Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

אנו מכירים בפלטפורמות ההדמיה וההיסטולוגיה של אניפת רצ'ה (CRCL, CLB). אנו חייבים לבית המרקחת של בית החולים סנטר לאון ברארד (CLB) עבור המתנה האדיבה של FOLFOX ו FOLFIRI. אנו מודים גם לבריג'יט מנשיפ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. העבודה נתמכה על ידי FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ועל ידי האינקה (PLBIO19-289). MVG ו- LC קיבלו תמיכה מה- FRM ו- CF שקיבלו תמיכה מקרן ARC ומהמרכז לאון ברארד.

הערה: הפרטים של כל ריאגנטים וחומרים מפורטים בטבלת החומרים.
1. היווצרות ספרואידית
<ol><li>מדיית תרבות ספרואידית<ol>
<li>הכינו מדיום בזלי המורכב מ-DMEM בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco בתוספת 4 מ"מ L-אלניל-ל-גלוטמין דיפטיד.</li>
		<li>הכינו מדיום מלא של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו-1...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

אין ויטרו מודלים 3D להתגבר על החסרונות הניסיוניים העיקריים של תרביות תאים סרטניים 2D, כפי שהם נראים אמינים יותר recapitulating תכונות גידול טיפוסי כולל microenvironment והטרוגניות התא. מודלים תלת-ממדיים נפוצים של ספרואידים הם נטולי פיגומים (בתרבית בתנאים של התקשרות נמוכה) או מבוססי פיגומים (שימוש בביו-חו?...

סרטן המעי הגס (CRC) נשאר הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן בעולם1. הפיתוח של CRC הואתוצאהשל רכישה מתקדמת והצטברות של מוטציות גנטיות ו / או שינויים אפיגנטיים 2,3, כולל הפעלה של אונקוגנים והפעלה של גנים מדכאי גידול3,4. יתר על כן, גורמים לא גנטיים (למשל, microenvironment) יכול לתרום ולקדם טרנספורמציה oncogenic ובכך להשתתף באבולוציה של CRCs5. חשוב לציין, CRCs מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות, כולל CSCs מובחנים ותאי גידול בתפזורת המציגים כמה תכונות בידול, המהוות מבנה היררכי המזכיר את ארגון האפיתל בקריפטה המעי הגס נורמלי6,7.
CSCs נחשבים אחראים על מראה הגידול8, תחזוקה וצמיחה שלה, קיבולת גרורתית, והתנגדות לטיפולים קונבנציונליים6,7. בתוך גידולים, תאים סרטניים, כולל CSCs, להציג רמה גבוהה של הטרוגניות ומורכבות במונחים של פרופילים מוטציה ואפיגנטית מובהק שלהם, הבדלים מורפולוגיים פנוטיפיים, ביטוי גנים, חילוף החומרים, שיעורי התפשטות, פוטנציאל גרורתי9. לכן, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הסרטן, התקדמות הגידול, ורכישת עמידות לטיפול ותרגומו לטיפולים יעילים, מודלים פרה-קוליניים אנושיים הלוכדים את ההטרוגניות וההיררכיה של סרטן זה חשובים10,11.
In vitro 2D קווי תאים סרטניים שימשו במשך זמן רב ולספק תובנות חשובות על התפתחות הגידול ואת המנגנונים שבבסיס היעילות של מולקולות טיפוליות. עם זאת, המגבלה שלהם ביחס לחוסר ההטרוגניות הפנוטיפית והגנטית שנמצאה בגידולים המקוריים מוכרת כיום באופן נרחב12. יתר על כן, חומרים מזינים, חמצן, שיפוע pH, ואת microenvironment הגידול אינם משוחזרים, microenvironment להיות חשוב במיוחד לשמירה על סוגי תאים שונים כולל CSCs11,12. כדי להתגבר על חסרונות עיקריים אלה, מספר מודלים 3D פותחו כדי לטפל באופן ניסיוני ולשכפל את המורכבות וההטרוגניות של סרטן. למעשה, מודלים אלה מסכמים מחדש את ההטרוגניות התאית הגידולית, אינטראקציות תאים וארכיטקטורה מרחבית, בדומה לאלה שנצפו ב vivo12,13,14. אורגנואידים גידול ראשוני הוקמה גידולים טריים, כמו גם ספירואידים קו התא נגזר, מועסקים בעיקר15,16.
ניתן לתרבת ספרואידים באופן נטול פיגומים או פיגומים כדי לאלץ את התאים להיווצר ולצמוח באגרגטים של תאים. שיטות ללא פיגומים מבוססות על תרבות התאים בתנאים שאינם עמידים (למשל, שיטת תלייה-טיפה או לוחות התקשרות נמוכים במיוחד), ואילו מודלים מבוססי פיגומים מסתמכים על ביו-חומרים טבעיים, סינתטיים או היברידיים לתאי תרבות12,13,14. ספירואידים מבוססי פיגומים מציגים חסרונות שונים שכן היווצרות הכדורואיד הסופי תהיה תלויה באופיו ובהרכבו של החומר (הביולוגי) בו נעשה שימוש. למרות ששיטות הכדורידים נטולות הפיגומים הזמינות עד כה אינן מסתמכות על אופי המצע, הן יוצרות ספרואידים המשתנים במבנה ובגודל17,18.
עבודה זו נועדה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה וניתנת לשחזור של ספרואידים, שהם הומוגניים בגודלם, המורכבים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2 לחקר הביולוגיה של CSC. תאי Caco2 מעניינים במיוחד בשל יכולתם להבדיל לאורך זמן19,20, מאוד מציע פוטנציאל דמוי גזע. בהתאם לכך, תרבות ארוכת טווח של הכדורואידים חשפה את נוכחותן של אוכלוסיות CSC שונות עם תגובות שונות לכימותרפיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

סרטן המעי הגס מאופיין בהטרוגניות ובארגון היררכי הכולל אוכלוסייה של תאי גזע סרטניים (CSCs) האחראים על התפתחות הגידול, תחזוקתו והעמידות לתרופות. הבנה טובה יותר של מאפייני CSC עבור המיקוד הספציפי שלהם היא, אם כן, דרישה מוקדמת לטיפול יעיל. עם זאת, יש מחסור במודלים פרה-קוליניים מתאימים לחקירות מעמיקות. למרות הפריה דו מימדית (2D) קווי תאים סרטניים לספק תובנות חשובות לתוך הביולוגיה הגידול, הם לא לשכפל את ההטרוגניות גידול פנוטיפי וגנטי. לעומת זאת, מודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) מטפלים ומשכפלים מורכבות סרטן כמעט פיזיולוגית והטרוגניות של תאים. מטרת עבודה זו הייתה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה של CSC. המתודולוגיה הנוכחית מתארת את הפיתוח והאופטימיזציה של תנאים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים, שהם הומוגניים בגודלם, מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2, מודל שניתן להשתמש בו לתרבות ארוכת טווח. חשוב לציין, בתוך הכדורואידים, התאים שאורגנו סביב מבנים דמויי לומן, התאפיינו בדפוסי התפשטות תאים דיפרנציאליים ובנוכחות CSCs המבטאים פאנל של סמנים. תוצאות אלו מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה תלת-ממדית זו לחקר הטרוגניות התא וביולוגיה של CSC, כולל התגובה לכימותרפיה.

כמו חוסר הומוגניות בגודל של ספרואידים הוא אחד החסרונות העיקריים של מערכות תרבות 3D ספירואיד זמין כיום13, המטרה של עבודה זו הייתה להקים פרוטוקול אמין לשחזור כדי להשיג כדוריות הומוגניות. ראשית, כדי לקבוע תנאי עבודה אידיאליים, נבדקו מספר שונה של תאי Caco2, הנעים בין...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

שיטה חדשה זו של תרבויות ספרואיד יכול לשמש כדי ללמוד את tumorigenicity לנתח את נוכחותם של אוכלוסיות שונות של תאי גזע סרטניים וגם ניתן ליישם יפה דרך מסך לשים גבוה עבור תרופות חדשות. זוהי מערכת תרבותית חזקה וחוזרת על עצמו ליצירת מספר רב של ספרואידים בגודל הומוגני. יתר על כן, כדוריות אלה ניתן להשתמש כדי ללמוד תאי גזע סרטניים.שיטה זו מוגדרת ללמוד ביולוגיה סרטן כרונית אבל זה יכול להיות מוגדר בקלות ללמוד סרטן אחרים על ידי שינוי התנאים תרבות 3D. הקפד לצפות בועות במדיום, לא להזיז את הצלחת יותר מדי במהלך היווצרות spheroids כדי להיות זהיר בעת קצירת spheroids לתוך מסננת. התחל על ידי טיפול מראש בארות של צלחת 24 גם עם 500 ליטרים של פתרון נגד דבקות שטיפה לכל באר.לאחר מספר שניות צנטריפוגה את הצלחת רוטור דלי מתנדנד ולשטוף כל באר עם 2 מיליליטר של מדיום בזל חם. שימו לב לצלחת שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהבועות הוסרו לחלוטין מבארות המיקרו. אם אין בועות נצפו, לשטוף את הבארות שוב לפני הוספת מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM חם בינוני לכל באר.כדי לגרום להיווצרות ספרואידית, ראה את הריכוז הרצוי של תאי קאקו-2 בשכבת מונו דו-ממדית בצלחת של 10 ס"מ ב- DMEM בתוספת 10%FBS ו- 1%אנטיביוטיקה. לתרבות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה לחה. כאשר מגיעים ל-80%, שטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS לפני הטיפול בתרבות בשני מיליליטרים של טריפסין-אדטה במשך שתיים עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.כאשר התאים התנתקו לנטרל את טריפסין עם ארבעה מיליליטר של DMEM מלא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את הצבעים בנפח המתאים של מדיום מטריצת קרום מרתף DMEM כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים במיליליטר אחד של מדיום לכל באר. הוסף מיליליטר אחד של תאים לכל באר של צלחת 24 באר מראש, ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM מדיום לכל באר.לאחר הזריעה, מיד צנטריפוגה הצלחת ולהשתמש מיקרוסקופ אור כדי לוודא כי התאים הופצו באופן שווה על פני בארות מיקרו. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות מבלי להפריע לתאים. כדי לקצור את הספארוידים, בסוף הדגירה, השתמשו בפיפטה סרולוגית וחצי מהספרואידים בכל באר כדי לעקור בעדינות את הספרוידים מבארות המיקרו שלהם.כאשר כל הספארוידים נותקו, השתמש בפיפט כדי להעביר בזהירות את תרביות ה-3D מכל באר למסננת הפיכה של 37 מיקרון על גבי צינור חרוט של 15 מיליליטר. לשטוף כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של בינוני בזל מראש לכל לשטוף כדי לאסוף את כל spheroids הנותרים ולהוסיף אלה spheroids נוספים מסננת. לאחר הכביסה האחרונה לבדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר כי כל spheroids הוסרו מן בארות מיקרו.ואז להפוך את מסננת מעל צינור חדש 15 מיליליטר ולשטוף את החלק התחתון של מסננת עם טרי DMEM מרתף מטריצת מדיום כדי לאסוף את spheroids לתוך הצינור. ספרואידים עולים מ 500 תאים להדגים את הגידול ההומוגניים ביותר בגודל לאורך זמן. עם 500 ו 600 תאים לכל ספרואיד לקבוע להיות המספר האופטימלי של תאים שתחתיו צמיחה טובה שונות נמוכה ניתן להשיג.התוספת של מטריצת קרום מרתף משפרת את הצמיחה ספרואידית והומוגניות. בתרבות ארוכת טווח, התאים מופיעים כמו שכבות מרובות צפופות ביום השלישי. בעוד תאים שטוחים מסודרים בשכבות מונו גלויים בבירור ביום 10.באופן מעניין, לומן מופיע בתוך הכדורואידים מהיום החמישי ואילך. בנוסף, עלייה ברורה בתאים המתרבים תאים גרעיניים אנטיגן חיובי נצפתה בימים חמש ושבע כי יורד ביום 10. באופן מפתיע, Caspace מופעל 3 נצפתה בתאים מעטים מאוד בימים שלוש וחמש בלבד.בעוד רמות גבוהות של ביטוי בטא קטנין נצפים בכל נקודת זמן. הפוטנציאל של spheroids להבדיל לתוך Anterosites מעיד על ידי שלהם אלקליין Phosphatase ואת משפחת המוביל מסיס 2A5 ביטוי mRNA. בנוסף, ספירואידים זה מבטאים סמני תאי גזע סרטניים טיפוסיים ומגיבים לטיפולי כימותרפיה משולבים הניתנים באופן שגרתי לחולי סרטן המעי הגס.אז ספרואידים מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות. לאחר מכן הם יכולים לשמש יפה כדי לנתח תגובות ספציפיות לתאים לגירויים כגון עקשנים ובסופו של דבר לתגובות סמים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...