Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

Vi anerkender billedbehandling og Anipath recherche histologi platforme (CRCL, CLB). Vi står i gæld til apoteket på Center Léon Bérard (CLB) Hospital for den slags gave folfox og FOLFIRI. Vi takker også Brigitte Manship for kritisk læsning af manuskriptet. Arbejdet blev støttet af FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) og af Inca (PLBIO19-289). MVG og LC modtog støtte fra FRM og CF modtog støtte fra ARC foundation og Centre Léon Bérard.

BEMÆRK: Oplysningerne om alle reagenser og materialer er anført i materialeoversigten.
1. Dannelse af kugleformede
<ol><li>Sfærisk kultur medier<ol>
<li>Forbered basal medium bestående af Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 4 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid.</li>
		<li>Der fremstilles et komplet DMEM-medium med et 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen/Strep) i basaltmedium fra trin 1.1.1.</li>
		<li>Forbered DMEM/kældermembran...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

In vitro 3D-modeller overvinde de vigtigste eksperimentelle ulemper ved 2D kræft cellekulturer, da de synes at være mere pålidelige i rekapitalisering typiske tumorale træk, herunder mikromiljø og celle heterogenitet. Almindeligt anvendte 3D-modeller af sfæroider er stilladsfri (dyrket i lav-vedhæftede forhold) eller stilladsbaserede (ved hjælp af biomaterialer til kulturceller). Disse metoder frembyder forskellige ulemper, da de afhænger af arten af det anvendte stillads eller giver anledning til sfæroider, de...

Tyk- og endetarmskræft (CRC) er fortsat den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald i verden1. Udviklingen af CRC er resultatet af en progressiv erhvervelse og akkumulering af genetiske mutationer og / eller epigenetiske ændringer2,3, herunder aktivering af onkogener og inaktivering af tumor suppressor gener3,4. Desuden kan ikke-genetiske faktorer (f.eks. mikromiljøet) bidrage til og fremme onkogen transformation og dermed deltage i udviklingen af CFC5. Det er vigtigt, AT'er består af forskellige cellepopulationer, herunder udifferentierede CSC'er og bulk tumorceller, der viser nogle differentieringsegenskaber, som udgør en hierarkisk struktur, der minder om epitelets organisation i en normal kolonkrypt6,7.
CSC'er anses for at være ansvarlige for tumorudseende8, dets vedligeholdelse og vækst, metastatisk kapacitet og modstand mod konventionelle terapier6,7. Inden for tumorer, kræftceller, herunder CSC'er, vise en høj grad af heterogenitet og kompleksitet med hensyn til deres forskellige mutationelle og epigenetiske profiler, morfologiske og fænotypiske forskelle, genekspression, stofskifte, spredning satser, og metastatisk potentiale9. Derfor, for bedre at forstå kræftbiologi, tumorprogression og erhvervelse af resistens over for terapi og dens oversættelse til effektive behandlinger, er menneskelige prækliniske modeller, der fanger denne kræft heterogenitet og hierarki, vigtige10,11.
In vitro 2D kræft cellelinjer har været brugt i lang tid og give værdifuld indsigt i tumor udvikling og de mekanismer, der ligger til grund for effekten af terapeutiske molekyler. Men deres begrænsning med hensyn til manglen på den fænotypiske og genetiske heterogenitet, der findes i de oprindelige tumorer, er nu bredt anerkendt12. Desuden er næringsstoffer, ilt, pH-gradienter og tumormikromiljøet ikke gengivet, idet mikromiljøet er særligt vigtigt for vedligeholdelsen af forskellige celletyper, herunder CSC'er11,12. For at overvinde disse vigtigste ulemper er der udviklet flere 3D-modeller til eksperimentelt at adressere og reproducere kompleksiteten og heterogeniteten af kræft. I realiteten opsummerer disse modeller tumor cellulær heterogenitet, cellecelleinteraktioner og rumlig arkitektur, svarende til dem, der er observeret in vivo12,13,14. Primære tumororganoider etableret fra friske tumorer, såvel som cellelinjeafledte sfæroider, er stort set ansat15,16.
Spheroids kan dyrkes på en stilladsfri eller stilladsbaseret måde for at tvinge cellerne til at danne og vokse i celleaggregater. Stilladsfrie metoder er baseret på cellernes kultur under ikke-klæbende forhold (f.eks. hængende dråbemetoden eller ultralave fastgørelsesplader), mens stilladsbaserede modeller er afhængige af naturlige, syntetiske eller hybride biomaterialer til kulturceller12,13,14. Stilladsbaserede sfæroider frembyder forskellige ulemper, da den endelige sfæroiddannelse vil afhænge af arten og sammensætningen af det anvendte (bio)materiale. Selvom de stilladsfrie sfæroidmetoder, der er tilgængelige indtil videre, ikke er afhængige af substratets art, genererer de sfæroider, der varierer i struktur og størrelse17,18.
Dette arbejde havde til formål at designe et robust og reproducerbart 3D-dyrkningssystem af sfæroider, som er homogene i størrelse, sammensat af Caco2 kolon adenocarcinomceller til at studere CSC biologi. Caco2 celler er af særlig interesse på grund af deres evne til at differentiere over tid19,20, stærkt tyder på en stængel-lignende potentiale. Derfor afslørede den langsigtede kultur af spheroids tilstedeværelsen af forskellige CSC-populationer med forskellige reaktioner på kemoterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Kolorektal cancer er kendetegnet ved heterogenitet og en hierarkisk organisation bestående af en population af kræft stamceller (CSC' er) ansvarlig for tumor udvikling, vedligeholdelse og resistens over for narkotika. En bedre forståelse af CSC egenskaber for deres specifikke målretning er derfor en forudsætning for effektiv behandling. Der er dog mangel på egnede prækliniske modeller til dybdegående undersøgelser. Selv in vitro to-dimensionelle (2D) kræft cellelinjer giver værdifuld indsigt i tumor biologi, de ikke kopiere fænotypiske og genetiske tumor heterogenitet. I modsætning hertil adresserer tredimensionelle (3D) modeller og reproducerer næsten fysiologisk kræftkompleksitet og celle heterogenitet. Formålet med dette arbejde var at designe et robust og reproducerbart 3D-kultursystem til at studere CSC biologi. Denne metode beskriver udviklingen og optimeringen af betingelser for at generere 3D-sfæroider, som er homogene i størrelse, fra Caco2 kolon adenocarcinom celler, en model, der kan bruges til langsigtet kultur. Det er vigtigt, inden for sfæroider, de celler, der var organiseret omkring lumen-lignende strukturer, var kendetegnet ved differentialcellespredning mønstre og ved tilstedeværelsen af CSC'er udtrykke et panel af markører. Disse resultater giver den første proof-of-concept for hensigtsmæssigheden af denne 3D-tilgang til undersøgelse af celle heterogenitet og CSC biologi, herunder respons på kemoterapi.

Da manglen på ensartethed i størrelsen af sfæroider er en af de største ulemper ved de nuværende 3D-sfæroidkultursystemer13, var formålet med dette arbejde at oprette en pålidelig og reproducerbar protokol for at opnå homogene sfæroider. For det første blev der for at etablere ideelle arbejdsforhold testet forskellige antal Caco2-celler, der spænder fra 50 til 2.000 celler pr. mikrowell/sfæroid ved hjælp af dedikerede plader (tabel 1)...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Denne protokol præsenterer en ny, robust, og reproducerbare kultur system til at generere og vokse tre-dimensionelle sfæroider fra Caco2 kolon adenocarcinoma celler. Resultaterne giver den første proof-of-concept for hensigtsmæssigheden af denne tilgang til undersøgelse af kræft stamcellebiologi, herunder reaktionen på kemoterapi.

En tre-dimensionel model af sfæroider til undersøgelse tyktarmskræft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Denne nye metode til sfæroid kulturer kan bruges til at studere tumorigenicity at analysere tilstedeværelsen af forskellige populationer af kræft stamceller og også kan pænt anvendes til gennem high put skærm for nye lægemidler. Dette er et robust og gentagent kulturperler system til at generere et stort antal homogent mellemstore sfæroider. Desuden kan disse sfæroider bruges til at studere kræft stamceller.Denne metode er sat op til at studere kronisk kræftbiologi, men det kan nemt sættes op til at studere andre kræftformer ved at ændre 3D-kultur betingelser. Sørg for at holde øje med bobler i mediet, for ikke at flytte pladen for meget under sfæroiderne og for at være forsigtig, når du høster spheroiderne ind i sien. Begynd med at forbehandle brøndene på en 24 brøndplade med 500 mikro liter Anti-Adherence Rinsing Solution pr. Brønd.Efter et par sekunder centrifuge pladen i svingende spand rotor og skyl hver godt med 2 milliliter varm Basal medium. Overhold pladen under mikroskopet for at sikre, at boblerne er helt fjernet fra mikrobrøndene. Hvis der ikke observeres bobler, skal brøndene skylles igen, før der tilsættes en milliliter varmt DMEM-kældermembranmatrixmedium til hver brønd.For at fremkalde sfæroiddannelse skal du se den ønskede koncentration af Caco-2-celler i et 2D monolag i en 10 centimeter skål i DMEM suppleret med 10% FBS og 1%antibiotika. For kulturen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en befugtet atmosfære. Når en 80% sammenløb er nået, vask cellerne med fem milliliter PBS, før du behandler kulturen med to milliliter Trypsin-EDTA i to til fem minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Når cellerne har løsnet neutralisere Trypsin med fire milliliter af komplet DMEM. Efter optælling, indsamle cellerne ved centrifugering og genbruge paletten i passende volumen af DMEM kælder membran matrix medium for at opnå den ønskede koncentration af celler i en milliliter af medium per brønd. Tilsæt en milliliter celler til hver brønd af den forudbetalte 24 brøndplade, efterfulgt af tilsætning af en milliliter DMEM kældermembranmatrix medium til hver brønd.Efter såning centrifugeres pladen straks, og der anvendes et let mikroskop til at kontrollere, at cellerne er jævnt fordelt over mikrobrøndene. Placer derefter pladen i cellekulturinkubatoren i 48 timer uden at forstyrre cellerne. For at høste spheroiderne skal du i slutningen af inkubationen bruge en serologisk pipette og halvdelen af supernatanten i hver brønd for forsigtigt at løsne spheroiderne fra deres mikrobrønde.Når alle de sfæroider er blevet løsrevet bruge pipetten til omhyggeligt at overføre 3D kulturer fra hver brønd til en 37 mikron reversibel si på toppen af en 15 milliliter konisk rør. Vask hver brønd tre gange med en milliliter præwarmed Basal medium pr vask til at indsamle eventuelle resterende spheroids og tilsæt disse ekstra sfæroider til si. Efter den sidste vask skal du kontrollere pladen under mikroskopet for at bekræfte, at alle spheroiderne er blevet fjernet fra mikrobrøndene.Vend derefter sien over et nyt 15 milliliter rør og vask bunden af sien med frisk DMEM kælder membranmatrix medium til at samle spheroids i røret. Spheroids stiger fra 500 celler viser den mest homogene stigning i størrelse over tid. Med 500 og 600 celler pr sfæroid bestemme at være det optimale antal celler, hvorunder god vækst og lav variation kan opnås.Tilføjelsen af kældermembranmatrix øger sfæroidvækst og homogenitet. I langsigtet kultur fremstår cellerne som tætte multilag på dag tre. Mens samkopierede celler arrangeret i monolag er tydeligt synlige på dag 10.Interessant nok vises en lumen inden for spheroids fra dag fem og fremefter. Derudover observeres en klar stigning i prolifererende cellekerneantigen positive celler i dag fem og syv, der falder ved dag 10. Overraskende nok observeres aktiveret Caspace 3 i meget få celler kun i dag tre og fem.Mens høje niveauer af Beta-catenin udtryk observeres på hvert tidspunkt. Sfæroidernes potentiale til at differentiere sig til anterositter fremgår af deres Alkaline Phosphatase og opløste bærefamilie 2A5 mRNA-udtryk. Derudover udtrykker disse sfæroider typiske kræft stamcellemarkører og reagerer på kombination kemoterapi behandlinger rutinemæssigt administreres til kolorektal cancer patienter.Så sfæroider består af forskellige cellepopulationer. Derefter kan de pænt bruges til at analysere cellespecifikke reaktioner på stimuli såsom ildfaste og i sidste ende for narkotikaresponser.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Undersøgelse af virusvektorer i et tredimensionalt Lever Model genbefolket med Human hepatocellulært carcinom HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Den Colon-26 Carcinoma Tumor-bærende mus som en model for Studiet af Cancer Kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode til at definere virkningerne af miljøberigelse på tyktarmen Microbiome biodiversitet i en mus tyktarmen tumoren Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensionel Thymisk kultur system til at generere murine induceret pluripotente stamcelle-afledte tumor antigen-specifikke Thymisk emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...