Name: removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Dr. Tom Kirby, Scott Gabel ve Dr. Robert London'a bu çalışma boyunca yardımları ve yardımları için, Dr. Bob Petrovich ve Lori Edwards'a enstrümantasyonlarını kullandıkları ve bu çalışmada kullanılan Bla g 1 yapılarının oluşturulmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Kitle spektrometresi konusunda yardım için Andrea Adams'a ve NMR enstrümantasyonuna yardım için Dr. Eugene DeRose'a teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Z01-ES102906 (GAM) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. Bla g 1 klonlama
<ol><li>Ma alanının tek bir tekrarını temsil eden hamamböceği alerjeni Bla g 1.0101 (kalıntılar 34-216) için gen elde edin. Basitlik adına, Bla g 1, tüm Bla g 1.0101 transkript yerine, bu tek tekrarı temsil etmek için çalışma boyunca kullanılacaktır.</li>
	<li>Bla g 1 genini istenen vektöre dahil edin. Bu çalışmada, bir tütün etch virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesine bağlı bir N-terminal glutatyon S-transferaz (GST) etiketi içeren gen, daha önce a?...

<ol>
	<li>Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergens+are+distributed+into+few+protein+families+and+possess+a+restricted+number+of+biochemical+functions.">Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).</li><li>Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+plant+lipids+on+immune+responses+in+mice+to+the+major+Brazil+nut+allergen+Ber+e+1.">Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1.</a> Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).</li><li>Ichikawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+binding+of+the+mite+allergen+Der+f+2.">Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2.</a> Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+dust+mite+allergen+Der+p+7+reveals+similarities+to+innate+immune+proteins.">The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).</li><li>Reginald, K., Chew, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+allergen+Der+p+2+is+a+cholesterol+binding+protein.">The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).</li><li>Trompette, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergenicity+resulting+from+functional+mimicry+of+a+Toll-like+receptor+complex+protein.">Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein.</a> Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).</li><li>Angelina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+interaction+capacity+of+Sin+a+2+and+Ara+h+1,+major+mustard+and+peanut+allergens+of+the+cupin+superfamily,+endorses+allergenicity.">The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).</li><li>Soh, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+Bet+v+1+ligands+in+allergen+stabilization+and+modulation+of+endosomal+protease+activity.">Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).</li><li>Foo, A. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+ligands+influence+the+structure,+stability,+and+processing+of+the+major+cockroach+allergen+Bla+g+1.">Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).</li><li>Machado, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fold+Stability+is+a+key+factor+for+immunogenicity+and+allergenicity+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v1.0101.">Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).</li><li>Mueller, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+structure+of+the+cockroach+allergen+Bla+g+1+has+implications+for+allergenicity+and+exposure+assessment.">The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).</li><li>Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+birch+allergen+,+Bet+v+1+,+shows+affinity+for+a+broad+spectrum+of+physiological+ligands.">The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).</li><li>Seutter von Loetzen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secret+of+the+major+birch+pollen+allergen+Bet+v+1:+identification+of+the+physiological+ligand.">Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand.</a> Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).</li><li>Ib&#225;&#241;ez-Shimabukuro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ligand+binding+of+As-p18,+an+extracellular+fatty+acid+binding+protein+from+the+eggs+of+a+parasitic+nematode.">Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode.</a> Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).</li><li>Beyer, K., Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADP/ATP+carrier+protein+from+beef+heart+mitochondria+has+high+amounts+of+tightly+bound+cardiolipin,+as+revealed+by+31P+nuclear+magnetic+resonance.">ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance.</a> Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nmrpipe+-+a+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+unix+pipes.">Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes.</a> Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).</li><li>Johnson, B. A., Blevins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+View:+A+computer+program+for+the+visualization+and+analysis+of+NMR+data.">NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data.</a> Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).</li><li>Dillon, M. B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Bla-g+T+cell+antigens+dominate+responses+in+asthma+versus+rhinitis+subjects.">Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects.</a> Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).</li><li>Pasquato, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+peach+Pru+p+3,+the+prototypic+member+of+the+family+of+plant+non-specific+lipid+transfer+protein+pan-allergens.">Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).</li><li>Dubiela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+binding+on+the+tertiary+structure+and+allergenic+potential+of+Jug+r+3,+the+non-specific+lipid+transfer+protein+from+walnut.">Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut.</a> Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).</li><li>Abdullah, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+an+allergenic+lipid+transfer+protein+enhances+conformational+flexibility+resulting+in+an+increase+in+susceptibility+to+gastroduodenal+proteolysis.">Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis.</a> Scientific Reports. 6, 30279 (2016).</li><li>Derewenda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+a+major+dust+mite+allergen+Der+p+2+,+and+its+biological+implications.">The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications.</a> Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).</li><li>Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+detergent+micelles+determined+by+small-angle+X-ray+scattering.">Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).</li><li>Pulsawat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+house+dust+mite+allergen+Der+p+5+binds+lipid+ligands+and+stimulates+airway+epithelial+cells+through+a+TLR2-dependent+pathway.">The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway.</a> Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).</li><li>Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+tyrosine+fluorescence+to+study+the+lipid-binding+properties+of+a+wheat+non-specific+lipid-transfer+protein+(nsLTP1).">Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).</li><li>Ogburn, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+dust+mite+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+Dermatophagoides+pteronyssinus+proteins.">Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).</li><li>Cabrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+allergens+more+abundant+and/or+more+stable+than+other+proteins+in+pollens+and+dust.">Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust.</a> Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).</li><li>Offermann, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+the+hazelnut+allergen+Cor+a+8.">Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).</li><li>Koppelman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+denaturation+of+Brazil+nut+2S+albumin+(Ber+e1)+and+implication+of+structural+destabilization+on+digestion+by+pepsin.">Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).</li><li>Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mal+d+2,+the+thaumatin-like+allergen+from+apple,+is+highly+resistant+to+gastrointestinal+digestion+and+thermal+processing.">Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).</li><li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1,+actinidin,+and+Act+d+2,+a+thaumatin-like+protein.">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li><li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1,+the+major+allergen+of+whiff.">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li><li>de Jongh, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+treatment+on+the+conformational+stability+of+intact+and+cleaved+forms+of+the+peanut+allergen+Ara+h+6+in+relation+to+its+IgE-binding+potency.">Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency.</a> Food Chemistry. 326, 127027 (2020).</li><li>Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+complexes+in+lipocalins:+Underestimation+of+the+stoichiometry+parameter+(n).">Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n).</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).</li><li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction.">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li><li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process.">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li></ol>

Bu çalışmada açıklanan protokol, Bla g 1'in lipit bağlama özelliklerini sistematik olarak incelemek için başarıyla uygulanmıştır. Bu, kargo bağlama, termostabiliyet ve endosomal işleme arasında bir korelasyon ortaya koydu, ikincisi bilinen bir T hücre epitopunun neslindeki azalma ile immünojeniklik için potansiyel etkileri ile ilişkiliydi9,18. Bla g 1'e ek olarak, Pru p 3 ve Bet v 1 gibi diğer alerjenlerin, standart benzeşim ve boyut dışla...

Alerjen veritabanında yapılan bir anket, alerjenlerin bilinen tüm protein ailelerinin sadece% 2'sinde bulunduğunu ortaya koymaktadır, bu da ortak fonksiyonel ve biyofiziksel özelliklerin alerjenikliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir1. Bu özelliklerden, lipid yüklerini bağlama yeteneği alerjenler arasında güçlü bir şekilde aşırı temsil edilmiş gibi görünmektedir, bu da bu kargoların duyarlılık sürecini etkileyebileceğini düşündürmektedir1. Gerçekten de, Brezilya Somun alerjeni Ber e 1'in tam duyarlılık potansiyelini gerçekleştirmek için endojen lipid ile birlikte yönetim gerektirdiği gösterilmiştir2. Bu lipitler, her ikisi de LPS bağlayıcı proteinler 3 ,4,5ile güçlü bir yapısal homolojiyi paylaşan akar alerjenleri Der p 2 ve Der p7tarafından gösterildiği gibi bağışıklık sistemini doğrudan uyarabilir. Bu gözleme dayanarak, Derp 2 ve Der p 7'nin bakteriyel lipitleri bağlayabileceği ve TLR4 aracılı sinyal yoluyla konak bağışıklık sistemini doğrudan uyarabileceği ve duyarlılık sürecini kolaylaştırabileceği önerildi5,6. Endojen olarak bağlanmış lipitlerin alerjenik proteinlerin biyofiziksel özelliklerini kendileri değiştirebileceği de mümkündür. Örneğin, Sin a 2 (hardal) ve Ara h 1'in (yer fıstığı) fosfolipid veziküllerle etkileşime girme yeteneği mide ve endosomal bozulmaya karşı dirençlerini önemli ölçüde artırdı7, ana huş poleni alerjen Bet v 1'e ligand bağlanması hem endosomal işlem oranını hem de ortaya çıkan peptitlerin çeşitliliğini değiştirdi8. Bu özellikle Bet v 1 ve Bla g 1 gibi proteinler için stabilite, T hücre epitop üretimi ve alerjeniklik arasında gözlenen korelasyon göz önüne alındığında alerjeniklikle ilgilidir; ikincisi bu çalışmanın konusu olacak9,10.
Bla g 1, böcek Major Allergen (MA) protein ailesinin prototipik üyesini temsil eder ve anormal derecede büyük bir hidrofobik boşluğu9,11 içine alan12amfipatik alfa helikesten oluşan benzersiz bir yapıya sahiptir. Bla g 1'in mevcut X-ışını kristal yapısı, bağlı fosfolipid veya yağ asidi ligandları ile tutarlı olarak bu boşluk içindeki elektron yoğunluğunu gösterir; 31P-NMR ve kütle spektrometresi tarafından doğrulanmış bir varsayım. Bu kargolar doğada heterojendi ve bileşimleri alerjen kaynağına büyük ölçüde bağlıydı, E. coli ve P. pastoris'teifade edilen rekombinant Bla g 1 için farklı lipid profilleri gözlendi. İlginç bir şekilde, Bla g 1 doğal alerjen kaynağından (hamamböceği frass) arındırıldı, bağlama alanında ağırlıklı olarak yağ asitleri içeriyordu, palmitat, oleat ve stearat karışımı "doğal" ligands9,11olarak tanımlanıyor. Bla g 1'in birden fazla saflaştırma adımını takiben lipitleri ve yağ asitlerini tutma yeteneği, proteini izole bir şekilde inceleme çabalarını engeller. Tersine, Bla g 1'in doğal palmitat, stearat ve oleat ligandlarının (bundan böyle nMix olarak adlandırılır) hem alerjenikliği hem de yerel biyolojik işlevinde önemli bir rol oynadığı öne sürülmektedir9. Bununla birlikte, bu ligandlar rekombinant kaynaklardan elde edilen Bla g 1'de bulunmaz ve bu hipotezi değerlendirmeyi zorlaştırır. Bet v 112,13gibi diğer lipid bağlayıcı alerjenler için de benzer sorunlar gözlenmiştir. Lipid-alerjen etkileşimlerinin sistematik çalışmasını kolaylaştırmak için, alerjenlerin endojen olarak bağlanmış lipitlerinden nicel olarak sıyrılabilecekleri ve Apo formunda veya belirli ligandlarla yüklenebilecekleri bir protokol geliştirdik.
Alerjenler en sık benzeşim kromatografisi ve/veya boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğal veya rekombinant kaynaklarından arındırılır. Burada, alerjenin yağ asidi bağlayıcı proteinler için geliştirilen protokollere benzer organik bir çözücüye dönüştürdürüldü ters fazlı bir C18 sütunu kullanan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şeklinde ek bir saflaştırma adımı sunuyoruz14. Elde edilen protein daha sonra yağ asitlerinin ve / veya fosfolipidlerin yokluğunda veya varlığında termal bir tavlama adımına tabi tutulur. Yerel Bla g 1 katını kurtarmanın yanı sıra, yüksek sıcaklıklar lipid yüklerinin çözünürlüğü ve erişilebilirliğini arttırır, Apo formunda veya istenen hidrofobik ligand ile düzgün bir şekilde yüklenen Bla g 1'i verir. 31 Bla g 1'in P-NMR spektrumu bu şekilde saflaştırılarak endojen olarak bağlanmış ligandların tamamen çıkarılması ve istenen bileşiklerle tek tip değiştirilmesi doğrulanırken, dairesel dikroizm Bla g 1 kıvrımının başarılı bir şekilde geri kazanılmasını doğruladı. Bu yöntemin faydası, kargo bağlamanın Bla g 1 termostabilitesini ve proteolitik direncini artırdığı, T hücre epitopu neslinin kinetiğini duyarlılık ve alerjeniklik için potansiyel etkileri olan değiştirdiği yeni bir çalışmada vurgulanmıştır9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bla g 1 Gene&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td>
			<td>Indoor biotechnologies</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 Series HPLC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1315B, G1311A, G1322A</td>
			<td>UV Detector, Pump, and Degasser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DD2 600 MHz spectrometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad- band 5 mm Z-gradient probe</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation for LC (Software)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli BL21 DE3 Cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2530H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Resin</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>L00206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione, Reduced</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP25211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jasco&#160; CD spectropolarimeter</td>
			<td>Jasco</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe (Software)</td>
			<td>Delaglio et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277&#8211;293 (1995).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRViewJ (Software)</td>
			<td>Johnson et al.&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Johnson, B. A. &#38; Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603&#8211;614 (1994).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BCA1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SKU: A2000250X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-200 Vacuum Pump</td>
			<td>Varian</td>
			<td>VP-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Palmitate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Stearate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VnmrJ (Software)</td>
			<td>Varian</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal and replacement of endogenous ligands from lipid-bound proteins and allergens

Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ve Fel d 1 dahil olmak üzere birçok büyük alerjen hidrofobik lipid benzeri moleküllere bağlanır. Bu ligandlar güçlü bir şekilde korunur ve bağışıklık sistemini doğrudan uyararak veya alerjenik proteinin biyofiziksel özelliklerini değiştirerek duyarlılık sürecini etkileme potansiyeline sahiptir. Bu değişkenleri kontrol etmek için, endojen olarak bağlı ligandların çıkarılması ve gerekirse bilinen bileşimin lipitleri ile değiştirilmesi için teknikler gereklidir. Hamamböceği alerjeni Bla g 1, geleneksel teknikler kullanılarak saflaştırıldığında endojen lipitlerin heterojen bir karışımını bağlayan büyük bir hidrofobik boşluğu çevreler. Burada, bu lipitlerin ters fazlı HPLC kullanılarak çıkarıldığı ve ardından Apo formunda Bla g 1'i elde etmek için termal tavlamanın veya kullanıcı tanımlı bir yağ asidi veya fosfolipid kargo karışımı ile yeniden yüklendiğini açıklıyoruz. Bu protokolü biyokimyasal testlerle birebir hale getiren yağ asidi yüklerinin Bla g 1'in termostabilitesini ve proteolitik direncini önemli ölçüde değiştirdiğini, T hücre epitopu üretimi ve alerjeniklik oranı için aşağı yönlü etkileri olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar, hem rekombinant hem de doğal kaynaklardan alerjenleri incelerken burada açıklanan gibi lipit çıkarma/yeniden yükleme protokollerinin önemini vurgulamaktadır. Protokol, lipitlerin alerjik yanıttaki rolünü incelemek için değerli bir araç sağlayan lipokalinler (Muş m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) ve Uteroglobin (Fel d 1) dahil olmak üzere diğer alerjen aileler için genelleştirilebilir.

Benzeşim kromatografisi kullanılarak, rekombinant GST-Bla g 1, hücre kültüründe~2-4mg/L verim üreten yüksek saflık seviyesine ( Şekil 1A) kolayca izole edildi. 4 °C'de TEV proteaz ile gecelik inkübasyon, GST etiketini çıkarmak için yeterlidir ve nihai ürünü ~24 kDa'da verir. Bu durumda, akış ve yıkama fraksiyonlarında önemli miktarda GST-Bla g 1 olduğunu ve glutatyon reçine bağlama kapasitesinin aşıldığını unutmayın. Daha fazla reçine veya birden fazla numune yükleme ve...

Watch this Scientific Journal Video about Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens at JoVE.com

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Bu protokol, endojen lipitlerin alerjenlerden uzaklaştırılmasını ve termal tavlama ile birleştiğinde ters faz HPLC ile kullanıcı tarafından belirtilen ligandlarla değiştirilmesini açıklar. 31 P-NMR ve dairesel dikroizm, ligand çıkarma/yüklemenin hızlı bir şekilde onaylanmasına ve doğal alerjen yapısının geri kazanılmasına izin verir.

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Birçok alerjen hidrofobik molekülleri bağlar. Bu protokol, bu ligandların tamamen kaldırılmasını ve değiştirilmesini sağlayarak, yapı ve immünojeniklik üzerindeki etkilerini sistematik bir şekilde incelememizi sağlar. Termal tavlama ile birlikte ters fazlı HPLC kullanımının iki avantajı vardır.Endojen ligandları temizler ve ligandların erişilemeyen bağlama alanlarını açması için çözünür hale yardımcı olur. Alerjenikliğe katkıda bulunan faktörleri belirleyebilirsek, bu faktörlerden kaçınan tedaviler tasarlayabiliriz. Birçok protein, güçlü bir şekilde tutulan ve hem yapıyı hem de işlevi etkileyebilecek lipid ligandlarını bağlar.Yöntemimiz bu etkileşimlerin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Birçok lipid kargosunun sınırlı çözünürlüğü ve erişilebilirliği yükleme işlemini engelleyebilir. Bu ligandları hazırlarken dikkatli olun ve sisteme özgü adaptasyonlara olan ihtiyacı göz önünde bulundurun.Hidrofobik ve çözünmeyen ligandlarla çalışmak bazı alerji uzmanları ve biyokimyacılar için bir ayarlama olduğundan, örneklerin farklı aşamalarda nasıl göründüğünü görmek yararlı olabilir. İfade ve saflaştırma klonlamadan sonra, toplam hacim iki mililitrenin altına düşürülene kadar bir salıncak kovası rotorunda birden fazla santrifüj için 10 kilodalton moleküler ağırlık kesmeden oluşan bir santrifüj filtre ünitesine 12 mililitre bölünmüş Bla g 1 uygulayın. Elde edilen konsantreyi% 97 tampon A ve% 3 tampon B.Elute Bla g 1 ile dengelenmiş bir C18 ters faz kromatografi sütunu ile donatılmış 250 ila 10 milimetre HPLC sistemine dakikada 1,5 ila 4 mililitre akış hızında yükleyin, tabloda belirtildiği gibi, elüasyon işlemini izlemek için 280 nanometrede floresan emiciyi kullanarak.Yaklaşık 34 ila 40 dakikadan başlayarak ve% 74'ün üzerindeki bir tampon B konsantrasyonu, her Bla g 1 fraksiyonunun dört mililitresinden fazlasını toplamaz. Aliquot havuza Bla g 1 fraksiyonu cam test tüplerine. Tüpleri parafin filmi ile örtün ve filmi iki delik ile delin.Daha sonra, numuneleri eksi 80 santigrat derecede bir saat dondurun ve elde edilen lipidlenmiş protein örneklerini kurutmak için bir liyofilzer kullanın. Beklenen Bla g 1 verimini belirlemek için, beş mililitrelik yeniden katlama tamponunda liyofilize edilmiş bir de-lipidated test aliquot'u yeniden askıya alın. Karışımı 250 mililitre su içeren 500 mililitrelik bir beherde, karıştırma ve aralıklı girdap ile sıcak bir tabakta 95 santigrat dereceye ısıtın.Su banyosunun oda sıcaklığına yavaşça dengede tutulmasına izin vermeden önce çözeltiyi 95 derecede 30 ila 60 dakika tutun. Çözelti soğuduğunda, tavlanmış Bla g 1 lipid karışımını partikül maddeyi çıkarmak için 0,22 mikron şırınga filtresinden geçirin ve filtrelenmiş proteini üç kez PBS'ye tamponla değiştirmek için 10 kilodalton kesmeli yeni bir santrifüj filtre kullanın. Daha sonra, kalan Bla g 1 aliquots için beklenen verimi belirlemek için standart bir protein analizi tahlili kullanarak protein konsantrasyonu değerlendirin.Apo-Bla g 1'i yeniden oluşturmak için, Bla g 1 aliquots'u beş mililitrelik yeniden katlama tamponunda yeniden askıya alın ve örnekleri gösterildiği gibi tavla. Bla g 1'i fosfolipidlerle yüklemek için, bir cam test tüpüne 10 miligram istediğiniz kargoyu ekleyin ve kloroformda çözün ve bir lipid filmi üretmek için kloroformu buharlaştırın. Daha sonra, 20 milimolar son fosfolipid konsantrasyonu üretmek için tüpe PBS ekleyin.Lipid filmini yeniden sulandırmak için fosfolipid'i lipid yükünün faz geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtın ve çözelti bulanıklanıncaya kadar girdap. Ardından, beklenen verime göre Bla g 1'e göre 20x molar fazla ligand üretmek için fosfon lipid kargosunu ekleyin. Bir çökelme oluşabilir.Gösterildiği gibi proteini tavlamadan önce karıştırmak için girdap. Fosfor-31 NMR ile kargonun çıkarılmasını veya yüklenmesini onaylamak için, numuneyi gösterildiği gibi 100 mikromolundan daha büyük bir mikromolar'a konsantre etmek için bir santrifüj filtresi kullanın. Belirtildiği gibi PBS tamponunda bilinen konsantrasyonların referans fosfolipid örneklerini hazırlayın ve Bla g 1 uç referansını kolit tamponu ile 1:1 oranına yaklaşık 600 mikrolitrelik toplam hacme seyreltin.Harmanlanmış Bla g 1 örneklerinin tek boyutlu, 31 fosforlu NMR spektrumunu elde etmek için geniş bant probu kullanın ve fosfolipid standartlarına başvurun, ve Bla g 1 31 fosforlu NMR spektrumtrasını fosfolipid referans örnekleri için elde edilenlerle karşılaştırarak endojen olarak bağlı ligandların çıkarılmasını ve/veya görünür zirvelerin kimyasal kaymalarına dayanarak istenen ligandların bağlanmasını onaylamak, daha sonra Bla g 1 spektrumunun tepe yoğunluğunu fosfolipid referans standartlarınınkiyle karşılaştırarak tam bağlayıcı stoichiometry'nin onaylanmasına izin verin. Benzeşim kromatografisi kullanılarak, rekombinant GST Bla g 1, hücre kültürünün litresi başına iki ila dört miligram verim üreten yüksek saflık seviyesine kolayca izole edilebilir. Tev proteaz ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübasyon, GST etiketini çıkarmak için yeterlidir ve nihai ürünü yaklaşık 24 kilodaltonda verir.Bla g 1'i ters fazlı bir C18 sütununa uygulamak, %50 tampon B'de iki büyük tepe ve Apo-Bla g 1'in %75 tampon B.Fosfor-31 NMR spektrumu ile tespit edilebilir fosfolipidler göstermeyen belirgin bir elüasyon profili sağlar. Bilinen DSPC konsantrasyonlarının referans örnekleri kullanılarak NMR'den standart bir eğri üretilebilir. DSPC Bla g 1'den elde edilen fosfor 31 sinyal yoğunluğunun bu standart eğri ile karşılaştırılması, protein başına lipitlerin bağlayıcı stoichiometry'liğini sağlamak için kullanılabilir.Apo ve lipid yüklü Bla g 1 için dairesel dikroizm spektrumu, ağırlıklı olarak alfa-sarmal bir yapının göstergesi olan 220 ve 210 nanometrelik minima gösterir. Dairesel dikroizme bazlı termal denatürasyon tahlilleri de katlanmış bir küresel etki alanının göstergesi olan alfa-sarmal ikincil yapının kooperatif kaybını göstermektedir. Ek olarak, ortaya çıkan erime sıcaklıklarının analizi, doğal alerjen kaynağından elde edilen Bla g 1 ile tutarlı olarak nMix ligand bağlamasında önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır.Bu protokolün başarısı, hem hidrofobik ligandların sınırlı çözünürlüğünü hem de Bla g 1 bağlama boşluğunun erişilemez doğasının üstesinden gelme yeteneğine dayanmaktadır. Bu prosedür, lipid ligandlarının duyarlılık üzerindeki etkisini ve bunun meydana geldiği moleküler mekanizmaları değerlendirmek için T hücre çoğalması tahlilleri gibi immünolojik çalışmalara zemin hazırlar. Bu prosedürü daha fazla biyofiziksel testle birleştiriyor, hidrofobik ligandların bağlanmasının Bla g 1 stabilitesini artırdığını ve epitop üretimi ve alerjeniklik için potansiyel aşağı akış etkileri olduğunu gösterdik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...