Name: a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

Görüntüleme ve Anipath recherche histoloji platformlarını (CRCL, CLB) kabul ediyoruz. FOLFOX ve FOLFIRI'nin nazik hediyesi için Centre Léon Bérard (CLB) Hastanesi eczanesine borçluyuz. Ayrıca brigitte manship'e makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ve Inca (PLBIO19-289) tarafından desteklendi. MVG ve LC FRM'den, CF ise ARC vakfından ve Centre Léon Bérard'dan destek aldı.

NOT: Tüm reaktiflerin ve malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
1. Küresel oluşum
<ol><li>Küresel kültür ortamı<ol>
<li>4 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) içeren bazal ortam hazırlayın.</li>
		<li>Adım 1.1.1'den itibaren bazal ortamda %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisidin (Pen/Strep) içeren DMEM komple ortamını hazırlayın.</li>
		<li>Adım 1.1.1'den itibaren...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis.">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61 (5), 759-767 (1990).</li><li>Rao, C. V., Yamada, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+and+colon+carcinogenesis:+from+the+perspective+of+genes.">Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes.</a> Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).</li><li>Tran, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Ketoglutarate+attenuates+Wnt+signaling+and+drives+differentiation+in+colorectal+cancer.">&#945;-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer.</a> Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell:+premises,+promises+and+challenges.">The cancer stem cell: premises, promises and challenges.</a> Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+organoid+model+systems+in+cancer+research.">Xenograft and organoid model systems in cancer research.</a> The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).</li><li>Kawai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+mimic+colon+cancer+heterogeneity+induced+by+different+microenvironments.">Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).</li><li>Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+spherically+structured+3D+in+vitro+tumor+models+-Advances+and+prospects.">Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects.</a> Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+cancer+models+in+tumor+biology.">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer.">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li><li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity,+villin+expression,+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells:+A+survey+of+twenty+cell+lines.">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li><li>Caro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+newly+isolated+Caco-2+clone+(TC-7),+as+a+model+of+transport+processes+and+biotransformation+of+drugs.">Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).</li><li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWellTM+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+systemic+therapies+for+locally+advanced+and+metastatic+rectal+cancer.">Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).</li><li>Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irinotecan,+a+key+chemotherapeutic+drug+for+metastatic+colorectal+cancer.">Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).</li><li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFOX/FOLFIRI+pharmacogenetics:+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy.">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li><li>Jordan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+dual+mTORC1/2+mTOR+kinase+inhibitor+AZD8055+on+acquired+endocrine+resistance+in+breast+cancer+in+vitro.">Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro.</a> Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).</li><li>Mohr, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell+control+of+embryoid+body+size+in+order+to+regulate+cardiac+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Nusse, R., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+signaling,+disease,+and+emerging+therapeutic+modalities.">Wnt/&#946;-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities.</a> Cell. 169 (6), 985-999 (2017).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Vermeulen, L., Snippert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+homeostasis+and+cancer+of+the+intestine.">Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).</li><li>van der Heijden, M., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+homeostasis+and+cancer+of+the+gut.">Stem cells in homeostasis and cancer of the gut.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).</li><li>Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+adult+stem+cell+populations+of+rapidly+self-renewing+organs.">Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>Potten, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+intestinal+stem+cell+and+early+lineage+marker;+musashi-1.">Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1.</a> Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+crypt,+a+prototype+stem+cell+compartment.">The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.</a> Cell. 154 (2), 274-284 (2013).</li><li>Clark, D. W., Palle, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer+stem+cells:+potential+as+therapeutic+targets.">Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).</li><li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li><li>Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+3D+culture+systems+of+various+complexity+for+treatment+optimization+of+colorectal+carcinoma.">Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).</li><li>Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+new+mechanisms+and+models+of+cancer+stem+cell+multidrug+resistance.">Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).</li><li>Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity:+The+Rosetta+Stone+of+therapy+resistance.">Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance.</a> Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).</li></ol>

In vitro 3D modeller, mikroçevrim ve hücre heterojenliği de dahil olmak üzere tipik tümöral özelliklerin yeniden kapsüllenmesinde daha güvenilir göründükleri için 2D kanser hücre kültürlerinin ana deneysel dezavantajlarının üstesinden gelmektedir. Yaygın olarak kullanılan 3D küresel modeller iskelesizdir (düşük ek koşullarında kültürlenir) veya iskele bazlıdır (kültür hücrelerine biyomalzemeler kullanılarak). Bu yöntemler, kullanılan iskelenin doğasına bağlı oldukları veya yapı ...

Kolorektal kanser (CRC) dünyada kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1. CRC'nin gelişimi, onkogenlerin aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu da dahil olmak üzere genetik mutasyonların ve / veya epigenetik değişikliklerin2,3,4'ünilerleyici bir edinimi ve birikmesinin sonucudur. Ayrıca, genetik olmayan faktörler (örneğin, mikroçevrim) onkojenik dönüşüme katkıda bulunabilir ve teşvik edebilir ve böylece CRC'lerin evrimine katılabilir5. Daha da önemlisi, CRC'ler, normal bir kolon mahzeninde epitelin organizasyonunu anımsatan hiyerarşik bir yapı oluşturan bazı farklılaşma özelliklerini gösteren farklı KSS'ler ve dökme tümör hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarından oluşur6,7.
CSC'lerin tümör görünümü8, bakımı ve büyümesi, metastatik kapasitesi ve konvansiyonel tedavilere karşı direnci6,7'densorumlu olduğu düşünülmektedir. Tümörlerde, CSC'ler de dahil olmak üzere kanser hücreleri, belirgin mutasyonel ve epigenetik profilleri, morfolojik ve fenotipik farklılıkları, gen ekspresyasyonu, metabolizma, çoğalma oranları ve metastatik potansiyel açısından yüksek düzeyde heterojenlik ve karmaşıklık gösterir9. Bu nedenle, kanser biyolojisini, tümörün ilerlemesini ve tedaviye karşı direncin kazanılmasını ve etkili tedavilere çevrildiğini daha iyi anlamak için, bu kanser heterojenliğini ve hiyerarşisini yakalayan insan preklinik modelleri önemlidir10,11.
In vitro 2D kanser hücre hatları uzun süredir kullanılmaktadır ve tümör gelişimi ve terapötik moleküllerin etkinliğinin altında yer alan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. Bununla birlikte, orijinal tümörlerde bulunan fenotipik ve genetik heterojenliğin eksikliği ile ilgili sınırlamaları artık yaygın olarak tanınmaktadır12. Ayrıca, besinler, oksijen, pH gradyanları ve tümör mikroçevrimi çoğaltılmamıştır, mikroçevrim özellikle CSC11,12dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin bakımı için önemlidir. Bu ana dezavantajların üstesinden gelmek için, kanserlerin karmaşıklığını ve heterojenliğini deneysel olarak ele almak ve çoğaltmak için birkaç 3D model geliştirilmiştir. Aslında, bu modeller vivo12 , 13,14'tegözlemlenenlere benzer şekilde tümör hücresel heterojenliği, hücre-hücre etkileşimlerini ve mekansal mimariyi rekapitulate eder. Taze tümörlerden kurulan primer tümör organoidleri ve hücre hattı kaynaklı küreseloidler büyük ölçüde 15,16'dır.
Küreseller, hücreleri hücre agregalarında oluşmaya ve büyümeye zorlamak için iskelesiz veya iskele tabanlı bir şekilde kültürlenebilir. İskelesiz yöntemler, yapışmayan koşullar altında hücrelerin kültürüne (örneğin, asma-bırakma yöntemi veya ultra düşük bağlanma plakaları) dayandırılırken, iskele bazlı modeller kültür hücrelerine doğal, sentetik veya hibrit biyomalzemelere dayanır12,13,14. İskele bazlı sferoidler, son küresel oluşum kullanılan (biyo)malzemenin doğasına ve bileşimine bağlı olacağından farklı dezavantajlar sunar. Şimdiye kadar mevcut olan iskelesiz küresel yöntemler substratın doğasına dayanmasa da, yapı ve boyut olarak değişen küreseller üretirler17,18.
Bu çalışma, CSC biyolojisini incelemek için Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden oluşan homojen boyutta olan sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamayı amaçladı. Caco2 hücreleri, zaman içinde farklılaşma kapasiteleri nedeniyle özellikle ilgi çekicidir19,20, güçlü bir şekilde kök benzeri bir potansiyel önermektedir. Buna göre, küresellerin uzun süreli kültürü, kemoterapiye farklı yanıtlarla farklı CSC popülasyonlarının varlığını ortaya koydu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, Large&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27250</td>
			<td>To be used with 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 400 24-well plates</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Caspase3 - Rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td>
			<td>eBioscience/Thermo Fisher</td>
			<td>14-9896-82</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-133-82</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 -Rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157107</td>
			<td>dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA - Mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0879</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-catenin - Mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7963</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black multiwell plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>237108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar apparatus&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10037</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogel mounting medium with DAPI</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-DT094B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11077</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Spheroid image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan&#160;</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript reverse transcriptase&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucovorin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA XS Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902 .250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Gift from Pharmacy CLB</td>
			<td>-</td>
			<td>stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR420B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX- Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05&#160;%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Axiovert microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope for acquiring images of spheroids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional model of spheroids to study colon cancer stem cells

Kolorektal kanserler heterojenlik ve tümör gelişimi, bakımı ve ilaçlara karşı dirençlerden sorumlu kanser kök hücre (CSC) popülasyonu içeren hiyerarşik bir organizasyon ile karakterizedir. Bu nedenle, CSC özelliklerinin spesifik hedeflemeleri için daha iyi anlaşılması, etkili tedavi için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, derinlemesine incelemeler için uygun preklinik modellerin azlığı vardır. In vitro iki boyutlu (2D) kanser hücre hatları tümör biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlasa da fenotipik ve genetik tümör heterojenliğini çoğaltmaz. Buna karşılık, üç boyutlu (3D) modeller fizyolojik kanser karmaşıklığına ve hücre heterojenliğine hitap ediyor ve yeniden üretiyor. Bu çalışmanın amacı, CSC biyolojisini incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamaktı. Mevcut metodoloji, uzun süreli kültür için kullanılabilecek bir model olan Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden homojen boyutta olan 3D küreseller üretmek için koşulların gelişimini ve optimizasyonunu açıklar. Daha da önemlisi, sferoidler içinde, lümen benzeri yapılar etrafında örgütlenen hücreler, diferansiyel hücre çoğalma paternleri ve bir işaret panelini ifade eden CSC'lerin varlığı ile karakterize edildi. Bu sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere hücre heterojenliğini ve CSC biyolojisini incelemek için bu 3D yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Sferoidlerin boyutunda homojenlik eksikliği şu anda mevcut olan 3D küresel kültür sistemlerinin ana dezavantajlarından biri olduğundan13, bu çalışmanın amacı homojen sferoidler elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktı. İlk olarak, ideal çalışma koşullarını belirlemek için, özel plakalar kullanılarak mikrowell / küresel başına 50 ila 2.000 hücre arasında değişen farklı sayıda Caco2 hücresi test edilmi...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells at JoVE.com

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Bu yeni küresel kültürler yöntemi, farklı kanser kök hücrelerinin popülasyonlarının varlığını analiz etmek için tümörojenliği incelemek için kullanılabilir ve ayrıca yeni ilaçlar için yüksek put ekranı aracılığıyla güzel bir şekilde uygulanabilir. Bu, çok sayıda homojen boyutlu küreseloid üretmek için sağlam ve tekrarlayan bir kültürlü sistemdir. Ayrıca, bu sferoidler kanserli kök hücreleri incelemek için kullanılabilir.Bu yöntem kronik kanser biyolojisini incelemek için ayarlanmıştır, ancak 3D kültür koşullarını değiştirerek diğer kanserleri incelemek için kolayca ayarlanabilir. Ortamdaki kabarcıklara dikkat ettiğinizden, küresel oluşum sırasında plakayı çok fazla hareket ettirmediğinizden ve küreselleri süzgeçe toplarken dikkatli olduğunuzdan emin olun. Kuyu başına 500 mikro litre Yapışma Önleyici Durulama Çözeltisi ile 24 kuyu plakasının kuyularını önceden tedavi ederek başlayın.Birkaç saniye sonra plakayı sallanan kova rotorunda santrifüj edin ve her birini 2 mililitre sıcak Bazal ortamla durulayın. Kabarcıkların mikro kuyulardan tamamen çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Kabarcıklar gözlenmezse, her kuyuya bir mililitre sıcak DMEM bodrum membran matrisi ortamı eklemeden önce kuyuları tekrar durulayın.Küresel oluşumu teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS ve %1 antibiyotik ile desteklenmiş 10 santimetrelik bir tabakta 2D mono tabaka içinde istenen Caco-2 hücrelerinin konsantrasyonunu görün. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültür için. % 80 izdiah ulaştığında, kültürü iki mililitre Tripsin-EDTA ile tedavi etmeden önce hücreleri beş mililitre PBS ile 37 santigrat derecede iki ila beş dakika yıkayın ve% 5 karbondioksit.Hücreler ayrıldığında, Trypsin'i dört mililitre tam DMEM ile nötralize eder. Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve paleti DMEM bodrum membran matrisi ortamının uygun hacminde yeniden biriktirerek kuyu başına bir mililitre orta hücre konsantrasyonunu elde edin. Ön ödemeli 24 kuyu plakasının her kuyusuna bir mililitre hücre ekleyin, ardından her kuyuya bir mililitre DMEM bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.Tohumlamadan sonra, plakayı hemen santrifüjlayın ve hücrelerin mikro kuyulara eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için hafif bir mikroskop kullanın. Daha sonra plakayı hücreleri rahatsız etmeden 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Küreselleri hasat etmek için, inkübasyonun sonunda, sferoidleri mikro kuyularından hafifçe çıkarmak için her kuyuda serolojik bir pipet ve süpernatantın yarısını kullanın.Tüm küreseller ayrıldığında, pipeti kullanarak 3D kültürleri her kuyudan 15 mililitrelik konik tüpün üstündeki 37 mikron ters çevrilebilir süzgeçe dikkatlice aktarın. Kalan küreselleri toplamak için yıkama başına bir mililitre önceden uyarılmış Bazal ortam ile her kuyuyu üç kez yıkayın ve bu ek sferoidleri süzgeçe ekleyin. Son yıkamadan sonra, tüm küresellerin mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı kontrol edin.Daha sonra süzgeci yeni bir 15 mililitrelik tüp üzerinde ters çevirin ve sferoidleri tüpe toplamak için süzgecin altını taze DMEM bodrum membran matrisi ortamı ile yıkayın. 500 hücreden yükselen küreseller zaman içinde en homojen boyut artışını göstermektedir. Küresel başına 500 ve 600 hücre ile iyi büyüme ve düşük değişkenlik elde edilebilirlik elde edilebilir hücre en uygun sayıda olduğunu belirleyin.Bodrum membran matrisinin eklenmesi küresel büyümeyi ve homojenliği arttırır. Uzun vadeli kültürde, hücreler üçüncü günde yoğun çok katmanlı olarak görünür. Tek katmanlı olarak düzenlenmiş düzleştirilmiş hücreler 10.İlginçtir ki, beşinci günden itibaren küresellerde bir lümen beliriyor. Buna ek olarak, çoğalan hücre nükleer antijen pozitif hücrelerinde 10. Şaşırtıcı bir şekilde, aktif Caspace 3 sadece üç ve beş günlerinde çok az hücrede gözlenir.Her zaman noktasında yüksek düzeyde Beta-catenin ekspresyolü gözlenirken. Küresellerin Anterositlere farklılaşma potansiyeli, Alkali Fosfataz ve çözünen taşıyıcı ailesi 2A5 mRNA ekspresyosu ile kanıtlanır. Ek olarak, bu küreseller tipik kanser kök hücre belirteçlerini ifade eder ve kolorektal kanser hastalarına rutin olarak uygulanan kombinasyon kemoterapi tedavilerine yanıt verir.Yani küreseller farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Daha sonra refrakterler gibi uyaranlara verilen hücre spesifik yanıtlarını analiz etmek ve sonunda ilaç yanıtları için güzel bir şekilde kullanılabilirler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...