のリガンドを生成する。沈殿剤が形成される可能性があります。デモンストレーションしたようにタンパク質を焼鈍する前に混合する渦。リン-31 NMRによる貨物の取り外しまたは積載を確認するには、遠心フィルタを使用してサンプルを100マイクロモル以上に濃縮します。示されているようにPBSバッファー内の既知の濃度の参照リン脂質サンプルを調製し、約600マイクロリットルの総体積に対して、チョレートバッファーとの1:1の比率に対してBla g 1末端参照を希釈する。広帯域プローブを使用して、コルレート可溶化ブラg1サンプルの1次元、31リンNMRスペクトルおよびリン脂質標準を参照し、 そして、リン脂質参照サンプルに対して得られたものと、発端的に結合したリガンドの除去および/または可視ピークの化学シフトに基づく所望のリガンドの結合を確認するために得られたものと、Bla g 1スペクトルのピーク強度をリン脂質基準基準と比較して完全結合のシチトトリムを確認できるようにする。アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組換えGST Bla g 1は、高い純度に容易に単離することができ、細胞培養の1リットル当たり2〜4ミリグラムの収率を生じる。摂氏4度のTEVプロテアーゼによる一晩のインキュベーションは、GSTタグを除去するのに十分であり、約24キロダルトンで最終製品を得る。逆相C18カラムにBla g 1を適用すると、50%バッファBで2つの大きなピークを有する独特の溶出プロファイルが得られ、Apo-Bla g 1の75%バッファB.リン-31 NMRスペクトルで2番目の大きなピークは検出可能なリン脂質を示さない。標準曲線は、既知のDSPC濃度の参照サンプルを使用してNMRから生成することができます。DSPC Bla g 1から得られたリン31シグナル強度をこの標準曲線と比較すると、脂質1タンパク質の結合ストイチオメトリーを得ることができる。アポおよび脂質負荷のBla g 1の円状二色性スペクトルは、主にアルファヘリカル構造を示す220および210ナノメートルのミニマを示す。円形二色性ベースの熱変性アッセイはまた、折り畳まれた球状ドメインを示すα-らせん二次構造の協同組合的損失を示す。さらに、得られた融解温度の分析は、nMixリガンド結合時に有意な増加を明らかにし、その天然アレルゲン源から得られたBla g 1と一致する。このプロトコルの成功は、疎水性リガンドの限られた溶解性と、Bla g 1結合キャビティのアクセス不能な性質の両方を克服する能力に依存しています。この手順は、T細胞増殖アッセイなどの免疫学的研究の基礎を築き、脂質リガンドが感作に及ぼす影響と、これが起こる分子メカニズムを評価する。この手順をさらなる生物物理学的アッセイと結合すると、疎水性リガンドの結合がBla g 1安定性を高め、エピトープ生成およびアレルゲン性に対する潜在的な下流の影響を有することを示した。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

急速に折りたたみと結合の相互作用を特徴付ける不耐熱配位子を持つ生体分子 DSC プロファイルを測定

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...