Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

نحن نعترف بمنصات التصوير ومنصات علم الأنسجة Anipath (CRCL، CLB). نحن مدينون لصيدلية مستشفى سنتر ليون بيرارد (CLB) لهدية من نوع FOLFOX وFOLFIRI. كما نشكر بريجيت مانشيب على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل من قبل FRM (Equipes FRM 2018 و DEQ20181039598) والإنكا (PLBIO19-289). وتلقت مجموعة MVG وLC الدعم من FRM وCF تلقى الدعم من مؤسسة ARC ومركز ليون بيرارد.

ملاحظة: يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمواد في جدول المواد.
1. تشكيل كروي
<ol><li>وسائط ثقافة كروية<ol>
<li>إعداد المتوسط القاعدية التي تتكون من دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) تكملها مع 4 MM L-ألانيل-L-الجلوتامين ديببتيد.</li>
		<li>إعداد DMEM المتوسطة كاملة تحتوي على 10٪ مصل البقر...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

في المختبر نماذج 3D التغلب على العيوب التجريبية الرئيسية من ثقافات الخلايا السرطانية 2D، كما يبدو أنها أكثر موثوقية في تلخيص الميزات السرطانية النموذجية بما في ذلك البيئة الدقيقة وتغايرية الخلايا. النماذج ثلاثية الأبعاد الشائعة الاستخدام للكرويدات خالية من السقالات (مثقفة في ظروف منخفضة ...

سرطان القولون والمستقيم (CRC) لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في العالم1. تطوير لجنة حقوق الطفل هو نتيجة لاكتساب تدريجي وتراكم الطفرات الوراثية و / أو التعديلات اللاجينية2،3، بما في ذلك تفعيل الأورام وتثبيط الجينات المثبطة للورم3،4. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم العوامل غير الوراثية (مثل البيئة الدقيقة) في التحول الجيني ومن ثم المشاركة في تطور مراكز مكافحة الأمراض العصبية5. الأهم من ذلك، تتكون CRCs من مجموعات خلايا مختلفة، بما في ذلك CSCs غير المتمايزة والخلايا السرطانية السائبة التي تظهر بعض الصفات التفاضلية، والتي تشكل بنية هرمية تذكرنا بتنظيم الظهارة في سرداب القولون العادي6،7.
تعتبر CSCs مسؤولة عن ظهور الورم8، والحفاظ عليه ونموه ، وقدرته النقيلية ، ومقاومة العلاجات التقليدية6،7. داخل الأورام، والخلايا السرطانية، بما في ذلك CSCs، عرض مستوى عال من التغايرية والتعقيد من حيث ملامحها الطفرة واللاجينية متميزة، والاختلافات المورفولوجية والظاهرية، والتعبير الجيني، والتمثيل الغذائي، ومعدلات الانتشار، والإمكانات النقيلي9. لذلك ، لفهم أفضل بيولوجيا السرطان ، وتطور الورم ، واكتساب المقاومة للعلاج وترجمته إلى علاجات فعالة ، فإن النماذج قبل السريرية البشرية التي تلتقط عدم التجانس والتسلسل الهرمي للسرطان مهمة10،11.
في المختبر 2D خطوط الخلايا السرطانية قد استخدمت لفترة طويلة وتوفير رؤى قيمة في تطور الورم والآليات الكامنة وراء فعالية الجزيئات العلاجية. ومع ذلك ، فإن تقييدها فيما يتعلق بعدم وجود التغايرية الظاهرية والجينية الموجودة في الأورام الأصلية معترف بها الآن على نطاق واسع12. وعلاوة على ذلك، لا يتم استنساخ المواد الغذائية والأوكسجين، وتدرجات الحموضة، والفيروسات الدقيقة الورم، والبيئة الدقيقة كونها مهمة بشكل خاص للحفاظ على أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك CSCs11،12. للتغلب على هذه العيوب الرئيسية، تم تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد لمعالجة وإعادة إنتاج تعقيد وتغاير السرطانات تجريبيا. في الواقع، هذه النماذج تلخيص الورم التغايرية الخلوية، والتفاعلات الخلية الخلية، والهندسة المعمارية المكانية، مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي12،13،14. الأجهزة السرطانية الأولية التي أنشئت من الأورام الطازجة، فضلا عن كرويدات خط الخلية المشتقة، وتستخدم إلى حد كبير15،16.
يمكن استزراع الكرويات بطريقة خالية من السقالات أو السقالات لإجبار الخلايا على التشكل والنمو في مجاميع الخلايا. تستند الطرق الخالية من السقالات على ثقافة الخلايا في ظل ظروف غير ملتزمة (على سبيل المثال ، طريقة الشنق أو لوحات المرفق المنخفضة للغاية) ، في حين تعتمد النماذج القائمة على السقالات على المواد الحيوية الطبيعية أو الاصطناعية أو الهجينة لخلايا الثقافة12و13و14. السقالة القائمة على كرويدات تقديم مساوئ مختلفة كما تشكيل كروية النهائي سوف تعتمد على طبيعة وتكوين المواد (الحيوية) المستخدمة. على الرغم من أن طرق كروية خالية من السقالة المتاحة حتى الآن لا تعتمد على طبيعة الركيزة ، فإنها تولد كرويدات تختلف في الهيكل والحجم17،18.
كان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ من الكرويات ، وهي متجانسة في الحجم ، تتكون من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية لدراسة بيولوجيا CSC. خلايا Caco2 ذات أهمية خاصة نظرا لقدرتها على التفريق مع مرور الوقت19،20، مما يشير بقوة إلى إمكانات تشبه الجذعية. وبناء على ذلك، كشفت الثقافة طويلة الأجل للشفرات وجود مجموعات مختلفة من CSC مع استجابات مختلفة للعلاج الكيميائي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

تتميز سرطانات القولون والمستقيم بعدم التجانس ومنظمة هرمية تضم مجموعة من الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) المسؤولة عن تطور الورم وصيانته ومقاومته للأدوية. وبالتالي، فإن الفهم الأفضل لخصائص CSC لاستهدافها المحدد هو شرط مسبق للعلاج الفعال. ومع ذلك، هناك ندرة في النماذج السابقة السريرية المناسبة لإجراء تحقيقات متعمقة. على الرغم من أن خطوط الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر توفر رؤى قيمة في بيولوجيا الورم ، إلا أنها لا تكرر عدم تجانس الورم الظاهري والوراثي. في المقابل، تعالج النماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وتتكاثر تعقيد السرطان شبه الفسيولوجي وتغايرية الخلايا. وكان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ لدراسة بيولوجيا CSC. تصف المنهجية الحالية تطوير وتحسين الظروف لتوليد كرويدات ثلاثية الأبعاد ، وهي متجانسة في الحجم ، من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية ، وهو نموذج يمكن استخدامه للثقافة على المدى الطويل. والأهم من ذلك، داخل كرويدات، الخلايا التي نظمت حول هياكل تشبه التجويف، وتتميز أنماط انتشار الخلايا التفاضلية ووجود CSCs التعبير عن لوحة من علامات. توفر هذه النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج ثلاثي الأبعاد لدراسة تغايرية الخلايا وبيولوجيا CSC ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

وبما أن عدم وجود تجانس في حجم كرويات هو واحد من العيوب الرئيسية المتاحة حاليا أنظمة ثقافة كروية 3D13، وكان الهدف من هذا العمل لاقامة بروتوكول موثوق بها وقابلة للاستنساخ للحصول على كرويدات متجانسة. أولا، لتهيئة ظروف عمل مثالية، تم اختبار أعداد مختلفة من خلايا ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا وقويا وقابلا للاستنساخ لتوليد وزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الغدي القولون Caco2. تقدم النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

يمكن استخدام هذه الطريقة الجديدة من الثقافات الكروية لدراسة الورم لتحليل وجود مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية ويمكن أيضا تطبيقها بشكل جيد من خلال شاشة عالية لوضع أدوية جديدة. هذا هو نظام قوي ومتكرر مثقف لتوليد عدد كبير من كرويات متجانسة الحجم. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الكرويات لدراسة الخلايا الجذعية السرطانية.تم إعداد هذه الطريقة لدراسة بيولوجيا السرطان المزمن ولكن يمكن إعدادها بسهولة لدراسة أنواع السرطان الأخرى عن طريق تغيير ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. تأكد من مشاهدة الفقاعات في الوسط ، وعدم تحريك اللوحة كثيرا أثناء تكوين الكرويات وتوخي الحذر عند حصاد الكرويات في مصفاة. تبدأ قبل معالجة آبار لوحة بئر 24 مع 500 لتر صغير من المضادة للالتزام حل الشطف لكل بئر.بعد بضع ثوان الطرد المركزي لوحة في الدوار يتأرجح دلو وشطف كل بئر مع 2 ملليلتر من المتوسط القاعدية الدافئة. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن الفقاعات قد أزيلت تماما من الآبار الصغيرة. إذا لم يتم ملاحظة فقاعات، شطف الآبار مرة أخرى قبل إضافة ملليلتر واحد من دافئ DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.للحث على تشكيل كروية، انظر التركيز المطلوب من خلايا كاكو-2 في طبقة أحادية 2D في طبق 10 سم في DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. للثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو رطب. عندما يتم التوصل إلى التقاء 80٪، وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل علاج الثقافة مع اثنين من ملليلتر من تريبسين-EDTA لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.عندما تكون الخلايا قد فصل تحييد تريبسين مع أربعة ملليلتر من DMEM كاملة. بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق لوحة في الحجم المناسب من DMEM الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة متوسطة لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة لكل بئر. إضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل بئر من لوحة بئر 24 المدفوعة مسبقا، تليها إضافة ملليلتر واحد من DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.بعد البذر، على الفور الطرد المركزي لوحة واستخدام المجهر الخفيف للتحقق من أن الخلايا قد وزعت بالتساوي عبر الآبار الصغيرة. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة دون إزعاج الخلايا. لحصاد كرويدات، في نهاية الحضانة، واستخدام ماصة المصلية ونصف من supernatant في كل بئر لطرد بلطف كرويدات من آبارها الصغيرة.عندما تم فصل جميع كرويدات استخدام ماصة لنقل بعناية الثقافات 3D من كل بئر إلى مصفاة 37 ميكرون عكسها على رأس أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. غسل كل بئر ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من المتوسط القاعدي قبل الحرب لكل غسل لجمع أي كرويدات المتبقية وإضافة هذه كرويدات إضافية إلى مصفاة. بعد غسل الماضي تحقق من لوحة تحت المجهر للتأكد من أن جميع كرويدات قد أزيلت من الآبار الصغيرة.ثم عكس مصفاة على أنبوب 15 ملليلتر جديدة وغسل الجزء السفلي من مصفاة مع DMEM الطازجة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة لجمع كرويدات في الأنبوب. الكرويات ترتفع من 500 خلية تثبت الزيادة الأكثر تجانسا في الحجم مع مرور الوقت. مع 500 و 600 خلية لكل كروية تحديد أن يكون العدد الأمثل للخلايا التي يمكن تحقيق نمو جيد وانخفاض التباين.إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي يعزز نمو كروية والتجانس. في الثقافة على المدى الطويل، تظهر الخلايا كطبقات متعددة كثيفة في اليوم الثالث. في حين أن الخلايا المسطحة مرتبة في طبقات أحادية مرئية بوضوح في اليوم 10.ومن المثير للاهتمام، يظهر التجويف داخل كرويدات من اليوم الخامس فصاعدا. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت زيادة واضحة في الخلايا النووية المتكاثرة مستضد الخلايا إيجابية في اليومين الخامس والسابع الذي ينخفض بحلول اليوم 10. والمثير للدهشة، لوحظ Caspace تنشيط 3 في عدد قليل جدا من الخلايا في اليومين الثالث والخامس فقط.في حين لوحظت مستويات عالية من التعبير بيتا كاتينين في كل نقطة زمنية. ويتضح من إمكانات كرويدات للتمييز في Anterosites من خلال الفوسفاتاز القلوية والأسرة الناقلة سولوت 2A5 التعبير ميرنا. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر هذه الكرويات عن علامات الخلايا الجذعية السرطانية النموذجية وتستجيب للعلاج الكيميائي المركب الذي يدار بشكل روتيني لمرضى سرطان القولون والمستقيم.لذا تتكون كرويات من مجموعات خلايا مختلفة. ثم يمكن استخدامها بشكل جيد لتحليل الاستجابات الخاصة بالخلايا للمحفزات مثل الانكسار وفي نهاية المطاف للاستجابات الدوائية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...