Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
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Reconhecemos as plataformas de histologia de recherche de imagem e anipath (CRCL, CLB). Estamos em dívida com a farmácia do Hospital Centro Léon Bérard (CLB) pelo tipo presente do FOLFOX e FOLFIRI. Agradecemos também a Brigitte Manship pela leitura crítica do manuscrito. A obra contou com o apoio da FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) e do Inca (PLBIO19-289). A MVG e a LC receberam apoio da FRM e cf recebeu apoio da fundação ARC e do Centro Léon Bérard.

NOTA: Os detalhes de todos os reagentes e materiais estão listados na Tabela de Materiais.
1. Formação esferoide
<ol><li>Mídia de cultura esféide<ol>
<li>Prepare o meio basal composto pelo DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco, complementado com dipeptida l-alanyl-L-glutamina de 4 mM.</li>
		<li>Prepare o MDM MÉDIO completo contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) em meio basal a partir da...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

Modelos 3D in vitro superam as principais desvantagens experimentais das culturas de células cancerígenas 2D, pois parecem ser mais confiáveis na recapitulação de características tumorais típicas, incluindo microambiente e heterogeneidade celular. Modelos 3D comumente usados de esferoides são livres de andaimes (cultivados em condições de baixa fixação) ou baseados em andaimes (usando biomateriais para células de cultura). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, pois dependem da natureza do andaim...

O câncer colorretal (CRC) continua sendo a segunda principal causa de mortes associadas ao câncer no mundo1. O desenvolvimento do CRC é resultado de uma progressiva aquisição e acúmulo de mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas2,3, incluindo a ativação de oncogenes e a inativação dos genes supressores tumorais3,4. Além disso, fatores não genéticos (por exemplo, o microambiente) podem contribuir e promover a transformação oncogênica e, assim, participar da evolução dos CRCs5. É importante ressaltar que os CRCs são compostos por diferentes populações celulares, incluindo CSCs indiferenciados e células tumorais a granel exibindo alguns traços de diferenciação, que constituem uma estrutura hierárquica que lembra a organização do epitélio em uma cripta normal de cólon6,7.
Os CSCs são considerados responsáveis pela aparência do tumor8,sua manutenção e crescimento, capacidade metastática e resistência às terapias convencionais6,7. Dentro dos tumores, as células cancerígenas, incluindo os CSCs, apresentam um alto nível de heterogeneidade e complexidade em termos de seus distintos perfis mutacionais e epigenéticos, diferenças morfológicas e fenotípicas, expressão genética, metabolismo, taxas de proliferação e potencial metastático9. Portanto, para entender melhor a biologia do câncer, a progressão do tumor e a aquisição da resistência à terapia e sua tradução para tratamentos eficazes, modelos pré-clínicos humanos que capturam essa heterogeneidade e hierarquia do câncer são importantes10,11.
As linhas in vitro de células cancerígenas 2D têm sido usadas há muito tempo e fornecem insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor e os mecanismos subjacentes à eficácia das moléculas terapêuticas. No entanto, sua limitação em relação à falta da heterogeneidade fenotípica e genética encontrada nos tumores originais é agora amplamente reconhecida12. Além disso, nutrientes, oxigênio, gradientes de pH e o microambiente tumoral não são reproduzidos, sendo o microambiente especialmente importante para a manutenção de diferentes tipos celulares, incluindo CSCs11,12. Para superar essas principais desvantagens, vários modelos 3D foram desenvolvidos para abordar experimentalmente e reproduzir a complexidade e heterogeneidade dos cânceres. Com efeito, esses modelos recapitulam a heterogeneidade celular tumoral, interações células celulares e arquitetura espacial, semelhantes às observadas in vivo12,13,14. Os organoides tumorais primários estabelecidos a partir de tumores frescos, bem como esferoides derivados de linhas celulares, são em grande parte empregados15,16.
Esferoides podem ser cultivados de uma maneira livre de andaimes ou baseados em andaimes para forçar as células a se formarem e crescerem em agregados celulares. Os métodos livres de andaimes baseiam-se na cultura das células em condições não aderentes (por exemplo, o método de queda suspensa ou placas de fixação ultra-baixas), enquanto os modelos baseados em andaimes dependem de biomateriais naturais, sintéticos ou híbridos para células culturais12,13,14. Os esferoides à base de andaimes apresentam diferentes desvantagens, pois a formação final de esferoides dependerá da natureza e composição do (bio)material utilizado. Embora os métodos esferoides livres de andaimes disponíveis até agora não dependam da natureza do substrato, eles geram esferoides que variam em estrutura e tamanho17,18.
Este trabalho teve como objetivo projetar um robusto e reprodutível sistema de cultura 3D de esferoides, que são homogêneos em tamanho, composto por células de adenocarcinoma de cólon caco2 para estudar biologia CSC. As células caco2 são de particular interesse devido à sua capacidade de diferenciar ao longo do tempo19,20, sugerindo fortemente um potencial semelhante a uma haste. Assim, a cultura de longo prazo dos esferoides revelou a presença de diferentes populações de CSC com diferentes respostas à quimioterapia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Os cânceres colorretais são caracterizados pela heterogeneidade e uma organização hierárquica composta por uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência aos fármacos. Uma melhor compreensão das propriedades do CSC para seu direcionamento específico é, portanto, um pré-requisito para uma terapia eficaz. No entanto, há uma escassez de modelos pré-clínicos adequados para investigações aprofundadas. Embora as linhas de células cancerígenas in vitro bidimensionais (2D) forneçam insights valiosos sobre a biologia tumoral, elas não replicam a heterogeneidade fenotípica e genética do tumor. Em contraste, modelos tridimensionais (3D) abordam e reproduzem a complexidade do câncer quase fisiológico e a heterogeneidade celular. O objetivo deste trabalho foi projetar um sistema de cultura 3D robusto e reprodutível para estudar biologia CSC. A presente metodologia descreve o desenvolvimento e otimização das condições para a geração de esferoides 3D, que são homogêneos em tamanho, a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2, modelo que pode ser utilizado para a cultura de longo prazo. É importante ressaltar que, dentro dos esferoides, as células que se organizavam em torno de estruturas semelhantes ao lúmen, foram caracterizadas por padrões diferenciais de proliferação celular e pela presença de CSCs expressando um painel de marcadores. Esses resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação desta abordagem 3D para estudar heterogeneidade celular e biologia CSC, incluindo a resposta à quimioterapia.

Como a falta de homogeneidade no tamanho dos esferoides é uma das principais desvantagens dos sistemas de cultura 3D3D 13disponíveis atualmente, o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo confiável e reprodutível para obter spheroids homogêneos. Primeiro, para estabelecer condições ideais de trabalho, foram testados diferentes números de células Caco2, variando de 50 a 2.000 células por microwell/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabela ...

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Este novo método de culturas esferoides pode ser usado para estudar a tumorigenicidade para analisar a presença de diferentes populações de células-tronco cancerígenas e também pode ser bem aplicado através de tela de alta colocação para novas drogas. Trata-se de um sistema robusto e repetitivo para gerar um grande número de esferoides de tamanho homogêneo. Além disso, esses esferoides podem ser usados para estudar células-tronco cancerígenas.Este método é criado para estudar a biologia crônica do câncer, mas pode ser facilmente criado para estudar outros cânceres alterando as condições de cultura 3D. Certifique-se de observar bolhas no meio, para não mover muito a placa durante a formação de esferoides e ter cuidado ao colher os esferoides no coador. Comece por pré-tratar os poços de uma placa de 24 poços com 500 micro litros de Solução anti-adesão por poço.Depois de alguns segundos centrifugar a placa em rotor de balde balançando e enxaguar cada poço com 2 mililitros de meio basal quente. Observe a placa sob o microscópio para garantir que as bolhas tenham sido completamente removidas dos micro-poços. Se não forem observadas bolhas, enxágue os poços novamente antes de adicionar um mililitro de matriz de membrana de porão de DMEM quente meio para cada poço.Para induzir a formação de esferoides, consulte a concentração desejada de células Caco-2 em uma camada mono 2D em um prato de 10 centímetros em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1%antibióticos. Para a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umidificada. Quando uma confluência de 80%, lave as células com cinco mililitros de PBS antes de tratar a cultura com dois mililitros de Trypsin-EDTA por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Quando as células se separarem neutralizar a Trippsina com quatro mililitros de DMEM completos. Após a contagem, colete as células por centrifugação e resuspense a paleta no volume apropriado do meio de matriz de membrana de porão do DMEM para alcançar a concentração desejada das células em um mililitro de médio por poço. Adicione um mililitro de células a cada poço da placa pré-paga de 24 poços, seguido pela adição de um mililitro de matriz de membrana de porão DMEM médio para cada poço.Após a semeadura, centrifufique imediatamente a placa e use um microscópio leve para verificar se as células foram distribuídas uniformemente pelos micro poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 48 horas sem perturbar as células. Para colher os esferoides, no final da incubação, use uma pipeta sorológica e metade do supernazio em cada poço para desalojar suavemente os esferoides de seus micro poços.Quando todos os esferoides tiverem sido destacados use a pipeta para transferir cuidadosamente as culturas 3D de cada poço para um coador reversível de 37 mícrons em cima de um tubo cônico de 15 mililitros. Lave cada poço três vezes com um mililitro de meio basal pré-armado por lavagem para coletar quaisquer esferoides restantes e adicione estes esferoides adicionais ao coador. Após a última lavagem verifique a placa sob o microscópio para confirmar que todos os esferoides foram removidos dos micro poços.Em seguida, inverta o coador sobre um novo tubo de 15 mililitros e lave a parte inferior do coador com o meio de matriz de membrana de porão DMEM fresco para coletar os esferoides no tubo. Os spheróides estão subindo de 500 células demonstram o aumento mais homogêneo do tamanho ao longo do tempo. Com 500 e 600 células por esferoide determinam ser o número ideal de células sob as quais um bom crescimento e baixa variabilidade podem ser alcançados.A adição da matriz de membrana do porão aumenta o crescimento esferoide e a homogeneidade. Na cultura de longo prazo, as células aparecem como densas multi camadas no terceiro dia. Enquanto células achatadas dispostas em camadas mono são claramente visíveis no dia 10.Curiosamente, um lúmen aparece dentro dos esferoides a partir do quinto dia. Além disso, um claro aumento na proliferação de células nucleares células positivas células células positivas é observado nos dias cinco e sete que diminui até o dia 10. Surpreendentemente, o Caspace 3 ativado é observado em pouquíssimas células apenas nos dias três e cinco.Enquanto altos níveis de expressão beta-catenin são observados em todos os pontos de tempo. O potencial dos esferoides para se diferenciar em anterosites é evidenciado por sua expressão alkalina fosfattase e séute carrier 2A5 mRNA. Além disso, esses esferoides expressam marcadores típicos de células-tronco do câncer e respondem a tratamentos de quimioterapia combinados rotineiramente administrados a pacientes com câncer colorretal.Então os esferoides são compostos de diferentes populações celulares. Eles então podem ser bem usados para analisar respostas específicas das células a estímulos como refratários e, eventualmente, para respostas de medicamentos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Pesquisa do câncer

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

O Colon-26 Carcinoma Tumor-rolamento Mouse como um modelo para o estudo do câncer caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...