Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e Dr. Robert London por sua ajuda e assistência durante este trabalho, juntamente com o Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards pelo uso de sua instrumentação e sua ajuda na geração das construções Bla g 1 empregadas neste estudo. Agradecemos a Andrea Adams pela ajuda com a espectrometria de massa, e o Dr. Eugene DeRose pela ajuda com a instrumentação do RMN. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental.

1. Bla g 1 clonagem
<ol><li>Obter gene para alergênico de barata Bla g 1.0101 (resíduos 34-216), representando uma única repetição do domínio MA. Por uma questão de simplicidade, Bla g 1 será usado durante todo o trabalho para representar essa única repetição, em vez de toda a transcrição bla g 1.0101.</li>
	<li>Subclone o gene Bla g 1 no vetor desejado. Neste estudo, o gene contendo uma tag de glutationa S-transferase (GST) n-terminal acoplado a um local de decote protease do vírus da es...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

O protocolo descrito neste trabalho tem sido aplicado com sucesso para estudar sistematicamente as propriedades de ligação lipídica de Bla g 1. Isso revelou uma correlação entre ligação de carga, termestabilidade e processamento endossomal, sendo que este último foi correlacionado com a diminuição da geração de um epítope conhecido de células T com potenciais implicações para a imunogenicidade9,18. Além de Bla g 1, outros alérgenos como Pru p 3 ...

Um levantamento do banco de dados de alérgenos revela que os alérgenos são encontrados em apenas 2% de todas as famílias de proteínas conhecidas, sugerindo que propriedades funcionais e biofísicas comuns contribuem para a alergenicidade1. Dessas propriedades, a capacidade de vincular cargas lipídicas parece estar fortemente super-representada entre os alérgenos, sugerindo que essas cargas podem influenciar o processo de sensibilização1. De fato, foi demonstrado que o alergênico Brazil Nut Ber e 1 requer coadministração com seu lipídio endógeno para realizar seu potencial de sensibilização plena2. Esses lipídios poderiam potencialmente estimular o sistema imunológico diretamente como ilustrado pelos alérgenos ácaros Der p 2 e Der p 7, ambos compartilhando uma forte homologia estrutural com proteínas de ligação LPS3,4,5. Com base nessa observação foi proposto que o Derp 2 e o Der p 7 poderiam ligar lipídios bacterianos e estimular diretamente o sistema imunológico hospedeiro através da sinalização mediada pelo TLR4, facilitando o processo de sensibilização5,6. Também é possível que lipídios endógenos ligados possam alterar as propriedades biofísicas das próprias proteínas alergênicas. Por exemplo, a capacidade de Sin a 2 (mostarda) e Ara h 1 (amendoim) de interagir com vesículas fosfolipítidas aumentou significativamente sua resistência à degradação gástrica e endossomal7,enquanto ligante ao alergênico principal do pólen de bétula Bet v 1 alterou tanto a taxa de processamento endosomal quanto a diversidade dos peptídeosresultantes 8. Isso é particularmente relevante para a alergenicidade dada a correlação observada entre estabilidade, geração de epítopes de células T e alergenicidade para proteínas como Bet v 1 e Bla g 1; este último será o tema deste trabalho9,10.
Bla g 1 representa o membro prototípico da família de proteínas do inseto Major Allergen (MA), e possui uma estrutura única composta de 12 helices alfa anfípáticas que incluem uma cavidade hidrofóbica anormalmente grande9,11. A estrutura de cristal de raios-X disponível de Bla g 1 mostra densidade eletrônica dentro desta cavidade consistente com ligantes fosfolipídid ou ácidos graxos ligados; uma conjectura confirmada por 31P-NMR e espectrometria de massa. Essas cargas eram de natureza heterogênea e sua composição dependia fortemente da fonte alérgica, com diferentes perfis lipídicos observados para recombinante Bla g 1 expresso em E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de sua fonte de alérgeno natural (barata frass) continha ácidos predominantemente graxos dentro de seu local de ligação, com uma mistura de palmitato, oleato e estearato sendo identificado como seus ligantes "naturais"9,11. A capacidade de Bla g 1 de reter lipídios e ácidos graxos após múltiplas etapas de purificação dificulta os esforços para estudar a proteína isoladamente. Por outro lado, tem sido sugerido que os ligantes palmitato, estelato e oleate naturais de Bla g 1 (a partir de agora referido como nMix) desempenham um papel fundamental tanto em sua alergenicidade quanto na função biológica nativa9. No entanto, esses ligantes não estão presentes no Bla g 1 obtidos a partir de fontes recombinantes, dificultando a avaliação dessa hipótese. Problemas semelhantes foram observados para outros alérgenos de ligação lipídica, como Bet v 112,13. Para facilitar o estudo sistemático das interações lipídica-alergênicos desenvolvemos um protocolo através do qual os alérgenos podem ser quantitativamente despojados de seus lipídios endógenos ligados e reconstituídos em forma de Apo ou carregados com ligantes específicos.
Os alérgenos são mais comumente purificados de suas fontes naturais ou recombinantes usando cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. Aqui, introduzimos uma etapa adicional de purificação na forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) empregando uma coluna C18 de fase inversa da qual o alérgeno é elucido em um solvente orgânico semelhante aos protocolos desenvolvidos para proteínas de ligação de ácidos graxos14. A proteína resultante é então submetida a um passo de ressarcimento térmico na ausência ou presença de ácidos graxos e/ou fosfolipídios. Além de recuperar a dobra bla g 1 nativa, as temperaturas elevadas aumentam a solubilidade e a acessibilidade das cargas lipídicas, produzindo Bla g 1 na forma de Apo ou uniformemente carregada com o ligante hidrofóbico desejado. 31 Os espectros P-NMR de Bla g 1 purificados desta forma confirmaram a remoção completa de ligantes endógenos e substituição uniforme com os compostos desejados, enquanto o dicromaísmo circular confirmou a recuperação bem sucedida da dobra Bla g 1. A utilidade deste método é destacada em um trabalho recente no qual a vinculação de carga foi encontrada para aumentar a termestabilidade bla g 1 e resistência proteolítica, alterando a cinética da geração de epitope de células T com potenciais implicações para sensibilização e alergenicidade9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Muitos alérgenos principais se ligam a moléculas hidrofóbicas semelhantes a lipídios, incluindo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Esses ligantes são fortemente retidos e têm o potencial de influenciar o processo de sensibilização, seja estimulando diretamente o sistema imunológico ou alterando as propriedades biofísicas da proteína alergênica. Para controlar essas variáveis, são necessárias técnicas para a remoção de ligantes endógenos e, se necessário, substituição por lipídios de composição conhecida. O alérgeno da barata Bla g 1 inclui uma grande cavidade hidrofóbica que une uma mistura heterogênea de lipídios endógenos quando purificado usando técnicas tradicionais. Aqui, descrevemos um método através do qual esses lipídios são removidos usando HPLC de fase reversa seguido de ressarcimento térmico para produzir Bla g 1 em sua forma Apo ou recarregado com uma mistura definida pelo usuário de ácido graxo ou cargas fosfolipídicas. Acoplamento deste protocolo com ensaios bioquímicos revela que as cargas de ácidos graxos alteram significativamente a termoestabilidade e a resistência proteolítica de Bla g 1, com implicações a jusante para a taxa de geração de epítopes de células T e alergenicidade. Esses resultados destacam a importância de protocolos de remoção/recarga lipídica, como o aqui descrito ao estudar alérgenos de fontes recombinantes e naturais. O protocolo é generalizável para outras famílias alérgenas, incluindo lipocalinas (Mus m 1), PR-10 (Aposta v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar o papel dos lipídios na resposta alérgica.

Usando cromatografia de afinidade, o GST-Bla g 1 recombinante foi prontamente isolado a um alto nível de pureza(Figura 1A),produzindo um rendimento de ~2-4 mg/L de cultura celular. A incubação noturna com protease TEV a 4 °C é suficiente para remover a tag GST, rendendo o produto final a ~24 kDa. Observe que, neste caso, há uma quantidade significativa de GST-Bla g 1 nas frações de fluxo e lavagem, sugerindo que a capacidade de ligação de resina glutathione foi excedida. O uso de mais resina ou...

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Este protocolo descreve a remoção de lipídios endógenos de alérgenos, e sua substituição por ligantes especificados pelo usuário através de HPLC de fase inversa, juntamente com ressarcimento térmico. 31 P-NMR e dicromaísmo circular permitem a confirmação rápida da remoção/carregamento de ligantes e a recuperação da estrutura de alergênicos nativos.

Remoção e Substituição de Ligantes Endógenos de Proteínas e Alérgenos Lipid-Bound

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Muitos alérgenos ligam moléculas hidrofóbicas. Este protocolo permite a remoção completa e substituição desses ligantes, permitindo-nos estudar seu impacto na estrutura e na imunogenicidade de forma sistemática. O uso do HPLC de fase inversa, aliado ao ressarcimento térmico, tem duas vantagens.Ele remove ligantes endógenos, e ajuda a solubilizar ligantes para abrir locais de ligação inacessíveis. Se pudermos determinar os fatores que contribuem para a alergenicidade, podemos ser capazes de projetar terapias que evitem esses fatores. Muitas proteínas ligam ligantes lipídicos, que são fortemente retidos e podem influenciar tanto a estrutura quanto a função.Nosso método permite o estudo sistemático dessas interações. A solubilidade limitada e a acessibilidade de muitas cargas lipídicas podem inibir o processo de carregamento. Certifique-se de cuidar ao preparar esses ligantes e considerar a necessidade de adaptações específicas do sistema.Como trabalhar com ligantes hidrofóbicos e insolúveis é um ajuste para alguns alergistas e bioquímicos, pode ser útil ver como as amostras se parecem em diferentes estágios. Após a clonagem da expressão e purificação, aplique 12 mililitros do Bla g 1 cerrado a uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de menos de 10 quilodalton para múltiplas centrífugas em um rotor de balde de balanço até que o volume total tenha sido reduzido a menos de dois mililitros. Carregue o concentrado resultante em um sistema HPLC de 250 por 10 milímetros equipado com uma coluna de cromatografia de fase reversa C18 equilibrada com 97% tampão A e 3% tampão B.Elute Bla g 1 a uma taxa de fluxo de 1,5 a 4 mililitro por minuto, conforme indicado na tabela, usando a absorvência de fluorescência em 280 nanômetros para monitorar o processo de elução.A partir de cerca de 34 a 40 minutos e uma concentração de buffer B acima de 74% coletam não mais do que quatro mililitros de cada fração Bla g 1. Aliquot a fração Bla g 1 agrupada em tubos de teste de vidro. Cubra os tubos com filme de parafina e perfure o filme com dois buracos.Em seguida, congele as amostras a menos 80 graus Celsius por uma hora e use um liofilizador para secar as amostras de proteínas desalíidas resultantes. Para determinar o rendimento de Bla g 1 antecipado, suspenda desagrava uma alíquota de teste desfiliada liofilizada em cinco mililitros de tampão de repato. Aqueça a mistura em um béquer de 500 mililitros contendo 250 mililitros de água a 95 graus Celsius em uma placa quente com vórtice de agitação e intermitente.Segure a solução em 95 graus por 30 a 60 minutos antes de permitir que o banho de água se equilibre lentamente à temperatura ambiente. Quando a solução tiver esfriado, passe a mistura lipídica Bla g 1 edaled através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover material particulado, e use um novo filtro centrífuga com um corte de 10 kilodalton para tampão trocar a proteína filtrada três vezes em PBS para remover quaisquer ácidos graxos livres residuais e solvente orgânico. Em seguida, avalie a concentração proteica utilizando um ensaio padrão de análise de proteínas para determinar o rendimento previsto para as alíquotas restantes de Bla g 1.Para reconstituir o Apo-Bla g 1, suspenda novamente as alíquotas Bla g 1 em cinco mililitros de tampão de repato por alíquota, e recotre as amostras conforme demonstrado. Para carregar o Bla g 1 com fosfolipídios, adicione 10 miligramas da carga desejada a um tubo de teste de vidro e dissolva-se em clorofórmio, e evaporar o clorofórmio para produzir um filme lipídedo. Em seguida, adicione PBS ao tubo para produzir uma concentração fosfolipítida final de 20 milimiliar.Aqueça o fosfolipídio acima da temperatura de transição de fase da carga lipídica para reidratar o filme lipíduo e o vórtice até que a solução fique nublada. Em seguida, adicione a carga lipídica fosfo para produzir um excesso molar de 20X de ligantes em relação a Bla g 1 com base no rendimento previsto. Um precipitante pode se formar.Vórtice para misturar antes de ressarar a proteína como demonstrado. Para confirmar a remoção ou carregamento de carga por fósforo-31 NMR, use um filtro centrífuga para concentrar a amostra a mais de 100 micromolars, como demonstrado. Prepare amostras fosfolipíides de referência de concentrações conhecidas no buffer PBS como indicado, e dilua a referência final bla g 1 a uma razão de 1:1 com tampão de colado para um volume total de cerca de 600 microliters.Use uma sonda de banda larga para adquirir espectros NMR de 31-fósforos unidimensionais do coládido solubilizado Bla g 1 e padrões fosfolipídid de referência, e compare o espectro de NMR fosforoso bla g 1 31 com os obtidos para amostras de referência fosfolipípica para confirmar a remoção de ligantes endógenos e/ou a ligação dos ligantes desejados com base nas mudanças químicas dos picos visíveis, em seguida, compare a intensidade máxima do espectro Bla g 1 com a dos padrões de referência fosfolipídid para permitir a confirmação da estequiometria de ligação completa. Usando cromatografia de afinidade, o GST Bla g 1 recombinante pode ser prontamente isolado a um alto nível de pureza, produzindo um rendimento de dois a quatro miligramas por litro de cultura celular. A incubação noturna com protease TEV a quatro graus Celsius é suficiente para remover a tag GST, produzindo o produto final em aproximadamente 24 kilodaltons.A aplicação do Bla g 1 a uma coluna C18 de fase inversa produz um perfil de elução distinto, com dois picos grandes a 50% de buffer B, e um segundo grande pico em 75% tampão B.Phosphorus-31 NMR espectros de Apo-Bla g 1 não mostram fósforos detectáveis. Uma curva padrão pode ser produzida a partir do NMR usando amostras de referência de concentrações de DSPC conhecidas. Comparando a intensidade do sinal fosforoso 31 obtida do DSPC Bla g 1 com esta curva padrão pode ser usado para produzir a estequiometria de ligação dos lipídios por proteína.Espectros de dicroma circular para Apo-e lipídios carregados Bla g 1 mostram minima de 220 e 210 nanômetros, indicativo de uma estrutura predominantemente alfa-helicoidal. Ensaios de desnaturação térmica baseados em dicromaísmo circular também mostram uma perda cooperativa de estrutura secundária alfa-helicana, indicativo de um domínio globular dobrado. Além disso, a análise das temperaturas de fusão resultantes revela um aumento significativo sobre a ligação de ligantes nMix, consistente com Bla g 1 obtido de sua fonte de alergênico natural.O sucesso deste protocolo baseia-se na capacidade de superar tanto a solubilidade limitada dos ligantes hidrofóbicos, quanto a natureza inacessível da cavidade de ligação Bla g 1. Este procedimento estabelece as bases para estudos imunológicos, como ensaios de proliferação de células T, para avaliar o efeito dos ligantes lipídicos na sensibilização e os mecanismos moleculares pelos quais isso ocorre. Acoplando este procedimento com outros ensaios biofísicos, mostramos que a ligação de ligantes hidrofóbicos aumenta a estabilidade de Bla g 1, com potenciais implicações a jusante para geração de epítope e alergenicidade.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Bioquímica

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...