Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
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우리는 톰 커비 박사, 스콧 가벨, 그리고 로버트 런던 박사의 도움과 도움에 감사드리며, 밥 페트로비치 박사와 로리 에드워즈 박사와 함께 이 연구에서 사용되는 Bla g 1 구체를 생성하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 우리는 질량 분석에 대한 안드레아 아담스와 NMR 계측에 대한 지원을 유진 DeRose 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소, Z01-ES102906 (GAM). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 환경 보건 과학 연구소의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 블라 g 1 복제
<ol><li>바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1.0101 (잔류물 34-216)에 대한 유전자를 획득, MA 도메인의 단일 반복을 나타내는. 단순성을 위해, 블라 g 1은 전체 Bla g 1.0101 성적 증명서가 아닌이 단일 반복을 나타내는 작업 전반에 걸쳐 사용됩니다.</li>
	<li>블라 g 1 유전자를 원하는 벡터로 서브클론한다. 본 연구에서는, 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 분열 부위에 결합된 N-말단 글?...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

이 작품에 기재된 프로토콜은 블라g 1의 지질 결합 특성을 체계적으로 연구하기 위해 성공적으로 적용되었다. 이는 화물 결합, 열안정성 및 내구 처리 사이의 상관관계를 드러냈으며, 후자는 면역원성9,18에대한 잠재적 의미와 알려진 T세포 에피토프의 생성 감소와 상관관계가 있었다. 블라 g 1 외에도, Pru p 3 및 Bet v 1과 같은 다른 알레르겐은 표준 친화성...

알레르겐 데이터베이스를 조사한 결과 알레르겐은 알려진 모든 단백질 가족의 2%만에서 발견되는 것으로 나타났으며, 이는 일반적인 기능성 및 생체학적 특성이 알레르기성1에기여한다는 것을 시사한다. 이러한 특성 중, 지질 화물을 결합하는 능력은 알러지 원 들 사이에서 강하게 과대 대표되는 것으로 보이며, 이러한 화물이 민감화 과정1에영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 실제로, 브라질 너트 알레르겐 Ber e 1은 내인성 지질과 함께 완전한 감이 있는 잠재력2를실현하는 데 협력해야 한다는 것을 보여주었습니다. 이들 지질은 잠재적으로 mite 알레르겐 Der p 2 및 Der p 7에 의해 도시된 바와 같이 면역 체계를 자극할 수 있으며, 둘 다 LPS 결합 단백질3,4,5와함께 강한 구조적 동성학을 공유할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여 Derp 2 및 Der p 7은 세균지질을 결합하고 TLR4 매개 신호를 통해 숙주 면역 체계를 직접 자극하여 민감화 과정5,6을용이하게 할 수 있다고 제안되었다. 내인성 으로 결합된 지질이 알레르기 성 단백질 자체의 생물학적 특성을 바꿀 수 있습니다. 예를 들어, 신a2(겨자) 및 아라 h1(땅콩)이 인지질 소포와 상호작용하는 능력은 위 및 내외 저하7에대한 저항력을 크게 향상시켰으며, 주요 자작나무 꽃가루 알러지 유발 물질 내기 v 1에 결합하는 동안 내구 처리속도와 결과 펩타이드의 다양성을 모두 변화시켰다8. 이는 Bet v 1 및 Bla g 1과 같은 단백질에 대한 안정성, T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 사이에서 관찰된 상관관계를 고려하여 알레르기성과 특히 관련이 있습니다. 후자는 이 작품의 주제가 될 것입니다9,10.
블라g 1은 곤충 주요 알레르겐(MA) 단백질 패밀리의 프로토타입 멤버를 나타내며, 비정상적으로 큰 소수성 충치9,11을둘러싸는 12개의 수륙양용 알파 헬기로 구성된 독특한 구조를 갖는다. 블라 g 1의 사용 가능한 X 선 결정 구조는 결합 된 인지질 또는 지방산 리간드와 일치하는이 캐비티 내의 전자 밀도를 보여줍니다. 31P-NMR 및 질량 분석법에 의해 확인된 추측. 이러한 화물은 본질적으로 이질적이었고, 이들의 조성물은 알레르겐 소스에 크게 의존했으며, 대장균과 P. 목회에서 발현된 재조합 블라 g 1을 위해 관찰된 다른 지질 프로파일이 관찰되었다. 흥미롭게도, 블라 g 1 천연 알레르겐 소스에서 정제 (바퀴벌레 frass) 그것의 결합 부위 내에서 주로 지방산을 포함, 팔미타테의 혼합물, 올레아테, 그리고 stearate의 혼합물로 식별 되는 "자연" 리간드9,11. 여러 정화 단계에 따라 지질과 지방산을 유지하는 Bla g 1의 능력은 격리된 단백질을 연구하는 노력을 방해합니다. 반대로, 블라g 1의 천연 팔미타테, 스테레이트 및 올레아테 리간드가 알레르기성 및 토착 생물학적 기능9모두에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 제안되고 있다. 그러나, 이러한 리간즈는 재조합 소스에서 얻은 블라 g 1에 존재하지 않으며, 이 가설을 평가하기 어렵게 만듭니다. Bet v112,13과같은 다른 지질 결합 알레르겐에 대해도 유사한 문제가 관찰되고 있다. 지질 알레르겐 상호 작용의 체계적인 연구를 용이하게하기 위해 우리는 알레르겐이 내인성 바운드 지질을 정량적으로 제거하고 아포 형태로 재구성하거나 특정 리간드로로드 할 수있는 프로토콜을 개발했습니다.
알레르겐은 친화성 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 자연 또는 재조합 소스에서 가장 일반적으로 정제됩니다. 여기서, 알러지 유발 물질이 지방산 결합단백질(14)에대해 개발된 프로토콜과 유사한 유기 용매로 용출되는 역상 C18 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 형태로 추가 정화 단계를 소개한다. 결과 단백질은 지방산 및/또는 인지질의 부재 또는 존재에 있는 열 어닐링 단계를 복종합니다. 네이티브 Bla g 1 접기를 복구하는 것 외에도, 높은 온도는 지질 화물의 용해도및 접근성을 증가시키고, 아포 형태로 블라 g 1을 산출하거나 원하는 소수성 리간드로 균일하게 로드됩니다. 31 이러한 방식으로 정제된 블라g 1의 P-NMR 스펙트럼은 원하는 화합물과 내인성 바운드 리간드와 균일한 교체의 완전한 제거를 확인했으며, 원형 이색증은 블라 g 1 폴드의 성공적인 회복을 확인하였다. 이 방법의 유용성은 A9 g 1 열안정성 및 보철 저항을 향상시키는 화물 결합이 발견된 최근 작업에서 강조되어 T 세포 에피토프 생성의 운동학을 민감화 및 알레르기성9에대한 잠재적 인 의미로 변경합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

많은 주요 알레르겐은 Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 및 Fel d 1을 포함하여 소수성 지질과 같은 분자에 결합합니다. 이러한 리간드는 강하게 유지되며 면역 체계를 직접 자극하거나 알레르기 성 단백질의 생물 학적 특성을 변경하여 감쇠 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 변수를 제어하기 위해서는 내인성 바운드 리간드를 제거하고 필요한 경우 알려진 조성물의 지질을 대체하는 데 기술이 필요합니다. 바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1은 전통적인 기술을 사용하여 정제 할 때 내생 지질의 이질적 혼합물을 결합하는 큰 소수성 구멍을 둘러싸고 있습니다. 여기서는 역상 HPLC를 사용하여 이러한 지질을 제거한 다음 열 어닐링으로 아포 형태로 Bla g 1을 산출하거나 지방산 또는 인지질화물의 사용자 정의 혼합물로 재장전되는 방법을 설명합니다. 생화학적 분석과 이 프로토콜을 결합하면 지방산 화물이 Bla g 1의 열안정성 및 보철 저항을 크게 변화시키고 T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 속도에 대한 하류에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 재조합 및 천연 소스 모두에서 알레르겐을 연구할 때 본원에 설명된 것과 같은 지질 제거/재장전 프로토콜의 중요성을 강조한다. 이 프로토콜은 리포칼린(Mus m 1), PR-10(Bet v 1), MD-2(Der p 2) 및 우트로글로빈(Fel d 1)을 포함한 다른 알레르겐 가족에게 일반화되어 알레르기 반응에서 지질의 역할을 연구하는 귀중한 도구를 제공한다.

친화도 크로마토그래피를 사용하여, 재조합 GST-Bla g 1은 세포 배양의 ~2-4 mg/L의 수율을 생성하여 높은 수준의 순도(도1A)로쉽게 분리되었다. 4°C에서 TEV 프로테아제를 사용하여 하룻밤 배양하면 GST 태그를 제거하기에 충분하여 ~24 kDa에서 최종 생성물을 산출합니다. 이 경우 유량 통과 및 세척 분획에 상당한 양의 GST-Bla g 1이 있어 글루타티온 수지 결합 용량을 초과한 것을 시사합니다. ?...

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

이 프로토콜은 알레르겐에서 내인성 지질의 제거를 설명하고, 열 어닐링과 결합 된 역단계 HPLC를 통해 사용자 지정 리간드로 교체. 31 P-NMR 및 원형 이크로이즘은 리간드 제거/로딩의 신속한 확인과 토착 알레르겐 구조의 회복을 허용한다.

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

많은 알레르겐은 소수성 분자를 결합합니다. 이 프로토콜은 이러한 리간드의 완전한 제거 및 교체를 가능하게 하여 체계적인 방식으로 구조 및 면역원성에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 역상 HPLC를 열 어닐링과 결합한 사용은 두 가지 장점이 있습니다.그것은 내인성 리간드를 제거하고, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 바인딩 사이트를 열기 위해 리간드를 용해하는 데 도움이됩니다. 우리가 알레르기성에 기여하는 요인을 결정할 수 있는 경우에, 우리는 이 요인을 피하는 치료를 디자인할 수 있을지도 모릅니다. 많은 단백질은 강하게 유지되고 구조와 기능 둘 다에 영향을 미칠 수 있는 지질 리간드를 결합합니다.우리의 방법은 이러한 상호 작용의 체계적인 연구를 할 수 있습니다. 많은 지질화물의 제한된 용해도 및 접근성은 로딩 공정을 저해할 수 있다. 이러한 리간드를 준비할 때주의하고 시스템별 적응의 필요성을 고려해야 합니다.소수성 및 용해성 리간드와 함께 일하는 것은 일부 알레르기 학자 및 생화학자에 대한 조정이므로 샘플이 다른 단계에서 어떻게 생겼는지 보는 것이 유용 할 수 있습니다. 복제 식 및 정화 후, 총 부피가 2 밀리리터 미만으로 감소 될 때까지 스윙 버킷 로터에서 여러 원심 분리에 대한 10 킬로달톤 분자 량 차단이있는 원심 필터 장치에 12 밀리리터를 적용합니다. 결과 농축액을 250 x 10mm HPLC 시스템에 로드하여 C18 역상 크로마토그래피 컬럼을 장착하여 97%의 완충A와 3%버퍼 B.Elute Bla g 1을 분당 1.5 내지 4 밀리리터의 유량으로 평가하여, 표에 표시된 바와 같이, 280 나노미터에서 형광 흡수흡수를 이용하여 280 나노미터의 형광 흡수를 이용하여.약 34~40분에서 시작하여 74% 이상의 완충B 농도는 각 Bla g 1 분획의 4밀리리터를 더 이상 수집하지 않습니다. 유리 테스트 튜브에 풀라 g 1 분획을 알리 쿼트. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 두 개의 구멍으로 필름을 천공합니다.그런 다음 샘플을 영하 80도에서 1시간 동안 동결하고 리오필라이저를 사용하여 그 결과로 생성된 탈립 단백질 샘플을 건조시로 건조시합니다. 예상 블라 g 1 수율을 결정하려면, 재접이식 버퍼의 5 밀리리터에서 lyophilized 제거 된 테스트 알리쿼트다시 일시 중단. 혼합물을 500밀리리터 비커에 넣고 250밀리리터의 물을 넣고 교반하고 간헐적인 소용돌이가 있는 뜨거운 접시에 섭씨 95도까지 가열합니다.용액을 30~60분간 95도 유지한 후 수조가 실온과 서서히 평형화될 수 있도록 합니다. 용액이 냉각되면, 미립자를 제거하기 위해 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 아닐블라 g 1 지질 혼합물을 전달하고, 10킬로달톤 컷오프가 있는 새로운 원심 필터를 사용하여 여과된 단백질을 PBS로 3번 교환하여 잔류 지방산과 유기용매를 제거한다. 이어서, 표준 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도를 평가하여 남은 블라 g 1 알리쿼트에 대한 예상 수율을 결정한다.Apo-Bla g 1을 재구성하려면 알리쿼트당 5밀리리터의 다시 접이식 버퍼로 블라 g 1 알리쿼트를 다시 중단하고, 시연된 대로 샘플을 음결한다. 인지질을 사용하여 Bla g 1을 적재하려면 원하는 화물 10밀리그램을 유리 테스트 튜브에 추가하고 클로로폼에 용해하고 클로로폼을 증발하여 지질 필름을 생성합니다. 그런 다음 튜브에 PBS를 추가하여 20 밀리머의 최종 인지질 농도를 생성합니다.지질화물의 위상 전이 온도 위에 인지질을 가열하여 지질 필름을 재수화하고 용액이 흐리게 될 때까지 소용돌이를 가열합니다. 이어서, 예상 수율에 기초하여 블라g 1에 비해 20배 의 굴리 초과를 생성하기 위해 인지질화물을 첨가한다. 침전제가 형성될 수 있습니다.소용돌이는 입증 된 바와 같이 단백질을 어닐링하기 전에 혼합합니다. 인-31 NMR에 의한 화물 제거 또는 적재를 확인하려면 원심 필터를 사용하여 시료를 100 마이크로몰라 이상으로 농축한다. 표시된 바와 같이 PBS 버퍼에서 알려진 농도의 기준 인지질 샘플을 준비하고, 약 600 마이크로리터의 총 부피에 초레이트 버퍼를 가진 1:1 비율로 블라 g 1 엔드 참조를 희석한다.광대역 프로브를 사용하여 콜레이트 용해 블라 g 1 샘플 및 참조 인지질 표준의 1차원, 31-인 NMR 스펙트럼을 획득하고, 블라g 1 31인NMR 스펙트럼을 인지질 기준 시료에 대해 수득된 것과 비교하여 가시 피크의 화학적 변화에 기초하여 원하는 리간드의 내인성 바운드 리간드 및/또는 결합의 제거를 확인한 다음, 블라g 1 스펙트럼의 피크 강도를 포인지질 기준의 고유 강도를 완전한 확인을 허용한다. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 GST Bla g 1은 높은 수준의 순도로 쉽게 분리되어 세포 배양 리터당 2 ~4 밀리그램의 수율을 생성할 수 있습니다. TEV 프로테아제와 함께 하룻밤 잠복은 GST 태그를 제거하기에 충분하여 약 24 킬로달톤의 최종 제품을 산출합니다.블라 g 1을 역상 C18 컬럼에 적용하면 독특한 용출 프로파일을 생성하며, 50% 버퍼 B에서 두 개의 큰 피크가 있고, 아포-블라 g 1의 75% 버퍼 B.Phosphorus-31 NMR 스펙트럼에서 두 번째로 큰 피크는 감지 가능한 인지질을 나타내지 않습니다. 표준 곡선은 알려진 DSPC 농도의 참조 샘플을 사용하여 NMR에서 생성될 수 있다. DSPC Bla g 1로부터 얻은 인 31 신호 강도를 이 표준 곡선과 비교하여 단백질당 지질의 결합 스토이치오메트리를 산출하는 데 사용할 수 있다.아포 및 지질로드 블라 g 1에 대한 원형 이색 스펙트럼은 주로 알파 -헬리칼 구조를 나타내는 220 및 210 나노미터의 미니마를 보여줍니다. 원형 이크로이즘 기반열 성소 해석은 또한 접힌 구형 도메인을 나타내는 알파-헬릭 이차 구조의 협동 손실을 나타낸다. 또한, 그 결과 용융 온도의 분석은 천연 알레르겐 소스에서 얻은 Bla g 1과 일치하는 nMix 리간드 결합시 상당한 증가를 나타낸다.이 프로토콜의 성공은 소수성 리간드의 제한된 용해도와 Bla g 1 결합 공동의 접근 불가능한 특성을 모두 극복하는 능력에 의존합니다. 이 절차는 T 세포 증식 분석과 같은 면역 학적 연구를위한 기초를 놓고, 이 발생을 통해 감수화및 분자 메커니즘에 지질 리간드의 효과를 평가하기 위해. 추가 생물 물리학 적 assays와이 절차를 결합, 우리는 소수성 리간드의 결합은 에피토프 생성 및 알레르기성에 대한 잠재적 다운스트림 의미와 함께, 블라 g 1 안정성을 향상 것으로 나타났습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

연구

생화학

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

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절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...