Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

Wir erkennen die Imaging- und Anipath-Recherche-Histologie-Plattformen (CRCL, CLB) an. Wir sind der Apotheke des Centre Léon Bérard (CLB) Krankenhauses für das freundliche Geschenk von FOLFOX und FOLFIRI zu verdanken. Wir danken auch Brigitte Manship für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeiten wurden vom FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) und der Inca (PLBIO19-289) unterstützt. MVG und LC erhielten Unterstützung von der FRM und CF erhielt Unterstützung von der ARC-Stiftung und dem Centre Léon Bérard.

HINWEIS: Die Einzelheiten aller Reagenzien und Materialien sind in der Materialtabelleaufgeführt.
1. Sphäroidbildung
<ol><li>Sphäroide Kulturmedien<ol>
<li>Bereiten Sie Basalmedium bestehend aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid.</li>
		<li>Bereiten Sie DMEM komplettes Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.</li>
		<li>Bereiten Sie DMEM/Basem...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. 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B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. 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G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

In-vitro-3D-Modelle überwinden die wichtigsten experimentellen Nachteile von 2D-Krebszellkulturen, da sie bei der Rekapitulation typischer Tumormerkmale wie Mikroumgebung und Zellheterogenität zuverlässiger zu sein scheinen. Häufig verwendete 3D-Modelle von Sphäroiden sind gerüstfrei (kultiviert unter niedriganbaulichen Bedingungen) oder Gerüstbasis (mit Biomaterialien zur Kulturvon Zellen). Diese Methoden weisen unterschiedliche Nachteile auf, da sie von der Art des verwendeten Gerüsts abhängen oder sphäroide ...

Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor die zweithäufigste Ursache für krebsassoziierte Todesfälle weltweit1. Die Entwicklung von SCRC ist das Ergebnis einer fortschreitenden Erfassung und Akkumulation genetischer Mutationen und/oder epigenetischer Veränderungen2,3, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen3,4. Darüber hinaus können nichtgenetische Faktoren (z. B. die Mikroumgebung) zur onkogenen Transformation beitragen und diese fördern und somit an der Entwicklung der SFB5teilnehmen. Wichtig ist, dass CRCs aus verschiedenen Zellpopulationen bestehen, einschließlich undifferenzierter CSCs und Massentumorzellen, die einige Differenzierungsmerkmale aufweisen, die eine hierarchische Struktur darstellen, die an die Organisation des Epithels in einer normalen Doppelpunktkryptaerinnert 6,7.
CSCs gelten als verantwortlich für Tumor aussehen8, seine Wartung und Wachstum, metastasierende Kapazität, und Resistenz gegen konventionelle Therapien6,7. Innerhalb von Tumoren weisen Krebszellen, einschließlich CSCs, ein hohes Maß an Heterogenität und Komplexität in Bezug auf ihre ausgeprägten Mutations- und Epigenetischen Profile, morphologische und phäkotypische Unterschiede, Genexpression, Stoffwechsel, Proliferationsraten und metastasisches Potenzialauf 9. Daher, um Krebsbiologie besser zu verstehen, Tumorprogression, und Erwerb der Resistenz gegen Therapie und ihre Umsetzung in wirksame Behandlungen, menschliche präklinische Modelle erfassung diese Krebsheterogenität und Hierarchie sind wichtig10,11.
In-vitro-2D-Krebszelllinien werden seit langem verwendet und liefern wertvolle Einblicke in die Tumorentwicklung und die Mechanismen, die der Wirksamkeit therapeutischer Moleküle zugrunde liegen. Jedoch, ihre Beschränkung in Bezug auf das Fehlen der phänotypischen und genetischen Heterogenität in den ursprünglichen Tumoren gefunden ist jetzt weithin anerkannt12. Darüber hinaus werden Nährstoffe, Sauerstoff, pH-Gradienten und die Tumormikroumgebung nicht reproduziert, wobei die Mikroumgebung für die Aufrechterhaltung verschiedener Zelltypen, einschließlich CSCs11,12,besonders wichtig ist. Um diese Hauptnachteile zu überwinden, wurden mehrere 3D-Modelle entwickelt, um die Komplexität und Heterogenität von Krebsen experimentell anzugehen und zu reproduzieren. In der Tat rekapitulieren diese Modelle tumorzelluläre Heterogenität, Zell-Zell-Interaktionen und räumliche Architektur, ähnlich denen, die in vivo12,13,14beobachtet wurden. Primäre Tumororganoide, die aus frischen Tumoren sowie zelllinienabgeleiteten Sphäroiden hergestellt werden, werden größtenteils15,16eingesetzt.
Sphäroide können auf Gerüst-freie oder Gerüstbasis kultiviert werden, um die Zellen zu zwingen, sich in Zellaggregaten zu bilden und zu wachsen. Gerüstfreie Methoden basieren auf der Kultur von Zellen unter nicht haftenden Bedingungen (z.B. die Hängetropfenmethode oder ultraniedrige Aufsatzplatten), während Gerüstmodelle auf natürlichen, synthetischen oder hybriden Biomaterialien zu Kulturzellen12,13,14basieren. Gerüst-basierte Sphäroide stellen unterschiedliche Nachteile dar, da die endgültige Sphäroidbildung von der Art und Zusammensetzung des verwendeten (Bio-)Materials abhängt. Obwohl die gerüstfreien Sphäroid-Methoden, die bisher zur Verfügung stehen, nicht auf die Art des Substrats angewiesen sind, erzeugen sie Sphäroide, die in Struktur und Größe17,18variieren.
Diese Arbeit zielte darauf ab, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem von Sphäroiden zu entwerfen, die homogen in der Größe sind und aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen bestehen, um die CSC-Biologie zu studieren. Caco2-Zellen sind von besonderem Interesse aufgrund ihrer Fähigkeit, im Laufe der Zeit zu differenzieren19,20, stark auf ein Stammpotenzial hindeutend. Dementsprechend zeigte die Langzeitkultur der Sphäroide das Vorhandensein verschiedener CSC-Populationen mit unterschiedlichen Reaktionen auf die Chemotherapie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Darmkrebs ist durch Heterogenität und eine hierarchische Organisation gekennzeichnet, die eine Population von Krebsstammzellen (CSCs) umfasst, die für die Tumorentwicklung, -erhaltung und -resistenz gegen Medikamente verantwortlich sind. Ein besseres Verständnis der CSC-Eigenschaften für ihre spezifische Ausrichtung ist daher eine Voraussetzung für eine effektive Therapie. Es gibt jedoch einen Mangel an geeigneten präklinischen Modellen für eingehende Untersuchungen. Obwohl in vitro zweidimensionale (2D) Krebszelllinien wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie liefern, replizieren sie die phänotypische und genetische Tumorheterogenität nicht. Im Gegensatz dazu adressieren und reproduzieren dreidimensionale (3D) Modelle die nahe physiologische Krebskomplexität und Zellheterogenität. Ziel dieser Arbeit war es, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem zu entwerfen, um CSC-Biologie zu studieren. Die vorliegende Methodik beschreibt die Entwicklung und Optimierung von Bedingungen zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden, die homogen in der Größe sind, aus Caco2-Kolon-Adenokarzinomzellen, einem Modell, das für die langfristige Kultur verwendet werden kann. Wichtig ist, dass innerhalb der Sphäroide die Zellen, die um lumenartige Strukturen organisiert waren, durch differentiale Zellproliferationsmuster und durch das Vorhandensein von CSCs gekennzeichnet waren, die ein Panel von Markern ausdrückten. Diese Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses 3D-Ansatzes zur Untersuchung der Zellheterogenität und CSC-Biologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Da der Mangel an Homogenität in der Größe der Sphäroide einer der Hauptnachteile der derzeit verfügbaren 3D-Sphäroid-Kultursysteme13ist, bestand das Ziel dieser Arbeit darin, ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll zur Erzielung homogener Sphäroide zu erstellen. Um ideale Arbeitsbedingungen zu schaffen, wurden verschiedene Anzahl von Caco2-Zellen getestet, die von 50 bis 2.000 Zellen pro Mikrowell/Spheroid mit speziellen Platten reichten (T...

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Diese neue Methode der Sphäroidkulturen kann verwendet werden, um die Tumorigenität zu untersuchen, um das Vorhandensein verschiedener Populationen von Krebsstammzellen zu analysieren und kann auch schön auf durch High Put Screen für neue Medikamente angewendet werden. Dies ist ein robustes und sich wiederholendes kultiviertes System zur Erzeugung einer großen Anzahl homogener Sphäroide. Darüber hinaus können diese Sphäroide verwendet werden, um krebserende Stammzellen zu untersuchen.Diese Methode wurde eingerichtet, um chronische Krebsbiologie zu studieren, aber es kann leicht eingerichtet werden, um andere Krebsarten zu studieren, indem die 3D-Kulturbedingungen geändert werden. Achten Sie darauf, auf Blasen im Medium zu achten, die Platte während der Sphäroidbildung nicht zu sehr zu bewegen und vorsichtig zu sein, wenn Sie die Sphäroide in das Sieb ernten. Beginnen Sie mit der Vorbehandlung der Brunnen einer 24 WellPlatte mit 500 Mikroliter Anti-Adherence Rinsing Solution pro Brunnen.Nach ein paar Sekunden zentrifugieren Sie die Platte im Schwingen-Schaufelrotor und spülen Sie jeden Brunnen mit 2 Milliliter warmes Basalmedium. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Blasen vollständig aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn keine Blasen beobachtet werden, spülen Sie die Brunnen erneut, bevor Sie jeweils einen Milliliter warme DMEM-Kellermembranmatrix zu jedem Brunnen hinzufügen.Um die Sphäroidbildung zu induzieren, sehen Sie die gewünschte Konzentration von Caco-2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in einer 10-Zentimeter-Schale in DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika. Für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Atmosphäre. Wenn eine Konvexität von 80 % erreicht ist, waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Kultur mit zwei Millilitern Trypsin-EDTA zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln.Wenn die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern vollständiger DMEM. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Palette im entsprechenden Volumen des DMEM-Kellermembranmatrixmediums wieder aufsetzen, um die gewünschte Konzentration der Zellen in einem Milliliter Medium pro Brunnen zu erreichen. Fügen Sie jedem Brunnen der Prepaid 24 Well Platte einen Milliliter Zellen hinzu, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter DMEM-Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen.Nach der Aussaat zentrieren Sie die Platte sofort und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig über die Mikrobrunnen verteilt wurden. Dann legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für 48 Stunden, ohne die Zellen zu stören. Um die Sphäroide am Ende der Inkubation zu ernten, verwenden Sie eine serologische Pipette und die Hälfte des Überstandes in jedem Brunnen, um die Sphäroide sanft aus ihren Mikrobrunnen zu entfernen.Wenn alle Sphäroide abgetrennt sind, verwenden Sie die Pipette, um die 3D-Kulturen von jedem Brunnen vorsichtig auf ein 37 Mikron reversibles Sieb auf einem 15 Milliliter konischen Rohr zu übertragen. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit einem Milliliter vorgewärmten Basalmedium pro Wäsche, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln und fügen Sie diese zusätzlichen Sphäroide zum Sieb hinzu. Nach der letzten Wäsche überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Sphäroide aus den Mikrobrunnen entfernt wurden.Dann das Sieb über ein neues 15-Milliliter-Rohr umkehren und den Boden des Siebs mit frischem DMEM-Kellermembran-Matrixmedium waschen, um die Sphäroide in das Rohr zu sammeln. Sphäroide steigen aus 500 Zellen und weisen im Laufe der Zeit den homogensten Größenzuwachs auf. Mit 500 und 600 Zellen pro Sphäroid bestimmen, um die optimale Anzahl von Zellen zu sein, unter denen gutes Wachstum und geringe Variabilität erreicht werden können.Die Zugabe von Kellermembranmatrix verbessert das Sphäroidwachstum und die Homogenität. In der Langzeitkultur erscheinen die Zellen an Tag drei als dichte Multi-Layer. Während abgeflachte Zellen, die in Monoschichten angeordnet sind, an Tag 10 deutlich sichtbar sind.Interessanterweise erscheint ein Lumen innerhalb der Sphäroide ab dem fünften Tag. Darüber hinaus wird an den Tagen fünf und sieben, die am Tag 10 abnehmen, ein deutlicher Anstieg der proliferierenden zellnuklearen Antigen-positiven Zellen beobachtet. Überraschenderweise wird der aktivierte Caspace 3 nur an den Tagen drei und fünf in sehr wenigen Zellen beobachtet.Während hohe Konzentrationen der Beta-Catenin-Expression zu jedem Zeitpunkt beobachtet werden. Das Potenzial der Sphäroide, sich in Anterositen zu differenzieren, wird durch ihre Alkaline Phosphatase und die solute Trägerfamilie 2A5 mRNA-Expression belegt. Darüber hinaus exprimieren diese Sphäroide typische Krebsstammzellmarker und reagieren auf Kombinations-Chemotherapie-Behandlungen, die regelmäßig an Darmkrebspatienten verabreicht werden.Sphäroide bestehen also aus verschiedenen Zellpopulationen. Sie können dann schön verwendet werden, um zellspezifische Reaktionen auf Reize wie Refrakszen und schließlich für Arzneimittelreaktionen zu analysieren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Forschung

Krebsforschung

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...