Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
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Nous reconnaissons les plateformes d’imagerie et d’histologie de recherche anipathique (CRCL, CLB). Nous sommes redevables à la pharmacie de l’Hôpital du Centre Léon Bérard (CLB) pour le don de type FOLFOX et FOLFIRI. Nous remercions également Brigitte Manship pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux ont été soutenus par le FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) et par l’Inca (PLBIO19-289). MVG et LC ont reçu le soutien du FRM et CF a reçu le soutien de la fondation ARC et du Centre Léon Bérard.

REMARQUE : Les détails de tous les réactifs et matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Formation de sphéroïdes
<ol><li>Milieux de culture sphéroïdes<ol>
<li>Préparer un milieu basal composé du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un dipeptide L-alanyl-L-glutamine de 4 mM.</li>
		<li>Préparer le milieu complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep) en milieu basal à ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. 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G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. 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G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

Les modèles 3D in vitro surmontent les principaux inconvénients expérimentaux des cultures de cellules cancéreuses 2D, car ils semblent être plus fiables pour récapituler les caractéristiques tumorales typiques, y compris le microenvironnement et l’hétérogénéité cellulaire. Les modèles 3D couramment utilisés de sphéroïdes sont sans échafaudage (cultivés dans des conditions de faible fixation) ou à base d’échafaudage (en utilisant des biomatériaux pour faire culturer des cellules). Ces méthodes p...

Le cancer colorectal (CCR) reste la deuxième cause de décès associés au cancer dans le monde1. Le développement du CRC est le résultat d’une acquisition et d’une accumulation progressives de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques2,3,notamment l’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs detumeurs 3,4. De plus, des facteurs non génétiques (p. ex. le microenvironnement) peuvent contribuer à la transformation oncogène et la promouvoir, et ainsi participer à l’évolution des CRC5. Il est important de faire en sorte que les CRC soient composés de différentes populations cellulaires, notamment de CSC indifférenciés et de cellules tumorales en vrac présentant certains traits de différenciation, qui constituent une structure hiérarchique rappelant l’organisation de l’épithélium dans une crypte normale du côlon6,7.
Les CSC sont considérés comme responsables de l’aspect tumoral8,de son maintien et de sa croissance, de sa capacité métastatique et de sa résistance aux thérapies conventionnelles6,7. Dans les tumeurs, les cellules cancéreuses, y compris les CSC, présentent un niveau élevé d’hétérogénéité et de complexité en termes de profils mutationnels et épigénétiques distincts, de différences morphologiques et phénotypiques, d’expression génique, de métabolisme, de taux de prolifération et de potentiel métastatique9. Par conséquent, pour mieux comprendre la biologie du cancer, la progression tumorale et l’acquisition de la résistance à la thérapie et sa traduction en traitements efficaces, les modèles précliniques humains capturant cette hétérogénéité et cette hiérarchie du cancer sont importants10,11.
Les lignées cellulaires in vitro du cancer 2D sont utilisées depuis longtemps et fournissent des informations précieuses sur le développement tumoral et les mécanismes sous-jacents à l’efficacité des molécules thérapeutiques. Cependant, leur limitation en ce qui concerne l’absence de l’hétérogénéité phénotypique et génétique trouvée dans les tumeurs originales est maintenant largement reconnue12. De plus, les nutriments, l’oxygène, les gradients de pH et le microenvironnement tumoral ne sont pas reproduits, le microenvironnement étant particulièrement important pour le maintien des différents types de cellules, y compris les CSC11,12. Pour surmonter ces principaux inconvénients, plusieurs modèles 3D ont été développés pour traiter et reproduire expérimentalement la complexité et l’hétérogénéité des cancers. En effet, ces modèles récapitulent l’hétérogénéité cellulaire tumorale, les interactions cellule-cellule, et l’architecture spatiale, semblables à celles observées in vivo12,13,14. Les organoïdes tumoraux primaires établis à partir de tumeurs fraîches, ainsi que des sphéroïdes dérivés de la lignée cellulaire, sont largement employés15,16.
Les sphéroïdes peuvent être cultivés d’une manière sans échafaudage ou basée sur l’échafaudage pour forcer les cellules à se former et à se développer dans des agrégats cellulaires. Les méthodes sans échafaudage sont basées sur la culture de cellules dans des conditions non adhérentes (par exemple, la méthode de suspension-goutte ou les plaques de fixation ultra-basses), tandis que les modèles à base d’échafaudages reposent sur des biomatériaux naturels, synthétiques ou hybrides pour les cellules de culture12,13,14. Les sphéroïdes à base d’échafaudage présentent différents inconvénients car la formation finale des sphéroïdes dépendra de la nature et de la composition du (bio)matériau utilisé. Bien que les méthodes de sphéroïdes sans échafaudage disponibles jusqu’à présent ne reposent pas sur la nature du substrat, elles génèrent des sphéroïdes dont la structure et la taillevarient 17,18.
Ce travail visait à concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible d’asphéroïdes, de taille homogène, composé de cellules d’adénocarcinome du côlon Caco2 pour étudier la biologie du CSC. Les cellules Caco2 présentent un intérêt particulier en raison de leur capacité à se différencier au fil du temps19,20,suggérant fortement un potentiel de type radical. En conséquence, la culture à long terme des sphéroïdes a indiqué la présence de différentes populations de CSC avec différentes réponses à la chimiothérapie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Les cancers colorectaux sont caractérisés par une hétérogénéité et une organisation hiérarchique comprenant une population de cellules souches cancéreuses (CSC) responsables du développement tumoral, de l’entretien et de la résistance aux médicaments. Une meilleure compréhension des propriétés du SCC pour leur ciblage spécifique est donc une condition préalable à l’efficacité d’un traitement. Cependant, il y a un manque de modèles précliniques appropriés pour des enquêtes approfondies. Bien que les variétés de cellule bidimensionnelles in vitro de cancer (2D) fournissent des aperçus valables dans la biologie de tumeur, elles ne répliquent pas l’hétérogénéité phénotypique et génétique de tumeur. En revanche, les modèles tridimensionnels (3D) abordent et reproduisent la complexité quasi physiologique du cancer et l’hétérogénéité cellulaire. L’objectif de ces travaux était de concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible pour étudier la biologie du CSC. La méthodologie actuelle décrit le développement et l’optimisation des conditions pour générer des sphéroïdes 3D, qui sont homogènes dans la taille, des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points, un modèle qui peut être employé pour la culture à long terme. D’une manière primordiale, dans les sphéroïdes, les cellules qui ont été organisées autour de lumen-comme des structures, ont été caractérisées par des modèles différentiels de prolifération cellulaire et par la présence de CSCs exprimant un panneau de marqueurs. Ces résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche 3D pour étudier l’hétérogénéité cellulaire et la biologie du CSC, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Comme le manque d’homogénéité dans la taille des sphéroïdes est l’un des principaux inconvénients des systèmes de culture sphéroïde 3D actuellement disponibles13,le but de ce travail était de mettre en place un protocole fiable et reproductible pour obtenir des sphéroïdes homogènes. Tout d’abord, pour établir des conditions de travail idéales, différents nombres de cellules Caco2 ont été testés, allant de 50 à 2 000 cellules par microwell ...

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Cette nouvelle méthode de cultures sphéroïdes peut être utilisée pour étudier la tumorigénicité pour analyser la présence de différentes populations de cellules souches cancéreuses et peut également être bien appliquée pour par le biais d’un dépistage élevé pour de nouveaux médicaments. Il s’agit d’un système de culture robuste et répétitif pour générer un grand nombre de sphéroïdes de taille homogène. De plus, ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour étudier les cellules souches cancéreuses.Cette méthode est mise en place pour étudier la biologie du cancer chronique, mais elle peut être facilement mise en place pour étudier d’autres cancers en modifiant les conditions de culture 3D. Assurez-vous de surveiller les bulles dans le milieu, de ne pas trop déplacer la plaque pendant la formation des sphéroïdes et d’être prudent lors de la récolte des sphéroïdes dans la passoire. Commencez par prétringer les puits d’une plaque de 24 puits avec 500 micro litres de solution de rinçage anti-adhérence par puits.Après quelques secondes centrifuger la plaque dans le rotor à godet oscillant et rincer chaque puits avec 2 millilitres de milieu basal chaud. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles ont été complètement retirées des micro-puits. Si aucune bulle n’est observée, rincez à nouveau les puits avant d’ajouter un millilitre de milieu matriciel chaud de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.Pour induire la formation de sphéroïdes, voir la concentration souhaitée de cellules Caco-2 dans une couche mono 2D dans un plat de 10 centimètres dans le DMEM complété avec 10% FBS et 1% antibiotiques. Pour la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans une atmosphère humidifiée. Lorsqu’une confluence de 80% est atteinte, laver les cellules avec cinq millilitres de PBS avant de traiter la culture avec deux millilitres de Trypsine-EDTA pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de DMEM complet. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et ressusciter la palette dans le volume approprié de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM pour atteindre la concentration souhaitée de cellules dans un millilitre de milieu par puits. Ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits de la plaque prépayée de 24 puits, suivi de l’ajout d’un millilitre de milieu matriciel de membrane de sous-sol DMEM à chaque puits.Après l’ensemencement, centrifugez immédiatement la plaque et utilisez un microscope optique pour vérifier que les cellules ont été réparties uniformément dans les micro-puits. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures sans perturber les cellules. Pour récolter les sphéroïdes, à la fin de l’incubation, utilisez une pipette sérologique et la moitié du surnageant dans chaque puits pour déloger doucement les sphéroïdes de leurs micro-puits.Lorsque tous les sphéroïdes ont été détachés, utilisez la pipette pour transférer soigneusement les cultures 3D de chaque puits vers une passoire réversible de 37 microns au-dessus d’un tube conique de 15 millilitres. Lavez chaque puits trois fois avec un millilitre de milieu basal pré-feu par lavage pour collecter les sphéroïdes restants et ajoutez ces sphéroïdes supplémentaires à la passoire. Après le dernier lavage, vérifiez la plaque au microscope pour confirmer que tous les sphéroïdes ont été retirés des micro-puits.Ensuite, inversez la passoire sur un nouveau tube de 15 millilitres et lavez le fond de la passoire avec un milieu de matrice de membrane de sous-sol DMEM frais pour recueillir les sphéroïdes dans le tube. Les sphéroïdes s’élèvent de 500 cellules démontrent l’augmentation la plus homogène de la taille au fil du temps. Avec 500 et 600 cellules par sphéroïde, déterminez le nombre optimal de cellules sous lesquelles une bonne croissance et une faible variabilité peuvent être obtenues.L’ajout de la matrice de membrane de sous-sol améliore la croissance et l’homogénéité de sphéroïde. Dans la culture à long terme, les cellules apparaissent sous forme de multi-couches denses au troisième jour. Alors que les cellules aplatir disposées en couches mono sont clairement visibles au jour 10.Fait intéressant, une lumière apparaît dans les sphéroïdes à partir du cinquième jour. En outre, une nette augmentation des cellules proliférantes cellules nucléaires antigène positif est observée aux jours cinq et sept qui diminue au jour 10. Étonnamment, Caspace activé 3 est observé dans très peu de cellules aux jours trois et cinq seulement.Alors que des niveaux élevés d’expression de la bêta-caténoine sont observés à chaque point de temps. Le potentiel des sphéroïdes à se différencier en anterosites est démontré par leur phosphatase alcaline et soluté famille 2A5 ADN messagère expression. En outre, ces sphéroïdes expriment les marqueurs typiques de cellule souche de cancer et répondent aux traitements de chimiothérapie de combinaison habituellement administrés aux cancéreux côlorectaux.Ainsi, les sphéroïdes sont composés de différentes populations cellulaires. Ils peuvent ensuite être bien utilisés pour analyser les réponses spécifiques des cellules aux stimuli tels que les réfractaires et éventuellement pour les réponses médicamenteuses.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Recherche

Recherche en cancérologie

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Le Colon-26 Carcinome portant une tumeur de la souris comme modèle pour l&#39;étude du cancer cachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...