Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Тома Кирби, Скотта Габеля и д-ра Роберта Лондона за их помощь и содействие на протяжении всей этой работы, а также д-ра Боба Петровича и Лори Эдвардс за использование их инструментов и их помощь в создании конструкций Bla g 1, используемых в этом исследовании. Мы благодарим Андреа Адамс за помощь в масс-спектрометрии и доктора Юджина ДеРоуза за помощь с приборами ЯМР. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальным институтом наук о здоровье окружающей среды, Z01-ES102906 (GAM). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института наук о гигиене окружающей среды.

1. Bla g 1 клонирование
<ol><li>Получают ген таракана аллерген Bla g 1.0101 (остатки 34-216), представляющий собой единый повтор домена МА. Для простоты Bla g 1 будет использоваться на протяжении всей работы, чтобы представить этот единственный повтор, а не всю стенограмму Bla g 1.0101.</li>
	<li>Субклон г...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

Протокол, описанный в данной работе, был успешно применен для систематического изучения липидсвязывающих свойств Bla g 1. Это выявило корреляцию между связыванием груза, термостабильностью и эндосомальной обработкой, последняя из которых коррелировала со снижением генерации известног?...

Исследование базы данных аллергенов показывает, что аллергены встречаются только в 2% всех известных семейств белков, предполагая, что общие функциональные и биофизические свойства способствуют аллергенности1. Из этих свойств способность связывать липидные грузы, по-видимому, сильно перепредставлена среди аллергенов, что позволяет предположить, что эти грузы могут влиять на процесс сенсибилизации1. Действительно, было показано, что аллерген бразильского ореха Ber e 1 требует совместного введения с его эндогенным липидом для реализации его полного сенсибилизирующего потенциала2. Эти липиды могут потенциально стимулировать иммунную систему непосредственно, как показано аллергенами клеща Der p 2 и Der p 7, оба из которых имеют сильную структурную гомологию с LPS-связывающими белками3,4,5. На основе этого наблюдения было высказано предположение, что Derp 2 и Der p 7 могут связывать бактериальные липиды и непосредственно стимулировать иммунную систему хозяина посредством TLR4-опосредования сигнализации, облегчая процесс сенсибилизации5,6. Также возможно, что эндогенно связанные липиды могут изменять биофизические свойства самих аллергенных белков. Например, способность Sin a 2 (горчица) и Ara h 1 (арахис) взаимодействовать с фосфолипидными везикулами значительно усилила их устойчивость к желудочной и эндосомальной деградации7,в то время как связывание лигандов с основным аллергеном пыльцы березы Bet v 1 изменяло как скорость эндосомальной обработки, так и разнообразие полученныхпептидов 8. Это особенно актуально для аллергенности, учитывая корреляцию, которая наблюдалась между стабильностью, генерацией эпитопа Т-клеток и аллергенностью для белков, таких как Bet v 1 и Bla g 1; последний из которых будет предметом настоящей работы9,10.
Bla g 1 представляет собой прототип члена семейства белков основных аллергенов насекомых (MA) и обладает уникальной структурой, состоящей из 12 амфипатических альфа-хеликул, которые заключают аномально большую гидрофобную полость9,11. Доступная рентгеновская кристаллическая структура Bla g 1 показывает электронную плотность в этой полости, согласуемую со связанными фосфолипидными или жирными кислотными лигандами; гипотеза, подтвержденная 31П-ЯМР и масс-спектрометрией. Эти грузы были неоднородными по своей природе, и их состав сильно зависел от источника аллергена, причем различные липидные профили наблюдались для рекомбинантного Bla g 1, выраженного у E. coli и P. pastoris. Любопытно, что Bla g 1, очищенный от своего естественного источника аллергена (таракан фрасс), содержал преимущественно жирные кислоты в своем месте связывания, причем смесь пальмитата, олеата и стеарата была идентифицирована как его «естественные» лиганды9,11. Способность Bla g 1 удерживать липиды и жирные кислоты после нескольких этапов очистки препятствует усилиям по изучению белка в изоляции. И наоборот, было высказано предположение, что естественные пальмитатные, стеаратные и олеатные лиганды Bla g 1 (далее именуемые nMix) играют ключевую роль как в его аллергенности, так и в нативной биологической функции9. Однако эти лиганды отсутствуют в Bla g 1, полученном из рекомбинантных источников, что затрудняет оценку этой гипотезы. Аналогичные проблемы наблюдались для других аллергенов, связывающих липиды, таких как Bet v1 12,13. Чтобы облегчить систематическое изучение липидно-аллергенных взаимодействий, мы разработали протокол, с помощью которого аллергены могут быть количественно лишены своих эндогенно связанных липидов и восстановлены либо в Апо-форме, либо загружены специфическими лигандами.
Аллергены чаще всего очищают от их естественных или рекомбинантных источников с использованием аффинной хроматографии и/или хроматографии с исключением размера. Здесь мы вводим дополнительную стадию очистки в виде высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки C18 обратной фазы, из которой аллерген элюируется в органический растворитель, аналогичный протоколам, разработанным для белков14 связыванияжирных кислот. Полученный белок затем подвергают термическому отжигу в отсутствие или присутствие жирных кислот и/или фосфолипидов. В дополнение к восстановлению нативного Bla g 1 раза, повышенные температуры увеличивают растворимость и доступность липидных грузов, давая Bla g 1 либо в Апо-форме, либо равномерно загруженный желаемым гидрофобным лигандом. 31 31 Очищенные таким образом P-ЯМР спектры Bla g 1 подтвердили полное удаление эндогенно связанных лигандов и равномерное замещение желаемыми соединениями, в то время как круговой дихроизм подтвердил успешное восстановление Bla g 1 раза. Полезность этого метода подчеркивается в недавней работе, в которой было обнаружено, что связывание груза усиливает термостабильность Bla g 1 и протеолитическую резистентность, изменяя кинетику генерации эпитопов Т-клеток с потенциальными последствиями для сенсибилизации и аллергенности9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Многие основные аллергены связываются с гидрофобными липидоподобными молекулами, включая Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 и Fel d 1. Эти лиганды сильно сохраняются и могут влиять на процесс сенсибилизации либо путем прямой стимуляции иммунной системы, либо путем изменения биофизических свойств аллергенного белка. Для контроля этих переменных требуются методы удаления эндогенно связанных лигандов и, при необходимости, замещения липидами известного состава. Аллерген таракана Bla g 1 заключает в себе большую гидрофобную полость, которая связывает гетерогенную смесь эндогенных липидов при очистке с использованием традиционных методов. Здесь мы описываем способ, с помощью которого эти липиды удаляются с использованием обратнофазной ВЭЖХ с последующим термическим отжигом с получением Bla g 1 в его Апо-форме или перезагружается пользовательской смесью жирных кислот или фосфолипидных грузов. Соединение этого протокола с биохимическими анализами показывает, что грузы жирных кислот значительно изменяют термостабильность и протеолитическую устойчивость Bla g 1, что имеет последующие последствия для скорости генерации эпитопа Т-клеток и аллергенности. Эти результаты подчеркивают важность протоколов удаления/перезагрузки липидов, таких как описанный в настоящем описании, при изучении аллергенов как из рекомбинантных, так и из природных источников. Протокол обобщается на другие семейства аллергенов, включая липокалины (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) и Утероглобин (Fel d 1), обеспечивая ценный инструмент для изучения роли липидов в аллергической реакции.

Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST-Bla g 1 легко изолировали до высокого уровня чистоты(Рисунок 1A),получая выход ~ 2-4 мг / л клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при 4 °C достаточно для удаления метки GST, в результате получения конечного продукта при ~24 ...

Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Этот протокол описывает удаление эндогенных липидов из аллергенов и их замену указанными пользователем лигандами посредством обратнофазной ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом. 31 31 P-ЯМР и круговой дихроизм позволяют быстро подтвердить удаление/нагрузку лиганда и восстановление нативной структуры аллергена.

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Многие аллергены связывают гидрофобные молекулы. Этот протокол позволяет полностью удалить и заменить эти лиганды, что позволяет нам систематически изучать их влияние на структуру и иммуногенность. Использование обратнофазного ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом имеет два преимущества.Он удаляет эндогенные лиганды и помогает солюбилизировать лиганды, чтобы открыть недоступные в противном случае сайты связывания. Если мы сможем определить факторы, которые способствуют аллергенности, мы сможем разработать методы лечения, которые избегают этих факторов. Многие белки связывают липидные лиганды, которые сильно сохраняются и могут влиять как на структуру, так и на функцию.Наш метод позволяет систематически изучать эти взаимодействия. Ограниченная растворимость и доступность многих липидных грузов может препятствовать процессу погрузки. Обязательно позаботьтесь об этом при подготовке этих лигандов и рассмотрите необходимость системных адаптаций.Поскольку работа с гидрофобными и нерастворимыми лигандами является корректировкой для некоторых аллергологов и биохимиков, может быть полезно посмотреть, как выглядят образцы на разных этапах. После клонирования экспрессии и очистки применяют 12 миллилитров расщепленного Bla g 1 к центробежному фильтру с отсечкой молекулярной массы менее 10 килодалтон для многократных центрифугаций в поворотном роторе ковша до тех пор, пока общий объем не будет уменьшен до менее чем двух миллилитров. Загрузите полученный концентрат в систему ВЭЖХ 250 на 10 мм, оснащенную реверсивно-фазовой хроматографической колонкой C18, уравновешиваемой 97%-буфером A и 3%-ным буфером B.Elute Bla g 1 со скоростью потока от 1,5 до 4 миллилитров в минуту, как указано в таблице, используя флуоресцентное поглощение на 280 нанометров для мониторинга процесса элюирования.Начиная примерно с 34-40 минут и буферная концентрация B выше 74%, собирают не более четырех миллилитров каждой фракции Bla g 1. Аликвот объединенную фракцию Bla g 1 в стеклянные пробирки. Накройте тюбики парафиновой пленкой и процедийте пленку двумя отверстиями.Затем заморозьте образцы при минус 80 градусах Цельсия в течение одного часа и используйте лиофилизатор для сушки полученных делипидированных образцов белка. Для определения ожидаемого выхода Bla g 1 повторно суспендируют лиофилизированную делипидированную тестовую аликвоту в пяти миллилитрах буфера рефолдирования. Нагрейте смесь в 500-миллилитровом мучке, содержащем 250 миллилитров воды до 95 градусов Цельсия, на конфорке с перемешиванием и прерывистым вихрем.Держите раствор при температуре 95 градусов в течение 30-60 минут, прежде чем дать водяной бане медленно уравновеситься до комнатной температуры. Когда раствор остынет, пропустите отожженную липидную смесь Bla g 1 через шприцевый фильтр 0,22 микрона для удаления твердых частиц и используйте новый центробежный фильтр с отсечкой 10 килодалтон для буферного обмена фильтрованного белка три раза на PBS для удаления любых остаточных свободных жирных кислот и органического растворителя. Затем оцените концентрацию белка с помощью стандартного анализа белка, чтобы определить ожидаемый выход для оставшихся аликвот Bla g 1.Чтобы восстановить Apo-Bla g 1, повторно приостановите аликвоты Bla g 1 в пяти миллилитрах буфера переворачивания на аликвоту и отожгите образцы, как показано на продемонстрированной. Чтобы загрузить Bla g 1 фосфолипидами, добавьте 10 миллиграммов желаемого груза в стеклянную пробирку и растворите в хлороформе, а хлороформ испарите для получения липидной пленки. Затем добавьте PBS в трубку, чтобы получить конечную концентрацию фосфолипида 20 миллимоляров.Нагревают фосфолипид выше температуры фазового перехода липидного груза для регидратировать липидную пленку и вихрь до тех пор, пока раствор не станет мутным. Затем добавьте фосфолипидный груз для получения 20-кратного молярного избытка лигандов по отношению к Bla g 1 на основе ожидаемого выхода. Может образоваться осадитель.Вихрь для смешивания перед отжигом белка, как показано на демонстрации. Чтобы подтвердить удаление или погрузку груза с помощью ЯМР фосфора-31, используйте центробежный фильтр для концентрации образца до более чем 100 микромоляров, как показано на примере. Подготовьте образцы эталонных фосфолипидов известных концентраций в буфере PBS, как указано, и разбавьте концевую ссылку Bla g 1 до соотношения 1:1 с холатным буфером на общий объем около 600 микролитров.Используйте широкополосный зонд для получения одномерных 31-фосфорных ЯМР-спектров коллатных солюбилизированных образцов Bla g 1 и эталонных стандартов фосфолипида и сравнивайте спектры ЯМР Bla g 1 31 фосфора с спектрами, полученными для эталонных образцов фосфолипида, чтобы подтвердить удаление эндогенно связанных лигандов и / или связывание желаемых лигандов на основе химических сдвигов видимых пиков, а затем сравнить пиковую интенсивность спектра Bla g 1 с эталонными стандартами фосфолипида, чтобы обеспечить подтверждение полной стехиометрии связывания. Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST Bla g 1 может быть легко выделен до высокого уровня чистоты, производя выход от двух до четырех миллиграммов на литр клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при четырех градусах Цельсия достаточно, чтобы удалить метку GST, давая конечный продукт примерно в 24 килодалтонах.Применение Bla g 1 к колонне C18 обратной фазы дает отличительный профиль элюирования, с двумя большими пиками при 50% буфере B, и вторым большим пиком при 75% буфере B.Фосфор-31 ЯМР спектры Apo-Bla g 1 не показывают обнаруживаемых фосфолипидов. Стандартная кривая может быть получена из ЯМР с использованием эталонных образцов известных концентраций DSPC. Сравнение интенсивности сигнала фосфора 31, полученного из DSPC Bla g 1, с этой стандартной кривой может быть использовано для получения стехиометрии связывания липидов на белок.Круговые спектры дихроизма для Апо- и липидно-нагруженного Bla g 1 показывают минимумы 220 и 210 нанометров, что указывает на преимущественно альфа-спиральную структуру. Циркулярные анализы тепловой денатурации на основе дихроизма также показывают кооперационную потерю альфа-спиральной вторичной структуры, что указывает на складчатый глобулярный домен. Кроме того, анализ результирующих температур плавления показывает значительное увеличение при связывании лиганда nMix, что согласуется с Bla g 1, полученным из его естественного источника аллергена.Успех этого протокола зависит от способности преодолевать как ограниченную растворимость гидрофобных лигандов, так и недоступный характер полость связывания Bla g 1. Эта процедура закладывает основу для иммунологических исследований, таких как анализы пролиферации Т-клеток, для оценки влияния липидных лигандов на сенсибилизацию и молекулярные механизмы, с помощью которых это происходит. Связав эту процедуру с дальнейшими биофизическими анализами, мы показали, что связывание гидрофобных лигандов повышает стабильность Bla g 1 с потенциальными последствиями для генерации эпитопов и аллергенности.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...