Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
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Nos gustaría agradecer al Dr. Tom Kirby, Scott Gabel y al Dr. Robert London por su ayuda y asistencia a lo largo de este trabajo, junto con el Dr. Bob Petrovich y Lori Edwards por el uso de su instrumentación y su asistencia en la generación de las construcciones Bla g 1 empleadas en este estudio. Agradecemos a Andrea Adams por su ayuda con la espectrometría de masas, y al Dr. Eugene DeRose por su ayuda con la instrumentación de RMN. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental.

1. Bla g 1 clonación
<ol><li>Obtener el gen para el alérgeno de cucaracha Bla g 1.0101 (residuos 34-216), que representa una sola repetición del dominio MA. En aras de la simplicidad, Bla g 1 se utilizará a lo largo de la obra para representar esta sola repetición, en lugar de toda la transcripción de Bla g 1.0101.</li>
	<li>Subclone el gene de Bla g 1 en el vector deseado. En este estudio, el gen que contiene una etiqueta de la S-transferasa del glutatión N-terminal (GST) acoplada a un sitio de...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

El protocolo descrito en este trabajo se ha aplicado con éxito para estudiar sistemáticamente las propiedades de unión lipídicas de Bla g 1. Esto reveló una correlación entre la unión a la carga, la termoestabilidad y el procesamiento endosomal, el último de los cuales se correlacionó con la disminución en la generación de un epítopo de células T conocido con posibles implicaciones para la inmunogenicidad9,18. Además de Bla g 1, se ha demostrado que...

Un estudio de la base de datos de alérgenos revela que los alérgenos se encuentran en sólo el 2% de todas las familias de proteínas conocidas, lo que sugiere que las propiedades funcionales y biofísicas comunes contribuyen a la alergenicidad1. De estas propiedades, la capacidad de unir cargas lipídicas parece estar fuertemente sobrerrepresentada entre los alérgenos, lo que sugiere que estas cargas pueden influir en el proceso de sensibilización1. De hecho, se ha demostrado que el alérgeno de la nuez de Brasil Ber e 1 requiere co-administración con su lípido endógeno para realizar todo su potencial sensibilizante2. Estos lípidos podrían potencialmente estimular el sistema inmune directamente como lo ilustran los alérgenos ácaros Der p 2 y Der p 7, los cuales comparten una fuerte homología estructural con las proteínas de unión a LPS3,4,5. Sobre la base de esta observación se propuso que Derp 2 y Der p 7 podrían unirse a los lípidos bacterianos y estimular directamente el sistema inmune del huésped a través de la señalización mediada por TLR4, facilitando el proceso de sensibilización5,6. También es posible que los lípidos endógenos unidos podrían alterar las propiedades biofísicas de las propias proteínas alergénicas. Por ejemplo, la capacidad de Sin a 2 (mostaza) y Ara h 1 (cacahuetes) para interactuar con vesículas fosfolípidas mejoró significativamente su resistencia a la degradación gástrica y endosomal7,mientras que el ligando que se une al alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 alteró tanto la tasa de procesamiento endosomal como la diversidad de los péptidos resultantes8. Esto es particularmente relevante para la alergenicidad dada la correlación que se ha observado entre la estabilidad, la generación de epítopos de células T y la alergenicidad para proteínas como Bet v 1 y Bla g 1; este último de los cuales será objeto de este trabajo9,10.
Bla g 1 representa el miembro prototípico de la familia de proteínas de insectos alérgenos mayores (MA), y posee una estructura única compuesta por 12 hélices alfa anfipáticas que encierran una cavidad hidrofóbica anormalmente grande9,11. La estructura cristalina de rayos X disponible de Bla g 1 muestra densidad de electrones dentro de esta cavidad consistente con ligandos de fosfolípidos o ácidos grasos unidos; una conjetura confirmada por 31P-RMN y espectrometría de masas. Estas cargas eran de naturaleza heterogénea y su composición dependía en gran medida de la fuente alergénica, observó diferentes perfiles lipídicos para bla g 1 recombinante expresado en E. coli y P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de su fuente natural de alérgenos (frass cucaracha) contenía predominantemente ácidos grasos dentro de su sitio de unión, con una mezcla de palmitato, oleato y estearato que se identifica como sus ligandos "naturales"9,11. La capacidad de Bla g 1 para retener lípidos y ácidos grasos después de múltiples pasos de purificación dificulta los esfuerzos para estudiar la proteína de forma aislada. Por el contrario, se ha sugerido que los ligandos naturales palmitato, estearato y oleato de Bla g 1 (en adelante, nMix) juegan un papel clave tanto en su alergenicidad como en su función biológica nativa9. Sin embargo, estos ligandos no están presentes en Bla g 1 obtenidos de fuentes recombinantes, por lo que es difícil evaluar esta hipótesis. Se han observado problemas similares para otros alérgenos de unión a lípidos como Bet v1 12,13. Para facilitar el estudio sistemático de las interacciones lípido-alergénico hemos desarrollado un protocolo a través del cual los alérgenos pueden ser cuantitativamente despojados de sus lípidos endógeno unidos y reconstituidos en forma de Apo o cargados con ligandos específicos.
Los alérgenos se purifican más comúnmente de sus fuentes naturales o recombinantes mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Aquí, introducimos un paso de purificación adicional en forma de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) empleando una columna C18 de fase inversa a partir de la cual el alérgeno se ela en un disolvente orgánico similar a los protocolos desarrollados para proteínas de unión a ácidos grasos14. La proteína resultante se somete entonces a un paso de recocido térmico en ausencia o presencia de ácidos grasos y/o fosfolípidos. Además de recuperar el pliegue nativo de Bla g 1, las temperaturas elevadas aumentan la solubilidad y accesibilidad de las cargas lipídicas, produciendo Bla g 1 en forma apo o uniformemente cargada con el ligando hidrofóbico deseado. 31 Los espectros de P-RMN de Bla g 1 purificados de esta manera confirmaron el retiro completo de ligands endógeno ligados y el reemplazo uniforme con los compuestos deseados, mientras que el dicroísmo circular confirmó la recuperación acertada del doblez de Bla g 1. La utilidad de este método se destaca en un trabajo reciente en el que se encontró que la unión a la carga mejora la termoestabilidad Bla g 1 y la resistencia proteolítica, alterando la cinética de la generación de epítopos de células T con posibles implicaciones para la sensibilización y la alergenicidad9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Muchos alérgenos importantes se unen a moléculas hidrofóbicas similares a lípidos, incluyendo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 y Fel d 1. Estos ligandos se retienen fuertemente y tienen el potencial de influir en el proceso de sensibilización, ya sea a través de la estimulación directa del sistema inmunológico o la alteración de las propiedades biofísicas de la proteína alergénica. Para controlar estas variables, se requieren técnicas para la eliminación de ligandos endógenos unidos y, si es necesario, la sustitución por lípidos de composición conocida. El alérgeno de cucaracha Bla g 1 encierra una gran cavidad hidrofóbica que se une a una mezcla heterogénea de lípidos endógenos cuando se purifica utilizando técnicas tradicionales. Aquí, describimos un método a través del cual estos lípidos se eliminan utilizando HPLC de fase inversa seguido de recocido térmico para producir Bla g 1 en su forma apo o recargado con una mezcla definida por el usuario de cargas de ácidos grasos o fosfolípidos. El acoplamiento de este protocolo con ensayos bioquímicos revela que las cargas de ácidos grasos alteran significativamente la termoestabilidad y la resistencia proteolítica de Bla g 1, con implicaciones aguas abajo para la tasa de generación de epítopos de células T y alergenicidad. Estos resultados destacan la importancia de los protocolos del retiro/de la recarga del lípido tales como el descrito adjunto al estudiar alergénicos de fuentes recombinantes y naturales. El protocolo es generalizable a otras familias de alérgenos incluyendo lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) y Uteroglobin (Fel d 1), proporcionando una valiosa herramienta para estudiar el papel de los lípidos en la respuesta alérgica.

Mediante cromatografía de afinidad, el GST-Bla g 1 recombinante se aisló fácilmente a un alto nivel de pureza(Figura 1A),produciendo un rendimiento de ~2-4 mg/L de cultivo celular. La incubación durante la noche con proteasa tev a 4 °C es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final a ~ 24 kDa. Tenga en cuenta que en este caso hay una cantidad significativa de GST-Bla g 1 en las fracciones de flujo y lavado, lo que sugiere que se superó la capacidad de unión de la resina...

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Este protocolo describe el retiro de lípidos endógenos de alergénicos, y su reemplazo con ligands usuario-especificados con la CLAR de la invertir-fase juntada con el recocido termal. 31 El P-RMN y el dicroísmo circular permiten la confirmación rápida del retiro/del cargamento del ligand, y la recuperación de la estructura alergénica nativa.

Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Muchos alérgenos se unen a moléculas hidrofóbicas. Este protocolo permite la eliminación y sustitución completa de estos ligandos, permitiéndonos estudiar su impacto sobre la estructura y la inmunogenicidad de forma sistemática. El uso de HPLC de fase inversa, junto con el recocido térmico, tiene dos ventajas.Elimina los ligandos endógenos, y ayuda a solubilizar los ligandos para abrir sitios de unión de otra manera inaccesibles. Si podemos determinar los factores que contribuyen a la alergenicidad, podemos ser capaces de diseñar terapias que eviten estos factores. Muchas proteínas se unen a los ligandos lipídicos, que se retienen fuertemente y pueden influir tanto en la estructura como en la función.Nuestro método permite el estudio sistemático de estas interacciones. La solubilidad y accesibilidad limitadas de muchas cargas lipídicas pueden inhibir el proceso de carga. Asegúrese de tener cuidado al preparar estos ligandos y de considerar la necesidad de adaptaciones específicas del sistema.Como trabajar con ligandos hidrofóbicos e insolubles es un ajuste para algunos alergólogos y bioquímicos, puede ser útil ver cómo se ven las muestras en diferentes etapas. Después de la clonación de la expresión y purificación, aplique 12 mililitros del Bla g 1 escindido a una unidad de filtro centrífuga con un límite de peso molecular de menos de 10 kilodalton para múltiples centrifugaciones en un rotor de cubo oscilante hasta que el volumen total se haya reducido a menos de dos mililitros. Cargue el concentrado resultante en un sistema de HPLC de 250 por 10 milímetros equipado con una columna de cromatografía de fase inversa C18 equilibrada con un tampón A al 97% y un tampón B.Elute Bla g 1 al 1,5 a 4 mililitros por minuto, como se indica en la tabla, utilizando la absorbancia de fluorescencia a 280 nanómetros para monitorear el proceso de elución.A partir de alrededor de 34 a 40 minutos y una concentración de tampón B por encima del 74% recoger no más de cuatro mililitros de cada Bla g 1 fracción. Alícuota la bla g agrupada 1 fracción en tubos de ensayo de vidrio. Cubra los tubos con película de parafina y perfore la película con dos agujeros.Luego, congele las muestras a menos 80 grados Celsius durante una hora y use un liofilizador para secar las muestras de proteínas deslipiliadas resultantes. Para determinar el rendimiento anticipado de Bla g 1, vuelva a suspender una alícuota de prueba deslipemiada liofilizada en cinco mililitros de tampón de re-plegado. Calentar la mezcla en un casto de 500 mililitros que contenga 250 mililitros de agua a 95 grados centígrados en una placa caliente con agitación y vórtice intermitente.Mantenga la solución a 95 grados durante 30 a 60 minutos antes de permitir que el baño de agua se equilibre lentamente a temperatura ambiente. Cuando la solución se haya enfriado, pase la mezcla de lípidos Bla g 1 recocida a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar el material particulado, y use un nuevo filtro centrífugo con un corte de 10 kilodalton para intercambiar la proteína filtrada tres veces en PBS para eliminar cualquier ácido graso libre residual y disolvente orgánico. Luego, evalúe la concentración de proteína utilizando un ensayo de análisis de proteínas estándar para determinar el rendimiento anticipado para las alícuotas restantes de Bla g 1.Para reconstituir el Apo-Bla g 1, vuelva a suspender las alícuotas Bla g 1 en cinco mililitros de tampón de refolding por alícuota, y recocido las muestras como se demuestra. Para cargar el Bla g 1 con fosfolípidos, agregue 10 miligramos de la carga deseada a un tubo de ensayo de vidrio y disuelva en cloroformo, y evapore el cloroformo para producir una película lipídica. Luego, agregue PBS al tubo para producir una concentración final de fosfolípidos de 20 milimolares.Caliente el fosfolípido por encima de la temperatura de transición de fase de la carga lipídica para rehidratar la película lipídica, y el vórtice hasta que la solución se vuelva turbia. Luego, agregue la carga de lípidos fosfo para producir un exceso molar de ligandos de 20X en relación con Bla g 1 basado en el rendimiento anticipado. Se puede formar un precipitante.Vórtice para mezclar antes de recocer la proteína como se demuestra. Para confirmar la eliminación de la carga o la carga por RMN de fósforo-31, utilice un filtro centrífugo para concentrar la muestra en más de 100 micromolares, como se ha demostrado. Prepare muestras de fosfolípidos de referencia de concentraciones conocidas en tampón de PBS como se indica, y diluya la referencia final de Bla g 1 a una relación 1:1 con tampón de colalato a un volumen total de aproximadamente 600 microlitros.Utilice una sonda de banda ancha para adquirir espectros de RMN unidimensionales de 31 fósforos de las muestras de Bla g 1 solubilizadas y los estándares de fosfolípidos de referencia, y compare los espectros de RMN fosforados Bla g 1 31 con los obtenidos para las muestras de referencia de fosfolípidos para confirmar la eliminación de ligandos endógenos unidos y/o la unión de los ligandos deseados en función de los cambios químicos de los picos visibles, luego compare la intensidad máxima del espectro Bla g 1 con la de los estándares de referencia de fosfolípidos para permitir la confirmación de la estequiometría de unión completa. Usando la cromatografía de afinidad, GST recombinante Bla g 1 se puede aislar fácilmente a un alto nivel de pureza, produciendo un rendimiento de dos a cuatro miligramos por litro de cultivo celular. La incubación durante la noche con la proteasa tev a cuatro grados centígrados es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final en aproximadamente 24 kilodaltons.La aplicación del Bla g 1 a una columna C18 de fase inversa produce un perfil de elución distintivo, con dos picos grandes en el 50% buffer B, y un segundo pico grande en el 75% buffer B.Phosphorus-31 espectros de RMN de Apo-Bla g 1 no muestran fosfolípidos detectables. Se puede producir una curva estándar a partir de la RMN utilizando muestras de referencia de concentraciones conocidas de DSPC. La comparación de la intensidad de la señal de fósforo 31 obtenida de DSPC Bla g 1 contra esta curva estándar se puede utilizar para producir la estequiometría de unión de los lípidos por proteína.Espectros circulares del dicroísmo para Apo-y lípido-cargado Bla g 1 muestran mínimos de 220 y 210 nanómetros, indicativos de una estructura predominante alfa-helicoidal. Los ensayos de desnaturalización térmica basados en dicroísmo circular también muestran una pérdida cooperativa de estructura secundaria alfa-helicoidal, indicativa de un dominio globular plegado. Además, el análisis de las temperaturas de fusión resultantes revela un aumento significativo en la unión del ligando nMix, consistente con Bla g 1 obtenido de su fuente natural de alérgenos.El éxito de este protocolo se basa en la capacidad de superar tanto la solubilidad limitada de los ligandos hidrofóbicos, como la naturaleza inaccesible de la cavidad de unión Bla g 1. Este procedimiento sienta las bases para que los estudios inmunológicos, tales como análisis de la proliferación del T-cell, evalúen el efecto de los ligands del lípido sobre la sensibilización y los mecanismos moleculares a través de los cuales esto ocurre. Acoplando este procedimiento con ensayos biofísicos adicionales, hemos demostrado que la unión de ligandos hidrofóbicos mejora la estabilidad bla g 1, con posibles implicaciones aguas abajo para la generación de epítopos y la alergenicidad.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Investigación

Bioquímica

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...