Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
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Reconocemos las plataformas de la histología de la proyección de imagen y del recherche del anípata (CRCL, CLB). Estamos en deuda con la farmacia del Hospital Centre Léon Bérard (CLB) por el amable regalo de FOLFOX y FOLFIRI. También agradecemos a Brigitte Manship por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue apoyado por el FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) y por el Inca (PLBIO19-289). MVG y LC recibieron apoyo del FRM y CF recibieron apoyo de la fundación ARC y del Centre Léon Bérard.

NOTA: Los detalles de todos los reactivos y materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Formación de esferoides
<ol><li>Medios de cultivo esferoide<ol>
<li>Prepare el medio básico que consiste en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el dipéptido de la L-alanil-L-glutamina de 4 milímetros.</li>
		<li>Preparar el medio completo DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep) en m...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

Los modelos 3D in vitro superan los principales inconvenientes experimentales de los cultivos celulares de cáncer 2D, ya que parecen ser más confiables para recapitular las características tumorales típicas, incluido el microambiente y la heterogeneidad celular. Los modelos 3D de esferoides comúnmente utilizados son libres de andamios (cultivados en condiciones de baja unión) o basados en andamios (utilizando biomateriales para cultivar células). Estos métodos presentan diferentes desventajas ya que dependen de l...

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muertes asociadas al cáncer en el mundo1. El desarrollo de la CCR es el resultado de una progresiva adquisición y acumulación de mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas2,3,incluyendo la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales3,4. Además, los factores no genéticos (por ejemplo, el microambiente) pueden contribuir y promover la transformación oncogénica y, por lo tanto, participar en la evolución de los CCR5. Es importante destacar que los CRCs están compuestos por diferentes poblaciones celulares, incluyendo CSCs indiferenciados y células tumorales a granel que muestran algunos rasgos de diferenciación, que constituyen una estructura jerárquica que recuerda a la organización del epitelio en una cripta normal del colon6,7.
Se considera que las CSCs son responsables de la aparición del tumor8,su mantenimiento y crecimiento, capacidad metastásica y resistencia a las terapias convencionales6,7. Dentro de los tumores, las células cancerosas, incluidas las CSCs, muestran un alto nivel de heterogeneidad y complejidad en términos de sus distintos perfiles mutacionales y epigenéticos, diferencias morfológicas y fenotípicas, expresión génica, metabolismo, tasas de proliferación y potencial metastásico9. Por lo tanto, para comprender mejor la biología del cáncer, la progresión tumoral y la adquisición de resistencia a la terapia y su traducción en tratamientos efectivos, los modelos preclínicos humanos que capturan esta heterogeneidad y jerarquía del cáncer son importantes10,11.
Las variedades de células ines vitro del cáncer 2D se han utilizado durante mucho tiempo y proporcionan penetraciones valiosas en el desarrollo del tumor y los mecanismos que son la base de la eficacia de moléculas terapéuticas. Sin embargo, su limitación con respecto a la falta de heterogeneidad fenotípica y genética encontrada en los tumores originales es ahora ampliamente reconocida12. Por otra parte, los nutrientes, el oxígeno, los gradientes de pH y el microambiente tumoral no se reproducen, siendo el microambiente especialmente importante para el mantenimiento de diferentes tipos celulares, incluidas las CSCs11,12. Para superar estos principales inconvenientes, se han desarrollado varios modelos 3D para abordar y reproducir experimentalmente la complejidad y heterogeneidad de los cánceres. En efecto, estos modelos recapitulan la heterogeneidad celular tumoral, las interacciones célula-célula y la arquitectura espacial, similares a las observadas in vivo12,13,14. Los organoides tumorales primarios establecidos a partir de tumores frescos, así como los esferoides derivados de líneas celulares, se emplean en gran medida15,16.
Los esferoides se pueden cultivar de una manera libre de andamios o basada en andamios para forzar a las células a formarse y crecer en agregados celulares. Los métodos libres de andamios se basan en el cultivo de células en condiciones no adherentes (por ejemplo, el método de colgar y soltar o placas de fijación ultrabajos), mientras que los modelos basados en andamios se basan en biomateriales naturales, sintéticos o híbridos para cultivar células12,13,14. Los esferoides basados en andamios presentan diferentes desventajas, ya que la formación final del esferoide dependerá de la naturaleza y composición del (bio)material utilizado. Aunque los métodos de esferoides sin andamios disponibles hasta ahora no se basan en la naturaleza del sustrato, generan esferoides que varían en estructura y tamaño17,18.
Este trabajo tuvo como objetivo diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible de esferoides, de tamaño homogéneo, compuesto por células de adenocarcinoma de colon Caco2 para estudiar la biología csc. Las células Caco2 son de particular interés debido a su capacidad para diferenciarse con el tiempo19,20,lo que sugiere fuertemente un potencial similar al tallo. Por consiguiente, la cultura de largo plazo de los esferoides reveló la presencia de diversas poblaciones del CSC con diversas respuestas a la quimioterapia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Los cánceres colorrectales son caracterizados por heterogeneidad y una organización jerárquica que comprende una población de las células madres del cáncer (CSCs) responsables del desarrollo, del mantenimiento, y de la resistencia del tumor a las drogas. Una mejor comprensión de las propiedades de CSC para su orientación específica es, por lo tanto, un requisito previo para la terapia efectiva. Sin embargo, hay una escasez de modelos preclínicos adecuados para investigaciones en profundidad. Aunque las variedades de células bidimensionales ines vitro (2D) del cáncer proporcionen penetraciones valiosas en biología del tumor, no replican la heterogeneidad fenotípica y genética del tumor. Por el contrario, los modelos tridimensionales (3D) abordan y reproducen la complejidad casi fisiológica del cáncer y la heterogeneidad celular. El objetivo de este trabajo fue diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible para estudiar la biología csc. La presente metodología describe el desarrollo y optimización de condiciones para generar esferoides 3D, de tamaño homogéneo, a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2, un modelo que puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo. Importantemente, dentro de los esferoides, las células que fueron organizadas alrededor lumen-como las estructuras, fueron caracterizadas por los patrones diferenciados de la proliferación de célula y por la presencia de CSCs que expresaban un panel de marcadores. Estos resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque 3D para estudiar la heterogeneidad celular y la biología csc, incluyendo la respuesta a la quimioterapia.

Dado que la falta de homogeneidad en el tamaño de los esferoides es uno de los principales inconvenientes de los sistemas de cultivo de esferoides 3D actualmente disponibles13,el objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo fiable y reproducible para obtener esferoides homogéneos. En primer lugar, para establecer las condiciones de trabajo ideales, se probaron diferentes números de células Caco2, que oscilaban entre 50 y 2.000 células por micropocillo/...

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Este nuevo método de culturas esferoides se puede utilizar para estudiar el tumorigenicity para analizar la presencia de diversas poblaciones de células madres del cáncer y también se puede aplicar muy bien a para a través de la pantalla del alto put para las nuevas drogas. Este es un sistema cultivado robusto y repetitivo para generar un gran número de esferoides de tamaño homogéneo. Además, estos esferoides se pueden utilizar para estudiar las células madre cancerosas.Este método está configurado para estudiar la biología del cáncer crónico, pero se puede configurar fácilmente para estudiar otros tipos de cáncer cambiando las condiciones del cultivo 3D. Asegúrese de estar atento a las burbujas en el medio, para no mover demasiado la placa durante la formación de esferoides y tener cuidado al cosechar los esferoides en el colador. Comience por pre-tratar los pozos de una placa de 24 pozos con 500 micro litros de solución de enjuague antia adherencia por pozo.Después de unos segundos centrífuga la placa en rotor de cubo oscilante y enjuague cada pozo con 2 mililitros de medio basal caliente. Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que las burbujas se han eliminado por completo de los micro pozos. Si no se observan burbujas, enjuague los pozos de nuevo antes de agregar un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM caliente a cada pozo.Para inducir la formación de esferoides, ver la concentración deseada de células Caco-2 en una monocapa 2D en un plato de 10 centímetros en DMEM complementado con 10%FBS y 1%antibióticos. Para el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera humidificada. Cuando se alcance una confluencia del 80%, lave las células con cinco mililitros de PBS antes de tratar el cultivo con dos mililitros de Tripsina-EDTA durante dos a cinco minutos a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.Cuando las células se han desprendido neutralizar la tripsina con cuatro mililitros de DMEM completo. Después de contar, recoger las células por centrifugación y resuspend la paleta en el volumen apropiado de dmem sótano de la matriz de la matriz para lograr la concentración deseada de células en un mililitro de medio por pozo. Agregue un mililitro de células a cada pozo de la placa de 24 pozos prepagada, seguido de la adición de un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM a cada pozo.Después de la siembra, centrifugue inmediatamente la placa y use un microscopio de luz para verificar que las células se hayan distribuido uniformemente a través de los micro pozos. Luego coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas sin perturbar las células. Para cosechar los esferoides, al final de la incubación, utilice una pipeta serológica y la mitad del sobrenadante en cada pozo para desalojar suavemente los esferoides de sus micro pozos.Cuando todos los esferoides se han separado, use la pipeta para transferir cuidadosamente los cultivos 3D de cada pozo a un colador reversible de 37 micras en la parte superior de un tubo cónico de 15 mililitros. Lave cada pozo tres veces con un mililitro de medio basal precalñado por lavado para recolectar los esferoides restantes y agregue estos esferoides adicionales al colador. Después del último lavado, revise la placa bajo el microscopio para confirmar que todos los esferoides se han eliminado de los micro pozos.Luego invierta el colador sobre un nuevo tubo de 15 mililitros y lave la parte inferior del colador con un medio fresco de matriz de membrana basal DMEM para recoger los esferoides en el tubo. Los esferoides están aumentando de 500 células demuestran el aumento más homogéneo en tamaño en un en un plazo. Con 500 y 600 células por esferoide determinar que es el número óptimo de células bajo las cuales se puede lograr un buen crecimiento y baja variabilidad.La adición de la matriz de la membrana del sótano aumenta crecimiento y homogeneidad del esferoide. En cultivo a largo plazo, las células aparecen como densas capas múltiples en el tercer día. Mientras que las células aplanadas dispuestas en mono capas son claramente visibles en el día 10.Curiosamente, un lumen aparece dentro de los esferoides desde el quinto día en adelante. Además, un aumento claro en células positivas del antígeno nuclear de la célula de la proliferación se observa en los días cinco y siete que disminuye por el día 10. Sorprendentemente, caspace activado 3 se observa en muy pocas células en los días tres y cinco solamente.Mientras que los altos niveles de expresión de beta-catenina se observan en cada punto de tiempo. El potencial de los esferoides para diferenciarse en anterositas es evidenciado por su fosfatasa alcalina y expresión de la familia de portadores de soluto 2A5 mRNA. Además, estos esferoides expresan marcadores típicos de células madre cancerosas y responden a los tratamientos de quimioterapia combinada administrados rutinariamente a pacientes con cáncer colorrectal.Así que los esferoides están compuestos de diferentes poblaciones celulares. Entonces se pueden utilizar muy bien para analizar las respuestas específicas de la célula a los estímulos tales como refractores y eventual para las respuestas de la droga.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Un método para definir los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad de microbioma de Colon en un modelo de Tumor de Colon murino

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...